程連臣,王昊,徐川,梁慧英,房凱

(臨汾市第四人民醫(yī)院 麻醉科，山西 廊坊 041000)

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Notch1對局灶性腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡的影響

程連臣,王昊,徐川,梁慧英,房凱

(臨汾市第四人民醫(yī)院 麻醉科，山西 廊坊 041000)

目的 研究Notch1對腦局灶性缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡的影響，為缺血性腦血管病臨床治療尋找新的靶點。 方法 72只SD雄性成年大鼠隨機分為等量4組：假手術(shù)組(Sham組)，缺血再灌組(I/R組)，Notch1抑制劑組(DAPT組)，溶劑對照組(Vehicle組)。采用線栓法大腦中動脈阻塞(MCAO)模型制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，缺血90 min為標準。Sham組僅分離血管，不插入線栓，Notch1抑制劑組或Vehicle組在模型建立再灌注恢復(fù)后立即向缺血對側(cè)側(cè)腦室分別注射DAPT或單純?nèi)軇?PBS+DMSO)，每天1次，分別于術(shù)后1、3、7 d斷頭取腦，病理學(xué)觀察缺血再灌注側(cè)皮層損傷情況，TUNEL法檢測神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)(AI)，Weatern blot檢測PARP裂解片段含量、Notch1活性片段NICD、Akt和Bad磷酸化水平。 結(jié)果 與Sham組相比，I/R組神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)及PARP裂解片段含量增加，NICD、磷酸化Akt及Bad水平升高，差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與I/R組相比，給予Notch1抑制劑DAPT后，神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)及PARP裂解片段含量明顯增加，NICD、磷酸化Akt及Bad水平明顯下降，差異有顯著性(P<0.05)，而溶劑對照Vehicle組的各項指標無明顯差異。 結(jié)論 Notch1在腦缺血再灌注損傷中具有抑制神經(jīng)細胞凋亡作用，其作用機制可能與增強Akt磷酸化水平，促進Bad失活有關(guān)。

缺血再灌注損傷；Notch1；神經(jīng)細胞；凋亡

Notch 信號通路在細胞分化、增殖、存活和發(fā)育中起重要作用，Notch 信號通路還參與免疫炎癥反應(yīng)，在各種炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[1]。Notch 1參與了一些神經(jīng)變性疾病的發(fā)病過程，如缺血性卒中。確定Notch1 信號對腦缺血再灌注后神經(jīng)凋亡的影響及其機制，對今后腦缺血再灌注損傷的基礎(chǔ)研究和臨床治療有著重大幫助。但是，目前缺乏Notch1 參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞凋亡的直接證據(jù)且機制不明[2]。本研究通過制作SD 大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)模型，模擬臨床缺血性腦卒中病人，同時采用γ-分泌酶抑制劑(DAPT)抑制Notch1 信號通路，研究Notch1信號通路變化在腦局灶性缺血再灌注損傷后對神經(jīng)細胞凋亡的影響，并嘗試闡述其作用機制，進而為ICVD 的臨床進一步治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：72只雄性SD(Sprague Dawley)近交大鼠，由武漢大學(xué)動物實驗中心提供(周齡8～9 周，體質(zhì)量250～280 g，健康，清潔級，許可證號2003-0004。)

1.1.2 主要試劑：丙烯酰胺/N 美國Sigma 公司；N-亞甲叉雙丙烯酰胺(Arc/Bis) 美國Sigma 公司；四甲基乙二胺(TEMED) 美國Sigma 公司；十二烷基磺酸鈉(SDS) 美國Sigma 公司；甘氨酸(Glycine) 美國Sigma 公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris) 美國Sigma 公司；PMSF 美國Sigma 公司；四甲基偶氮唑藍(MTT) 美國Sigma 公司；多聚甲醛 美國Sigma 公司；DMSO 美國Sigma 公司；過硫酸銨(AP) 美國Amresco 公司。

1.2 方法 72只SD雄性成年大鼠隨機均分為4組：假手術(shù)組(Sham組)，缺血再灌組(I/R組)，Notch1抑制劑組(DAPT組)，溶劑對照組(Vehicle組)。采用線栓法大腦中動脈阻塞(MCAO)模型制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，缺血90 min為標準。腦缺血預(yù)處理模型的制作：采用腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg / kg麻醉固定大鼠，行頸部正中切口，分離暴露出右頸總動脈及其分支頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎并切斷頸外動脈。在頸外動脈殘端剪一小口，將直徑0.20～0.25 mm尼龍線自頸外動脈插入經(jīng)右頸總動脈導(dǎo)入頸內(nèi)動脈緩慢入顱，通過右頸總動脈分叉處約(18.5±10.5) mm，當感到有明顯阻力時停止，栓塞右大腦中動脈20 min拉出尼龍線至頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈殘端，使血流再灌注。術(shù)后動物保溫(20～24 ℃)喂養(yǎng)24 h。Sham組僅分離血管，不插入線栓，Notch1抑制劑組或Vehicle組在模型建立再灌注恢復(fù)后立即向缺血對側(cè)側(cè)腦室分別注射DAPT或單純?nèi)軇?PBS+DMSO)，缺血再灌組(I/R組)是模型成功后再灌注，不注射DAPT或單純?nèi)軇?PBS+DMSO)，每天1次，分別于術(shù)后1、3、7 d斷頭取腦，

病理學(xué)觀察缺血再灌注側(cè)皮層損傷情況，按常規(guī)方法制備標本,固定、切片、觀察。

TUNEL法檢測神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)(AI)：標本預(yù)處理，從組織分離的細胞的預(yù)處理，在載玻片上滴加 50～100 μL細胞懸液并使之干燥。用PBS洗2次，每次5 min；色缸中加入含2%過氧化氫的PBS，于室溫反應(yīng)5 min。用PBS洗2次，每次5 min；用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液，置室溫1～5 min；用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加 54 μL TdT酶反應(yīng)液，置濕盒中于37 ℃反應(yīng) 1h(注意：陰性染色對照，加不含TdT酶的反應(yīng)液)；將切片置于染色缸中，加入已預(yù)熱到37 ℃的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液，于37 ℃保溫30 min，每10 min將載玻片輕輕提起和放下1次，使液體輕微攪動；組織切片用PBS洗3次，每次 5 min后，直接在切片上滴加2滴過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應(yīng)30 min；用PBS洗4次，每次5 min；在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05%DAB溶液，室溫顯色3～6 min；用蒸餾水洗4次，前3次每次1 min，最后1次5 min；于室溫用甲基綠進行復(fù)染10 min。用蒸餾水洗3次，前2次將載玻片提起放下10次，最后1次靜置30s。依同樣方法再用100%正丁醇洗3次；用二甲苯脫水3次，每次2 min，封片、干燥后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄實驗結(jié)果。

Western blot檢測PARP裂解片段含量、Notch1活性片段NICD、Akt和Bad蛋白表達及磷酸化水平：用全蛋白抽提試劑1 mL(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。變性后取40 μg經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，室溫封閉1 h，加入兔抗鼠(Abcam公司，美ITI)Notchl NICD多克隆抗體(1:400 ) , 4 ℃封閉過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1:200 Santa Cruz公司)，室溫孵育1 h后ECL顯影，X光片暗室中感光，圖像分析系統(tǒng)進行掃描并記錄光密度強度。以β-actin為內(nèi)參照，以相對灰度值進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 腦缺血再灌損傷后Notch1活性 Sham組Notch1活性片段NICD水平較低，條帶染色淺，提示Notch1存在于正常腦組織中。腦缺血再灌后各時間點Notch1活性片段NICD水平均高于Sham組(P<0.05)，各點相比，NICD在缺血再灌后1 d已經(jīng)升高，3 d達高峰，7 d回落，但較Sham組相比仍較高(P<0.05)，提示缺血再灌注損傷Notch1 活性增強。見圖1。

2.2 腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡且與Notch1活性關(guān)系

2.2.1 缺血再灌注損傷后腦組織出現(xiàn)明顯病理學(xué)損害：HE染色顯示，Sham組細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)無明顯異常，細胞沿軸突整齊排列，細胞質(zhì)、細胞核結(jié)構(gòu)清晰。I/R組隨著再灌注時間的延長出現(xiàn)不同程度細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)異常，胞體和胞核固縮，深染，核仁不清楚，甚至出現(xiàn)神經(jīng)細胞核破裂。尼氏染色可見明顯白色梗死灶，存活神經(jīng)細胞(鏡下藍染者)數(shù)量減少。見圖2。

圖2 大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷7 d后HE 及尼氏染色A和C分別是10×4 HE染色和尼氏染色，□為缺血半暗帶區(qū)，后續(xù)圖像均于此區(qū)域拍攝采集；B和D分別是缺血半暗帶區(qū)10×40 HE染色和尼氏染色Fig.2 The HE and Nissl staining of focal cerebral ischemia reperfusion injury after 7 daysA and C were 10×4 HE staining and Nissl staining,represented the ischemic penumbra, follow-up images were taken in this area acquisition; B and D were respectively the ischemic penumbra area of 10×40 HE staining and Nissl staining

2.2.2 腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)升高：Sham組有少量散在TUNEL染色陽性的凋亡神經(jīng)細胞，提示正常組織生理活動中神經(jīng)細胞也發(fā)生凋亡。與Sham組對比，I/R組在缺血再灌注1 d后TUNEL陽性細胞數(shù)開始升高，在3 d達到頂峰，隨后下降。計算凋亡指數(shù)AI(Sham組 0.14，I/R組0.36)，表明缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡增加。核染呈棕黃色為陽性的凋亡細胞(見圖3。)

圖3 腦缺血再灌注損傷及損傷后給藥半暗帶區(qū)神經(jīng)細胞凋亡情況 (×400)Fig.3 The cerebral ischemia reperfusion injury and penumbra of neurocytes apoptosis condition administered after damage in rats (×400)

2.2.3 腦缺血再灌注損傷后PARP裂解片段增加：TUNEL法檢測的同時，利用Western印跡法檢測各時間點腦組織中對應(yīng)缺血半暗帶區(qū)凋亡特異性蛋白標志——PARP 89kD裂解片段，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果表明，Sham組PARP 89kD 裂解片段極少(5%)，I/R組各時間點PARP 89kD裂解片段顯著增加(30%)，均高于Sham 組(P<0.05)。不同時間點相比，PARP 89KD裂解片段在缺血再灌注損傷后1 d已經(jīng)開始增多(1 d，9%;3 d，19%；7 d，34%)，并呈持續(xù)升高趨勢(P<0.05)，提示神經(jīng)細胞凋亡持續(xù)發(fā)生。

2.2.4 缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡與Notch1活性呈正相關(guān)：選取各時間點神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)與NICD水平進行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明2者存在顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.978，P<0.05)。

2.3 抑制Notch1活性促進腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡 TUNEL 結(jié)果顯示，Vehicle組大鼠給藥1、3、7 d，神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)與I/R 組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。DAPT組各時間點凋亡指數(shù)明顯高于Vehicle組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且變化規(guī)律與Vehicle 組一致，仍以缺血再灌后3 d為頂點曲線變化。說明單純?nèi)軇δX缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡沒有影響，而DAPT抑制Notch1活性后可促進凋亡的發(fā)生，結(jié)果見圖4。

圖4 各組不同時間的神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)#P<0.05,與Vehicle組比較Fig.4 Nerve cell apoptosis index at different time points#P<0.05,compared with vehicle group

2.4 腦缺血再灌注損傷后Notch1 通過Akt、Bad 影響神經(jīng)細胞凋亡過程

2.4.1 腦缺血再灌注損傷后Akt 磷酸化水平增加并與Notch1正相關(guān)：各組之間Akt總蛋白表達水平無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。但是，相較于Sham組，I/R組p-Akt水平發(fā)生顯著改變，缺血再灌1 d時有所降低，3 d時明顯升高，7 d時回落，但較Sham組相比仍較高(P<0.05)。同時，為了驗證Akt變化與Notch1 之間有無關(guān)聯(lián)，進行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明2者存在顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.998，P<0.05)。

2.4.2 腦缺血再灌注損傷后Bad 磷酸化水平增加：Western結(jié)果顯示，相較于Sham組，I/R組p-Bad水平在缺血再灌1 d時開始升高，3 d時到達頂峰，7 d時回落，各時間點均高于Sham 組(P<0.05)。

圖5 腦缺血再灌注損傷后Bad磷酸化水平#P<0.05,與Sham組比較Fig.5 Bad phosphorylation after cerebral ischemia reperfusion injury#P<0.05,compared with Sham group

2.4.3 DAPT抑制Akt磷酸化水平：對比I/R組，Vehicle組大鼠給藥1、3、7 d后，Akt磷酸化水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明溶劑對腦缺血再灌注損傷后Akt表達無影響。與Vehicle組比較，DAPT組各時間點Akt磷酸化水平明顯減低(P<0.05)。結(jié)果表明DAPT給藥后抑制Notch1的同時使Akt 表達降低。

圖6 各組Akt 磷酸化水平#P<0.05,與Vehicle組比較Fig.6 Akt phosphorylation after Cerebral ischemia reperfusion injury#P<0.05,compared with vehicle group

3 討論

NICD是Notch1受體的活化形式，被認為是Notch信號通路激活的標志，NICD水平可代表Notch1蛋白的活性。本研究結(jié)果顯示腦缺血再灌后Notch1活性片段NICD水平均高，提示缺血再灌注損傷Notch1活性增強，缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡增加，腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡與Notch1活性之間有關(guān)聯(lián)，說明單純?nèi)軇δX缺血再灌注損傷后Notch1表達沒有影響，而給予DAPT 可有效抑制Notch1表達，與其他學(xué)者結(jié)果相似[3-7]。抑制Notch1活性神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)升高，但是單純?nèi)軇δX缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡沒有影響，而DAPT 抑制Notch1活性后可促進凋亡的發(fā)生。PI3K/Akt信號通路是一個在細胞生長、細胞生存和代謝中起主要調(diào)節(jié)作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，目前已有研究報道[8-12]，Notch1 通過PI3K/Akt信號通路抑制腫瘤組織中藥物引起的或p53介導(dǎo)的細胞凋亡，本研究結(jié)果說明各組之間Akt總蛋白表達水平無明顯統(tǒng)計學(xué)差異,但是p-Akt 水平發(fā)生顯著改變，Bad 作為Akt 的下游底物，同時檢測到Bad 總蛋白表達無明顯統(tǒng)計學(xué)差異及其磷酸化水平不同，結(jié)果表明DAPT 給藥后抑制Notch1 的同時使Akt 表達減低,與其他結(jié)果相同[13-15]。

結(jié)合本實驗得出如下結(jié)論：Notch1 在腦缺血再灌注損傷中可能具有抑制神經(jīng)細胞凋亡作用，在腦缺血再灌注損傷后抑制Notch1 可促進神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡；Notch1 在腦缺血再灌注損傷后抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用機制可能與增強Akt 磷酸化水平，促進Bad 失活有關(guān)。

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(編校：譚玲)

Effect of Notch1 on neuronal apoptosis after focal cerebral ischemia reperfusion injury

Cheng Lian-chen,WANG Hao,XU Chuan,LIANG Hui-ying,FANG Kai

(Department of Anesthesiology, Fourth People’s Hospital of Linfen City, Langfang 041000,China)

ObjectiveTo study effect of nerve cell apoptosis after injury of Notch1 on focal cerebral ischemia reperfusion, and find new targets for the treatment of ischemic cerebrovascular disease.Methods72 male adult SD rats were randomly divided into four equal groups: sham operation group (Sham group), ischemia reperfusion group (I/R group), Notch1 inhibitor group (DAPT group), solvent control group (Vehicle group).By the suture method of middle cerebral artery occlusion (MCAO) for rat focal cerebral ischemia reperfusion model, the rats ischemic for 90minutes as the standard.The Sham group only isolated vascular, suture was not inserted. After the recovery of ischemia-reperfusion, the rats in inhibitor of Notch1 group or Vehicle group were immediately injected with DAPT or pure solvent (PBS+DMSO) to the contralateral ventricle, once daily, respectively.After 1 d, 3 d, 7 d, rats were cut off the head to take out the brain tissue, pathological observation of ischemia perfusion of cortex damage detection index, neural cell apoptosis by TUNEL (AI), Western blot detection PARP cleavage fragment content, activity of Notch1 fragment of NICD, Akt and Bad phosphorylation.ResultsCompared with Sham group, the apoptotic index, PARP cleavage fragment content, NICD, phosphorylation of Akt, Bad level increased in I/R group, and there were significant difference (P<0.05); compared with I/R group, apoptotic index and PARP fragments were markedly increased, NICD, phosphorylation Akt and Bad levels decreased significantly in DAPT group, and the differences were significant (P<0.05), while among the solvent control indexes of the Vehicle group. ConclusionNotch1 can inhibit nerve cell apoptosis in cerebral ischemia reperfusion injury, the mechanism may be related to enhance Akt phosphorylation, promote Bad inactivation.

ischemia-reperfusion injury; Notch1; neurons ;apoptosis

程連臣，男，學(xué)士，主治醫(yī)師，研究方向：危重病人的麻醉，E-mail：qch1821460125@163.com。

R743.3

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1005-1678(2015)02-0059-04