谷牧人,李駿白,張筱驊,殷詠梅

(1.溫州醫(yī)科大學定理臨床學院溫州市中心醫(yī)院 腫瘤內科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，浙江 溫州 325000；3.南京醫(yī)科大學，江蘇 南京 210029)

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苦參堿對人乳腺癌MCF-7細胞的促凋亡作用及其對線粒體跨膜電位的影響分析

谷牧人1,李駿白1,張筱驊2Δ,殷詠梅3

(1.溫州醫(yī)科大學定理臨床學院溫州市中心醫(yī)院 腫瘤內科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，浙江 溫州 325000；3.南京醫(yī)科大學，江蘇 南京 210029)

目的 研究苦參堿對人乳腺癌(michigan cancer foundation-7，MCF-7)細胞的促凋亡作用及對線粒體跨膜電位的影響。方法 體外培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細胞，觀察組細胞中加入不同濃度的苦參堿溶液，對照組細胞中加入等量的培養(yǎng)液。MCF-7細胞的凋亡與細胞線粒體跨膜電位采用流式細胞儀檢測，MCF-7細胞的抑制率采用MTT的方法檢測。結果 苦參堿處理24h后觀察組的MCF-7細胞凋亡率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著濃度的升高而升高；苦參堿對于MGF-7細胞抑制率的結果顯示，隨著時間與濃度的增加苦參堿對于MGF-7細胞抑制率效應也隨之增強，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；苦參堿處理24 h后的羅丹明染色陽性數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明線粒體跨膜電位與濃度呈負相關。結論 苦參堿對人乳腺癌MCF-7細胞有促凋亡的作用，其促凋亡的作用可能是通過降低線粒體跨膜電位而使MMP的通道打開。

苦參堿；乳腺癌；線粒體跨膜電位

近年來乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重影響了女性的健康和生存質量。目前，治療方法多采用藥物化療，其化療制劑毒副作用大，費用昂貴，許多患者因此無法有效治療而喪失了生存的機會。由于傳統(tǒng)的中藥具有毒副作用小、療效好和價廉等優(yōu)點，逐漸受到人們的關注。苦參堿(matrine，MAT)是從苦豆子、苦參等豆科植物中提取得到一種生物活性堿，研究發(fā)現(xiàn)，其在肺癌、肝癌、大腸癌、胃癌等的癌細胞中起到了促凋亡與抑制的作用[1-2]。本文旨在通過研究苦參堿對人乳腺癌MCF-7細胞的促凋亡作用及對線粒體跨膜電位的影響，初步探討苦參堿抗乳腺癌的可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 苦參堿購自西安融升生物科技有限公司；乳腺癌MCF-7細胞株由溫州醫(yī)科大學定理臨床學院溫州市中心醫(yī)院的細胞實驗室來提供；RPMI-1640培養(yǎng)液購自南京醫(yī)藥股份有限公司；羅丹明染色試劑盒購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；新生胎牛血清購自四川科倫實業(yè)集團有限公司；胰酶與四甲基噻唑藍MTT購自中美上海施貴寶制藥有限公司。

1.2 儀器 SW-GJ-2FD型的超凈工作臺購自浙江大學醫(yī)學儀器有限公司；3319型CO2培養(yǎng)箱購自Forma公司；BDFACS-Aria流式細胞儀購自雙鴿集團有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)以及傳代：將乳腺癌MCF-7細胞株從液氮罐中快速的取出放入37 ℃～42 ℃左右的水浴箱中進行解凍，待融化后把凍存管置于1500 r/min的離心機進行離心，將離心過的凍存管放在超凈臺內拿掉凍存液之后往里加入事先準備好的RPMI-1640培養(yǎng)液2 mL，用吸管輕輕的吹打懸浮著的細胞之后轉移到培養(yǎng)瓶內，培養(yǎng)瓶內的培養(yǎng)液添加到4～5 mL，放入溫度為37 ℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。細胞經過24 h的培養(yǎng)之后，通過倒置的顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞的生長狀況，當細胞數(shù)量達到瓶底的80%左右時進行細胞的傳代培養(yǎng)，把培養(yǎng)液換成約2 mL左右的消化液進行消化，繼續(xù)通過倒置的顯微鏡觀察，當細胞出現(xiàn)收縮細胞間有裂隙產生，還未變圓前，停止消化，把消化液換成新鮮的培養(yǎng)液，再輕輕的吹打貼在瓶壁上的細胞，使其全部懸浮后，在平均分開放入培養(yǎng)瓶內繼續(xù)在溫度為37 ℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.2.2 細胞凋亡情況的檢測：分別取觀察組與對照組的細胞，棄去培養(yǎng)液，用胰酶進行消化，加入首先預冷的PBS進行洗滌，輕輕的吹打貼在瓶壁上的細胞使其懸浮。收集培養(yǎng)細胞在1500 r/min的尖底離心管內進行7 min的離心。把細胞數(shù)調整為1×105個/mL，采用相同的方法進行2次PBS洗滌，2次離心前都先把細胞放到流式測定管內，離心之后在流式測定管里加入100 μL的結合緩沖液來使細胞懸浮，在分別加入5 μL的Annexin V/FITC與10 μL的碘化丙啶溶液，混和均勻后在室溫避光培養(yǎng)15 min，再加入400 μL的結合緩沖液及時用流式細胞儀進行分析。

1.2.3 苦參堿對于MCF-7細胞生長的抑制率：取處于對數(shù)期的乳腺癌MCF-7細胞，采用濃度為0.25%的胰酶消化和培養(yǎng)液輕輕的吹打懸浮的細胞，把濃度調整為2×104個/mL，接種于96個孔板內每個孔100 μL，再培養(yǎng)24 h，對細胞貼壁進行觀察待生長良好之后，分別加入苦參堿溶液100 μL使其濃度為0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL，為觀察組，另外對照組加入等量的培養(yǎng)液，各自設置4個復孔。溫度為37 ℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。在苦參堿對其作用24、46、72 h之后MTT檢測，檢測前在每個孔內加入100 μL的DMSO，輕輕的振蕩，10～15 min后，用酶標儀進行吸光度的測定。測量波長選擇492 nm。計算出各個時間段觀察組以及觀察組的4個復孔內的平均吸光度的值。計算公式為：腫瘤細胞的生長抑制率=(1-觀察組的吸光度/對照組的吸光度)×100%。

1.2.4 線粒體跨膜電位檢測：選擇5瓶對數(shù)期生長的MCF-7細胞，其中選取4瓶各自加入4 mL苦參堿溶液(含有培養(yǎng)液)，苦參堿的濃度為0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL作為觀察組，取1瓶作為對照組加入等量的培養(yǎng)液。在溫度為37 ℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h。藥物對其作用24 h之后細胞采用0.25%的胰酶消化后再放置在培養(yǎng)液中，取細胞數(shù)1×106個/mL，然后添加10 μg/mL 羅丹明123染液在溫度為37 ℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)20 min離心，細胞用培養(yǎng)液清洗2次，然后用上流式細胞儀進行檢測。

2 結果

2.1 苦參堿處理24 h后細胞凋亡率的比較 對照組MCF-7細胞凋亡率為(1.12±0.06)%；觀察組中，濃度為0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL的苦參堿處理的細胞凋亡率分別為(4.27±0.26)%、(6.59±0.17)%、(16.16±0.23)%和(20.16±0.16)%?？鄥A處理24h后觀察組的MCF-7細胞凋亡率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著濃度的升高而升高。見表1。

表1 苦參堿處理24 h后細胞凋亡率的比較Tab.1 Comparison of cell apoptosis rate by matrine after ±s,n=5)

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group

2.2 MGF-7細胞抑制率的比較 苦參堿對于MGF-7細胞抑制率的結果顯示，隨著時間與濃度的增加苦參堿對于MGF-7細胞抑制率效應也隨之增強，且存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)；具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 MGF-7 細胞抑制率的比較Tab.2 Comparison of cell inhibition rate for ±s,n=5)

2.3 苦參堿處理24 h后線粒體膜電位的比較 苦參堿處理24 h后的羅丹明染色陽性數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且羅丹明染色陽性數(shù)隨著濃度的增升高而降低，呈負相關。見表3。

表3 苦參堿處理24 h后線粒體膜電位的比較±s,n=5)Tab.3 Comparison of mitochondrial transmembrane potential by ±s,n=5)

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group

3 討論

苦參堿是多種中草藥的有效成分[3-4]。有研究表明，其具有很重要生物學活性，主要表現(xiàn)為抗病毒、抗癌、抗纖維化以及免疫調節(jié)等，具有上述多種藥理生理作用，并通過體外實驗顯示苦參堿能夠對多種癌細胞具有抑制生長或者廣泛殺傷的作用[5-7]。羅丹明123能夠透過細胞細胞膜，是一種陽離子的熒光染料，同時也是線粒體的跨膜電位指示劑。羅丹明123在正常的細胞中可以依賴線粒體的跨膜電位從而進入細胞的線粒體基質內，在進入的過程中其熒光的強度逐漸減弱直至消失，而在其發(fā)生凋亡時，細胞的線粒體膜的完整性受到破壞，使管理線粒體的膜通透性轉運孔打開，從而引起細胞內線粒體的跨膜電位發(fā)生崩解[8-9]。本研究對體外對人乳腺癌MCF-7細胞進行培養(yǎng)，觀察組細胞中加入不同濃度的苦參堿溶液，對照組細胞中加入等量的培養(yǎng)液。

本研究發(fā)現(xiàn)，加入苦參堿溶液處理24 h后的MCF-7細胞凋亡率顯著高于等量的培養(yǎng)液的MCF-7細胞凋亡率，且隨著苦參堿溶液濃度的升高MCF-7細胞凋亡率不斷升高。研究說明了苦參堿溶液對MCF-7細胞凋亡有明顯的促進作用，能夠促進MCF-7細胞的凋亡。其機制可能為苦參堿會影響線粒體的跨膜電位的MMP通道，其會導致MMP通道打開，從而觸發(fā)細胞凋亡的發(fā)生[10]?；蚩赡苁峭ㄟ^改變線粒體的膜內外的離子濃度，從而使細胞的跨膜電位發(fā)生崩潰，促使MMP通道發(fā)生開放，導致內外膜中的許多離子發(fā)生逆流，進而觸發(fā)細胞凋亡的產生。本研究表明苦參堿溶液對于MGF-7細胞的抑制率結果為隨著時間與濃度的增加，苦參堿對于MGF-7細胞抑制率效應也隨之增強，抑制率逐漸增強；同時也說明苦參堿處理能夠明顯抑制細胞的生長，且與濃度呈正相關，濃度越高則抑制率越高。Rh123會從線粒體中釋放出來，從而會發(fā)出黃綠色的熒光，熒光可由流式細胞儀進行檢測[11-12]。進而通過熒光信號強弱能夠檢測細胞線粒體的膜電位所發(fā)生的變化以及監(jiān)測凋亡的發(fā)生與否[13]。

本研究顯示，苦參堿溶液能夠對MCF-7細胞凋亡有明顯的促進作用，能夠促進MCF-7細胞的凋亡，明顯抑制細胞的生長，同時可以明顯降低羅丹明染色陽性數(shù)，且作用能力與濃度呈正相關。

綜上所述，苦參堿對人乳腺癌MCF-7細胞有促凋亡的作用，其促凋亡的作用可能是通過降低線粒體跨膜電位而使MMP的通道打開。

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(編校：譚玲,王冬梅)

Analysis of induced apoptosis effect of matrine on human breast cancer MCF-7 cell and its effect on mitochondrial transmembrane potential

GU Mu-ren1,LI Jun-bai1,ZHANG Xiao-hua2Δ,YIN Yong-mei3

(1.Department of Tumor Oncology, Theorem Clinical Medical College, Wenzhou City Hospital, Wenzhou 325000, China; 2.Department of Tumor Surgery, First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical, Wenzhou 325000, China; 3.Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

ObjectiveTo study the effect and the analysis of matrine for induced apoptosis in breast cancer MCF-7 cells and mitochondrial transmembrane potential.MethodsBreast cancer MCF-7 cells were cultured in vitro,then they were divided according to the random number to observation goup and control group.The observation goup were treated by different concentrations of matrine solution, and control group were added an equal amount of broth.Apoptosis and mitochondrial membrane potential of MCF-7 cells were detected by flow cytometry (FCM) detection, the inhibition rate of MCF-7 cells was detected by MTT.ResultsMCF-7 cell apoptosis rate in observation goup was significantly higher than that in control group after 24h, and there were statistically significant (P<0.05), it increased as the concentration had increased; inhibition rate of matrine for MGF-7 cell showed that inhibition rate had increased with time and concentration of matrine, and there was a statistically significant (P<0.05); Rhodamine staining positive number in observation group was less than the control group, and there were statistically significant (P<0.05), and the number of positive Rhodamine staining increased as the concentration had increased. ConclusionMatrine can promote apoptosis for human breast cancer MCF-7 cells, the effect may be caused by reducing mitochondrial transmembrane potential and leaving the MMP channel open.

matrine; breast cancer; mitochondrial transmembrane potential

國家自然科學基金(81172503)

谷牧人，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤內科，E-mail：qch1821460067@163.com；張筱驊，通訊作者，男，本科，主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤外科，E-mail：qch1821460068@163.com。

R248.2

A

1005-1678(2015)02-0039-03