陳愛娟，吳 芳，陳 偉

（蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇215009）

基于UPLC-QTOF-MS/MS對2型糖尿病中醫(yī)證型的代謝組學(xué)研究

陳愛娟，吳 芳，陳 偉

（蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇215009）

目的將傳統(tǒng)中醫(yī)辨證方法與現(xiàn)代系統(tǒng)生物學(xué)理論相結(jié)合，研究2型糖尿病中醫(yī)辨證分型及虛實證與基于超高效液相色譜法（UPLC）-四極桿飛行時間（QTOF）-質(zhì)譜（MS）/MS的血清代謝組學(xué)的關(guān)系。方法選擇2013年6月至2014年4月住院并確診為2型糖尿病患者90例（辨證分為陰虛熱盛、氣陰兩虛、血淤氣滯3種證型）。應(yīng)用UPLCQTOF-MS/MS方法測定健康者及不同中醫(yī)證型2型糖尿病患者血清內(nèi)源性代謝物，并用偏最小二乘-判別式分析（PLS-DA）代謝譜。結(jié)果PLS-DA分析結(jié)果表明，該法不僅可有效區(qū)分疾病組和健康對照組，也可明顯區(qū)分患者中陰虛熱盛、氣陰兩虛、血淤氣滯3種證型。結(jié)論基于UPLC-QTOF-MS/MS和模式識別的代謝組學(xué)技術(shù)在揭示傳統(tǒng)中醫(yī)理論本質(zhì)及對2型糖尿病的臨床研究方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

代謝；糖尿病，2型；中醫(yī)學(xué)；辨證分型；超高效液相色譜-四極桿飛行時間-質(zhì)譜

2型糖尿病是一種全球性的常見、多發(fā)慢性疾病，嚴(yán)重威脅人類健康。發(fā)病率和死亡率緊隨癌癥，心、腦血管病之后[1]。近年來，針對糖尿病發(fā)病機制展開了廣泛研究，形成了脂毒說和炎癥說2種觀點。然而針對這2種觀點尚缺乏治療糖尿病的有效方法。糖尿病在許多中醫(yī)藥古籍中被稱為消渴證，中醫(yī)藥在治療糖尿病方面具有完整的理論體系和豐富的臨床經(jīng)驗[2]，但目前中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、證名不規(guī)范及每一證型沒有證候的主次等[3-4]，無疑是中醫(yī)藥干預(yù)糖尿病治療的短板。因此，進行該方面規(guī)范化、客觀化的研究很有必要。

對糖尿病的研究，多年來許多學(xué)者認(rèn)為，中醫(yī)與西醫(yī)格格不入，然而在系統(tǒng)生物學(xué)時代找到了共同前進的道路。隨著系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)模式的建立，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究正由微觀角度的探索逐步轉(zhuǎn)向宏觀?？深A(yù)見以整體觀念和辨證論治為特點的現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)融入當(dāng)前系統(tǒng)生物學(xué)的學(xué)術(shù)研究成為必然趨勢[5]。代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的代表，借助高通量、高靈敏度與高精確度的現(xiàn)代分析技術(shù)，分析細(xì)胞、組織和血液或尿液及其生物樣本中內(nèi)源性代謝物，并通過代謝物復(fù)雜、動態(tài)變化辨識和解析被研究對象的生理病理狀態(tài)[6]。代謝組學(xué)研究具有整體、動態(tài)、綜合的特點，能從代謝網(wǎng)絡(luò)終端表象的整體角度反映生物體的功能水平，與中醫(yī)學(xué)的系統(tǒng)觀、整體觀相近。因此，代謝組學(xué)技術(shù)具有揭示證候系統(tǒng)化、動態(tài)化、整體化等特點，從而可以作為中醫(yī)證候研究的新技術(shù)平臺。本文基于超高效液相色譜法（ultra high performance liquidchromatography，UPLC）-四極桿飛行時間（quadrupole time of flight，QTOF）-質(zhì)譜（mass spectra，MS）/MS的代謝組學(xué)技術(shù)分析2型糖尿病不同中醫(yī)證型的血清代謝物變化規(guī)律，旨在探求2型糖尿病的中醫(yī)證候本質(zhì)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選擇2013年6月至2014年4月本院內(nèi)分泌科住院并確診為2型糖尿病患者90例，其中男46例，女44例。健康對照組為本院體檢中心經(jīng)檢查排除糖尿病、內(nèi)分泌等疾病的健康志愿者30例，其中男15例，女15例。90例患者中醫(yī)證型及性別分布見表1。

表1 90例患者中醫(yī)證型及性別分布（n）

1.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 中醫(yī)辨證分型參照文獻(xiàn)[7]中消渴證（糖尿?。┑闹嗅t(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，分為陰虛熱盛、氣陰兩虛、血淤氣滯3種證型。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)[8]（1）糖尿病急性并發(fā)癥者（包括糖尿病低血糖癥、糖尿病高滲性昏迷、糖尿病酮癥及酮癥酸中毒、糖尿病乳酸性酸中毒、糖尿病急性感染）；（2）嚴(yán)重心、肝、腎等并發(fā)癥或合并其他嚴(yán)重原發(fā)性疾病、精神病患者；（3）年齡小于30歲或大于70歲；（4）妊娠期、哺乳期婦女；（5）不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)，資料不全者。

1.1.4 材料與試劑 甲酸（色譜純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）均購于德國Merck公司，1，2-13C2-肉寇酸購于Sigma-Aldrich公司，超純水由Millipore-Q3系統(tǒng)制得（Millipore，美國），飛鴿高速冷凍離心機購于上海飛鴿公司，Speed-vac濃縮儀購于 Thermo Savant美國，UPLC-QTOF-MS/MS購于美國ABsciex公司，安捷倫ZORBAXC18色譜柱（3.0 mm×50 mm，1.8 μm）購于美國安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 血清采樣方法 采集研究對象空腹12 h以上、次日早晨肘靜脈血2 mL，4 000 r/min離心10 min，移取血清，-80℃冰箱保存，統(tǒng)一送至南京中醫(yī)藥大學(xué)儀器分析中心進行血清代謝組學(xué)檢測。

1.2.2 血樣處理 在0.2 mL血清中加入0.5 mL含有內(nèi)標(biāo)肉寇酸的甲醇溶液，渦旋振蕩5 min后在4℃下靜置30 min，然后4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液于試管中，用氮氣吹干溶劑，加入0.2 mL甲醇復(fù)溶，渦旋振蕩3 min，4℃、10 000 r/min離心10 min，吸取上清液進行UPLC-QTOF-MS/MS檢測[9]。

1.2.3 數(shù)據(jù)采集和處理

1.2.3.1 液相條件 0.1%甲酸（A）、0.3%甲酸乙腈（B）梯度洗脫（0～10 min，5%～100%B），流速0.4 mL/min，柱溫40℃，進樣量2 μL。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 采用飛行時間（time of flight，TOF）MS-IDA-MS/MS、正離子檢測模式，噴霧電壓5 500 eV，離子源溫度550℃，氣簾氣40 psi，霧化氣60 psi，輔助氣60psi，去簇電壓70eV，TOFMS掃描范圍：50～1500m/z；IDA條件下設(shè)置：碰撞電壓35eV，碰撞電壓差10 eV，開啟動態(tài)背景扣除。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用AnalystTF1.6軟件采集數(shù)據(jù)，應(yīng)用Markview1.2.1軟件進行峰提取、峰對齊及歸一化等處理。數(shù)據(jù)分析和建模均應(yīng)用SIMCA-P11軟件（Ume大學(xué)，瑞典）完成。以內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化的矩陣X（實驗樣本）和矩陣Y（峰面積）相互關(guān)聯(lián)建模，采取偏最小二乘-判別式分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）的統(tǒng)計方法。PLS-DA集合了主成分分析、典型相關(guān)分析和多元線性回歸分析等3種分析方法的優(yōu)點。不但能提取原有信息的綜合指標(biāo)，而且還具有主成分分析法無法比擬的預(yù)測功能。其樣品分布圖可將不同組的樣本分成不同簇，在PLS-DA變量分布圖中可尋找出對該種區(qū)分有貢獻(xiàn)的差異變量。如果繼續(xù)對這些差異變量進行統(tǒng)計學(xué)處理，集合代謝組學(xué)差異性化合物數(shù)據(jù)庫，便可尋找出具有顯著差異的變量，即可能為病理研究的生物標(biāo)志物。

2 結(jié) 果

2.1 不同中醫(yī)證型2型糖尿病PLS-DA圖 2型糖尿病的3種中醫(yī)證型兩兩均可明顯區(qū)分，3種中醫(yī)證型患者血清內(nèi)源性代謝物存在顯著差異；陰虛熱盛、血淤氣滯2種證型相距較近，這2種證型均是虛證，與氣陰兩虛型實證可區(qū)分開，且二者血清內(nèi)源性代謝物也存在顯著差異，見圖1。

圖1 不同中醫(yī)證型2型糖尿病PLS-DA圖

2.2 不同中醫(yī)證型2型糖尿病及健康對照組PLS-DA圖 2型糖尿病的3種中醫(yī)證型兩兩可明顯區(qū)分，且與健康對照組也可明顯區(qū)分。不僅3種中醫(yī)證型2型糖尿病彼此之間血清內(nèi)源性代謝物存在顯著差異，且2型糖尿病的不同中醫(yī)證型與健康對照組血清內(nèi)源性代謝物也存在顯著差異，見圖2。

圖2 不同中醫(yī)證型2型糖尿病及健康對照組PLS-DA圖

3 討 論

辨證論治是中醫(yī)的核心思想，“證候”是中醫(yī)整體觀、辨證觀的統(tǒng)一。目前，糖尿病患者的臨床表現(xiàn)發(fā)生了較大變化，舊理論遠(yuǎn)不足以對現(xiàn)今的糖尿病中醫(yī)證型進行概括，現(xiàn)代藥物的不斷更新，對糖尿病的發(fā)病方式進行了干預(yù)，使其辨證論治越發(fā)困難。針對這種錯綜復(fù)雜的情況，需要有新的理論、新的依據(jù)指導(dǎo)辨證論治。另外由于各專家、學(xué)者對糖尿病的認(rèn)識和理解存在差異，沒有形成統(tǒng)一的辨證分型標(biāo)準(zhǔn)，這也需要現(xiàn)代研究推動理論前進，制訂出一套令大眾信服的辯證指導(dǎo)理論服務(wù)于臨床。

本研究采用血清代謝組學(xué)研究方法，對90例2型糖尿病不同中醫(yī)證型患者及30例健康志愿者進行了血清代謝組學(xué)研究，應(yīng)用UPLC-QTOF-MS/MS方法測定血清內(nèi)源性代謝物，并對數(shù)據(jù)進行PLS-DA，應(yīng)用SIMCAP11軟件繪制變量分布圖。PLS-DA圖揭示，不僅2型糖尿病患者與健康者血清內(nèi)源性代謝物存在顯著差異，且不同證型患者血清內(nèi)源性代謝物也存在顯著差異。本研究還創(chuàng)新性地對中醫(yī)證型進行了虛、實證分類，結(jié)果顯示，2型糖尿病患者虛、實證血清內(nèi)源性代謝物也存在顯著差異。

本研究對提高臨床辨證論治水平、提高患者生活質(zhì)量具有重大意義。但本研究還存在一些缺陷，如樣本量較小等問題，需進一步進行大規(guī)模臨床觀察，作者后續(xù)將進行這方面的研究，從癥狀的規(guī)范化、如何將中醫(yī)傳統(tǒng)規(guī)范的“證”和西醫(yī)診斷完整的“病”結(jié)合起來、完成新的辨證體系等方面進行探討。

[1]Shaw JE，Sicree RA，Zimmet PZ．Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030[J].Diabetes Res Clin Pract，2010，87（1）：4-14.

[2]SuYX，HongJ，YanQ，etal．Increasedserumretinol-bindingprotein-4levels in pregnant women with and without gestational diabetes mellitus[J].Diabetes Metab，2010，36（6 Pt 1）：470-475.

[3]王洪霞，胡曉靈.糖尿病中醫(yī)證型研究近況[J].中醫(yī)文獻(xiàn)雜志，2008，26（3）：47-48.

[4]李晉宏，曲竹秋.203例2型糖尿病的中醫(yī)辨證分型研究[J].河南中醫(yī)，2004，24（3）：38-39.

[5]潘明，陳瓊.中醫(yī)體質(zhì)、病證研究與代謝組學(xué)[J].上海中醫(yī)藥雜志，2008，42（6）：53-56.

[6]Nicholson JK，C onnelly J，Lindon JC，et al.Metabonomics：a platform for studying drug toxicity and gene function[J].Nat Rev Drug Discov，2002，1（2）：153-161.

[7]國家藥品食品監(jiān)督管理局.中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2002：233-237.

[8]趙莉娟，李晶，陳筱云，等.糖尿病患者中醫(yī)不同證型規(guī)律探討[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，4（5）：363-364.

[9]朱萱萱，王廣基，阿基業(yè)，等.冠心病中醫(yī)辨證分型的代謝組學(xué)研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27（6）：1267-1269.

Metabolomic study on traditional Chinese medicine syndrome types of type 2 diabetes mellitus based on UPLC-QTOF-MS/MS

Chen Aijuan，Wu Fang，Chen Wei
（Suzhou Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu 215009，China）

ObjectiveTo study the relationship between the traditional Chinese medicine syndrome differentiation and excess or deficiency syndrome in type 2 diabetes mellitus（T2DM）with the serum metabolomics based on UPLC-QTOF-MS/MS by combining the traditional Chinese medicine differentiation method with the modern systematic biological theory．Methods90 inpatients diagnosed as T2DM in our hospital from June 2013 to April 2014 were selected and divided into 3 kinds of syndrome type including the type of Yin deficiency and intense heat，type of deficiency of both Qi and Yin and type of Qi stagnancy and blood stasis.The endogenous metabolites in the healthy individuals and different Chinese medicine syndrome types of T2DM were detected by the UPLC-QTOF-MS/MS method.Then the metabolic profiling was analyzed by using the partial least squares discriminant（PLS-DA）method.ResultsThe PLS-DA analysis results showed that this method not only effectively distinguished the disease group from the healthy control group，but also differentiated the three syndrome types of Yin deficiency and intense heat，deficiency of both Qi and Yin，and Qi stagnancy and blood stasis in T2DM patients.ResultsThe metabolomic technique based on UPLC-QTOF-MS/MS and pattern recognition has the extensive application prospects in revealing the essence of traditional Chinese medicine and clinical research of T2DM.

Metabolism；Diabetes mellitus，type 2；TCM science；Syndrome differentiation classification；Ultra high performance liquid chromatography-quadrupole time of flight-mass spectra

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.17.002

A

1009-5519（2015）17-2572-03

2015-04-24）

蘇州市科技計劃項目（SYS201423）。

陳愛娟（1977-），女，江蘇蘇州人，主管中藥師，主要從事中藥學(xué)及儀器分析工作；E-mail：525405952@qq.com。

陳偉（E-mail：540584399@qq.com）。