李冰+盧明倩+王巧貞+石貴玉+廖威+黃庶識(shí)

摘 要 應(yīng)用激光光鑷?yán)庾V技術(shù)（LTRS）作為一種非入侵分析線粒體的工具，結(jié)合氧電極法、紫外分光光度計(jì)法，研究乙酸脅迫酵母細(xì)胞后提取的線粒體，以及直接脅迫正常酵母細(xì)胞的離體線粒體的拉曼光譜。結(jié)果顯示，乙酸脅迫酵母細(xì)胞后提取的線粒體的拉曼光譜，歸屬于核酸的譜峰（1081和1301 cm）、蛋白質(zhì)的譜峰（872，1445，1604和1657 cm）、脂類的譜峰（1125，1301，1445和1657 cm）、Cyt c的特征峰（750和1125 cm）、線粒體呼吸特征峰（1604 cm），都隨著誘導(dǎo)程度的加深而降低，與常規(guī)法測(cè)定的指標(biāo)呼吸率，磷氧比，細(xì)胞色素C含量的降低，MDA含量的升高的變化趨勢(shì)相似；乙酸直接脅迫線粒體的拉曼光譜，歸屬于核酸的譜峰（1081和1301 cm），蛋白質(zhì)的譜峰（872，1445，1604和1657 cm），脂類的譜峰（1125，1301，1445和1657 cm），Cyt c的特征峰（750和1125 cm），線粒體呼吸特征峰（1604 cm），都隨著誘導(dǎo)程度的加深而降低，與常規(guī)法測(cè)定的指標(biāo)呼吸率、磷氧比、細(xì)胞色素C含量的降低，MDA含量的升高的變化趨勢(shì)相似。結(jié)果表明，乙酸脅迫細(xì)胞過程中，乙酸進(jìn)到細(xì)胞內(nèi)可能直接作用于線粒體，引起線粒體內(nèi)物質(zhì)的釋放，導(dǎo)致依賴于線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞 拉曼光譜； 乙酸脅迫； 酵母細(xì)胞； 線粒體； 凋亡

1 引 言

乙酸是酵母發(fā)酵過程中的一種代謝產(chǎn)物，它不能被酵母代謝，會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生生理毒害作用，抑制酵母發(fā)酵，如果乙酸等代謝產(chǎn)物進(jìn)一步積累就會(huì)誘發(fā)酵母細(xì)胞大量死亡【1，2】。用20～200 mmol/L乙酸對(duì)對(duì)數(shù)期的釀酒酵母細(xì)胞進(jìn)行脅迫，酵母細(xì)胞會(huì)發(fā)生染色質(zhì)伴隨著核膜的凝聚、細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸的外翻和TUNEL顯陽性表型等的凋亡現(xiàn)象，當(dāng)乙酸脅迫同一種穩(wěn)定時(shí)期的釀酒酵母時(shí)，發(fā)現(xiàn)依賴于線粒體途徑的酵母細(xì)胞凋亡現(xiàn)象【3】；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞凋亡與ROS的產(chǎn)生、Cyt c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中有關(guān)【4】。用一定濃度乙酸處理酵母細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞凋亡過程釋放的Cyt c能激活Caspase，使Caspase裂解成為有酶解活性的異源二聚體，并引發(fā)下游的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過裂解特異底物和激活內(nèi)源性核酸酶最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡【5，6】。但直到目前為止，酵母的代謝產(chǎn)物如何誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的過程仍不完全清楚。初步的研究表明，其代謝物可通過誘導(dǎo)線粒體中內(nèi)含物的釋放來啟動(dòng)細(xì)胞不可逆的凋亡程序【7】。

激光光鑷?yán)到y(tǒng)（LTRS）是利用激光束形成的光鑷固定溶液中的單個(gè)活細(xì)胞，再經(jīng)過瞬時(shí)增加激光功率同時(shí)激發(fā)和收集細(xì)胞的拉曼光譜，具有無損傷、靈敏、快速等優(yōu)勢(shì)，是研究溶液中單個(gè)活細(xì)胞的有力工具。線粒體是真核生物細(xì)胞中進(jìn)行能量代謝的重要細(xì)胞器，在功能上線粒體不僅是細(xì)胞能量代謝的中樞，還是細(xì)胞凋亡的重要參與者；線粒體大小約為0.5～1 μm，在緩沖液中可被激光鑷子所捕獲，避免了由于布朗運(yùn)動(dòng)對(duì)線粒體的影響。因此，LTRS的應(yīng)用使得離體有活性的單個(gè)線粒體的研究成為可能【10】。本研究應(yīng)用LTRS，研究了乙酸脅迫酵母細(xì)胞以及離體線粒體過程中的光譜變化，獲得乙酸誘導(dǎo)酵母細(xì)胞發(fā)生凋亡的過程中，線粒體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、脂類等大分子物質(zhì)變化的實(shí)時(shí)信息，是單個(gè)線粒體水平上的一種簡(jiǎn)單快速分析方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 菌株與培養(yǎng)基

菌種：安琪釀酒高活性干酵母（安琪酵母股份有限公司）。

培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基：1%酵母提取物、2%葡萄糖、2%蛋白胨。

2.2 乙酸脅迫酵母細(xì)胞以及線粒體的提取

2.2.1 酵母菌的活化 取干酵母粉于YPD液體培養(yǎng)液中，29 ℃、100 r/min培養(yǎng)過夜，將長(zhǎng)菌的液體培養(yǎng)基稀釋105倍后涂板，29 ℃培養(yǎng)。挑取單菌落至新鮮的YPD液體培養(yǎng)基中，在29 ℃以100 r/min培養(yǎng)過夜，按1%的接種量接種到新鮮的YPD液體培養(yǎng)基中，再在29 ℃以150 r/min培養(yǎng)，當(dāng)OD≈0.8時(shí)，即可離心收集菌體。

2.2.2 線粒體的提取 將離心收集的菌體，用菌體預(yù)處理緩沖液處理后加入蝸牛酶緩沖液，再加入原生質(zhì)體裂解液和玻璃珠（425～600 μm）冰上渦旋破壁，破壁后差速離心法提取線粒體【11，12】，線粒體提取液懸浮，4 ℃保存待用。對(duì)所提取的線粒體馬上進(jìn)行穩(wěn)定性與完整性測(cè)試，只有在4 ℃條件下，2 h內(nèi)保持結(jié)構(gòu)的完整性以及生理穩(wěn)定性的離體線粒體，才可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 不同濃度乙酸脅迫酵母細(xì)胞 將離心收集的菌體，用50 mmol/L Tris緩沖液（pH 7.5）洗2～3次，在等體積、終濃度分別為0，50，100和200 mmol/L乙酸中進(jìn)行處理，在29 ℃以100 r/min緩慢搖60 min，離心去掉處理液，用50 mmol/L Tris緩沖液（pH 7.5）洗3次，稱濕重，提取酵母線粒體。

2.2.4 高濃度乙酸脅迫酵母細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)線粒體的提取

將離心收集的菌體，用50 mmol/L Tris緩沖液（pH 7.5）洗3次，在終濃度為200 mmol/L乙酸中進(jìn)行處理，在29 ℃以100 r/min緩慢搖，分別在0，30，60和90 min時(shí)間點(diǎn)取樣，離心去掉上清液，50 mmol/L Tris緩沖液（pH 7.5）洗3次，稱濕重，提取酵母線粒體。

2.3 乙酸脅迫離體線粒體

將離心收集的酵母細(xì)胞，用50 mmol/L Tris緩沖液（pH 7.5）洗3次，稱濕重，提取酵母線粒體。提取后的酵母線粒體，在4 ℃條件下，終濃度為20 mmol/L 乙酸中進(jìn)行處理，不時(shí)搖動(dòng)離心管使線粒體始終懸浮于處理液中，分別在0，15，30，45，60，75和90 min時(shí)間點(diǎn)取樣，離心去掉處理液，線粒體懸浮液洗滌3次后懸浮，4 ℃保存?zhèn)溆谩ndprint

2.4 凋亡細(xì)胞DAPI染色

細(xì)胞凋亡DAPI染色按試劑盒說明書步驟進(jìn)行（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。離心收集乙酸處理后的細(xì)胞，加500 μL DAPI工作液洗1次，再加500 μL DAPI工作液重懸細(xì)胞，37 ℃染色15 min，離心收集細(xì)胞棄去工作液，加入Buffer A重懸細(xì)胞，滴加于載玻片上，熒光顯微鏡以340/380 nm紫外光激發(fā)，鏡檢、拍照。

2.5 線粒體生理生化活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)＼

圖4是200 mmol/L乙酸脅迫酵母細(xì)胞不同時(shí)間后提取其線粒體的拉曼光譜及特征峰強(qiáng)度變化趨勢(shì)圖。圖中顯示，歸屬于核酸的譜峰（1081和1301 cm），蛋白質(zhì)的譜峰（872，1445，1604和1657 cm），脂類的譜峰（1125，1301，1445和1657 cm），Cyt c的特征峰（750和1125 cm）及線粒體呼吸特征峰（1604 cm）均隨著脅迫時(shí)間的增加而降低。所以，200 mmol/L乙酸脅迫下，酵母細(xì)胞線粒體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)、脂類、Cyt c的譜峰強(qiáng)度變化和時(shí)間存在依賴關(guān)系。

3.4 乙酸脅迫酵母細(xì)胞后其線粒體生理生化指標(biāo)

圖5是200 mmol/L乙酸脅迫酵母細(xì)胞不同時(shí)間后，在不同時(shí)間點(diǎn)提取其線粒體后所測(cè)定的的生理生化指標(biāo)變化趨勢(shì)。圖5A是乙酸脅迫細(xì)胞后其線粒體在不同時(shí)間點(diǎn)的呼吸率（RCR）與磷氧比（P/O）值，RCR和P/O反映線粒體氧化磷酸化的偶聯(lián)程度，圖5A顯示，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)RCR和P/O均呈下降趨勢(shì)，說明線粒體的氧化磷酸化偶聯(lián)程度降低，功能受損【23】，呼吸下降，與圖4中呼吸特征峰1604 cm

的變化相似。圖5B是乙酸脅迫細(xì)胞后其線粒體在不同時(shí)間點(diǎn)的丙二醛（MDA）和Cyt c含量變化趨勢(shì)圖。MDA是膜脂過氧化的一種終產(chǎn)物，而且，MDA還具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒素，對(duì)線粒體的呼吸功能具有顯著的抑制作用【24】，圖5B顯示，隨著乙酸脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，MDA含量增加，說明線粒體膜脂過氧化程度加深。Cyt c是存在于膜間隙的水溶性蛋白質(zhì)，正常情況下不能自由的通過線粒體外膜，當(dāng)線粒體外膜通透性增加時(shí)，會(huì)被釋放到胞漿中【25，26】；隨著乙酸脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，Cyt c含量降低，說明線粒體外膜受到破壞。圖5中的生理生化指標(biāo)與圖4脂類、Cyt c、呼吸的拉曼峰強(qiáng)度變化基本一致。

當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)的刺激時(shí)，可導(dǎo)致線粒體跨膜電位降低，外膜破裂，促使線粒體內(nèi)各種凋亡誘導(dǎo)因子的釋放，誘導(dǎo)因子的釋放可引起線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的降低。而線粒體跨膜電位的降低，可使氧化磷酸化過程解偶聯(lián)，大量的ROS產(chǎn)生，ATP的水解大于合成，造成ATP濃度迅速降低，胞質(zhì)ADP和膜上肌酸磷酸酯濃度增高，影響線粒體的呼吸作用【27】。線粒體中的線粒體DNA（mtDNA），裸露于基質(zhì)中，缺乏組合蛋白的保護(hù)，最易受到傷害，而且催化mtDNA復(fù)制的DNA聚合酶Y不具有校正功能，同時(shí)還缺乏有效的修復(fù)酶，所以mtDNA一旦受到損傷不易被修復(fù)，造成呼吸鏈功能受損，進(jìn)一步積累ROS【28】，而線粒體內(nèi)外膜的破裂可使一些受損傷的mtDNA擴(kuò)散到胞漿中，引起核酸含量的降低。Cytc從破裂的線粒體中釋放出來，導(dǎo)致線粒體呼吸鏈功能出現(xiàn)異常，引起ATP的減少，影響線粒體的呼吸作用【27】。

3.5 乙酸脅迫酵母離體線粒體拉曼光譜

圖6是提取酵母線粒體后，用20 mmol/L乙酸直接脅迫離體線粒體不同時(shí)間的拉曼光譜及特征峰強(qiáng)度變化趨勢(shì)圖。結(jié)果顯示，歸屬于核酸的譜峰（1081和1301 cm

），蛋白質(zhì)的譜峰（872，1445，1604和1657 cm

），脂類的譜峰（1125，1301，1445和1657 cm

），Cyt c的特征峰（1125 cm

）及線粒體呼吸特征峰（1604 cm

）均隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，與乙酸直接脅迫細(xì)胞后，提取線粒體測(cè)定其光譜的變化趨勢(shì)一致。提示乙酸直接脅迫細(xì)胞后，乙酸進(jìn)到胞內(nèi)可能直接作用于線粒體，造成生物大分子的流失。

圖6 20 mmol/L乙酸脅迫酵母離體線粒體不同時(shí)間拉曼光譜圖（a）及主要特征峰的強(qiáng)度變化趨勢(shì)（b， c）

Fig.6 Raman spectra of yeast mitochondria in vitro induced with 20 mmol/L of acetic acid in different times （a） and the trends of major band intensities （b and c）

3.6 乙酸脅迫酵母離體線粒體生理生化指標(biāo)

圖7是20 mmol/L乙酸脅迫酵母離體線粒體后，不同時(shí)間點(diǎn)的生理生化指標(biāo)。呼吸率、磷氧比（圖7a）和Cyt c含量（圖7b）隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，與圖6中呼吸特征峰1604 cm

和Cyt c特征峰1125 cm

的變化相似。MDA的含量（圖7b）隨著乙酸脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，與圖6中的拉曼譜峰變化趨勢(shì)相似。這些生理生化指標(biāo)與圖5結(jié)果一致。

圖7 20 mmol/L乙酸脅迫酵母離體線粒體后其不同時(shí)間點(diǎn)的生理生化指標(biāo)。（a）線粒體呼吸率（RCR）以及磷氧比（P/O），（b）MDA含量以及Cyt c含量。

Fig.7 Changes of RCR （a）， P/O （a）， MDA content （b），Cyt c concentration （b） of yeast mitochondria in vitro induced with 20 mmol/L of acetic acid in different times

4 結(jié) 論endprint

乙酸脅迫酵母細(xì)胞后提取線粒體，以及乙酸直接脅迫離體線粒體，歸屬核酸、蛋白質(zhì)、脂類、Cyt c、線粒體呼吸特征峰強(qiáng)度均隨著脅迫程度的加深而降低。表明在乙酸脅迫酵母細(xì)胞過程中，乙酸進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)可能直接作用于線粒體，導(dǎo)致線粒體膜脂質(zhì)過氧化程度加深，線粒體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)、脂類、Cyt c含量的降低，呼吸功能衰竭，出現(xiàn)依賴于線粒體途徑的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。LTRS可以作為一種非入侵性分析線粒體的有用工具。

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