徐婷,褚江洪,丁萍英,倪連松

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 臨海 317000)

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葛根素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用機(jī)理的探討

徐婷,褚江洪,丁萍英,倪連松Δ

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 臨海 317000)

目的 探討葛根素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用機(jī)理。方法 取40只雄性小鼠，分為5組：對(duì)照組、阿卡波糖對(duì)照組、葛根素(2.5、5.0、10)μM，每組8只，采用酶抑制動(dòng)力學(xué)方法，研究葛根素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用和抑制動(dòng)力學(xué)，并用分光光度計(jì)測(cè)定葛根素對(duì)小鼠血糖含量變化的影響。結(jié)果 葛根素是一種可逆的競(jìng)爭(zhēng)型α-葡萄糖苷酶抑制劑 [半抑制濃度IC50為(4.32±0.42)μM]，抑制常數(shù)Ki為(0.41± 0.09)μM；與陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖對(duì)比，葛根素能夠明顯的抑制大鼠血糖水平的增長(zhǎng)。結(jié)論 葛根素作為一個(gè)α-葡萄糖苷酶抑制劑，誘導(dǎo)了酶活性的降低，對(duì)調(diào)節(jié)血糖水平起到重要作用，為臨床降血糖提供了理論基礎(chǔ)。

葛根素；α-葡萄糖苷酶；抑制作用；血糖水平；糖尿病

糖尿病類(lèi)型主要有兩種：1型糖尿病和2型糖尿病，它們所引起癥狀幾乎是相同的[1]，但是所引起疾病的病理卻是有所差別的[2]。α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)種類(lèi)繁多，性質(zhì)各異，廣泛的分布在生物體內(nèi)，它可以從低聚糖類(lèi)的非還原末端切開(kāi)α-1,4糖苷鍵，釋放出葡萄糖[3]，在人類(lèi)的正常糖類(lèi)代謝和機(jī)體功能方面起到了重要的生理作用，但是當(dāng)人體內(nèi)血糖過(guò)高時(shí)，可以通過(guò)抑制α-glucosidase的活性來(lái)降低血糖的含量[4]，起到治療糖尿病及其并發(fā)癥的效果，因此，在醫(yī)藥行業(yè)中α-glucosidase抑制劑被廣泛用于預(yù)防和治療糖尿病、高血脂等疾病；

葛根素(puerarin)亦稱(chēng)葛根黃素，是從中藥葛根中分離的具有擴(kuò)冠作用的異黃酮類(lèi)衍生物，存在于豆科植物葛及野葛的根，具有退熱、鎮(zhèn)靜和使冠狀動(dòng)脈血流量增加的作用。有大量文獻(xiàn)表明，葛根素具有降低血糖的作用，但其作用機(jī)制以及活性組分的詳情尚不清楚。本課題葛根素為抑制劑，通過(guò)體外酶抑制實(shí)驗(yàn)并系統(tǒng)深入研究了其對(duì)α-glucosidase的相關(guān)抑制動(dòng)力學(xué)，并通過(guò)對(duì)灌胃的小鼠血糖值的抑制作用研究，最終獲取葛根素對(duì)α-glucosidase的抑制機(jī)理，以期為其在降血糖醫(yī)藥領(lǐng)域的更有效應(yīng)用提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 將禁食16 h的雄性小鼠40只(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào):SGXK(滬)2013-0010)，分為5組，每組8只，(第一組為對(duì)照組，第二組為阿卡波糖對(duì)照組，第3組～第5組為葛根素的3個(gè)濃度組)。

1.2 儀器與試劑 UV-2450紫外、可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；pHs-3C型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)；Millipore Simplicity水純化系統(tǒng)(法國(guó)密理博公司)；血糖測(cè)定試劑盒(蘭州生物化學(xué)試劑公司)。

α-葡萄糖苷酶從面包酵母中得到(上海TCI公司)，其標(biāo)準(zhǔn)溶液用pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行配制；對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)、阿卡波糖(Sigma公司)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行配制；葛根素(阿拉丁試劑有限公司)；其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葛根素對(duì)α-glucosidase的抑制作用：α-glucosidase活性的測(cè)定參考Ohta[5]的方法，α-glucosidase催化pNPG產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚(在處有特征吸收峰)，因此本研究利用UV-2450紫外分光光度計(jì)的動(dòng)力學(xué)/時(shí)間軟件測(cè)定在405 nm處的紫外吸收(酶催化pNPG生成對(duì)硝基苯酚)，在37 ℃下，pH 7.0的磷酸鹽(0.5 mM)緩沖體系中，α-glucosidase(1.0 μM)和不同濃度的葛根素孵化3 h，加pNPG(0.5 mM)后，每隔30 s在405 nm處測(cè)定吸光值的變化，并通過(guò)下列關(guān)系式對(duì)α-glucosidase活性進(jìn)行評(píng)估活性抑制測(cè)定重復(fù)3次。抑制率(%)=[ΔAbs540(空白)-ΔAbs540(樣品)/ΔAbs540(空白)]×100%。

1.3.2 葛根素對(duì)α-glucosidase的抑制動(dòng)力學(xué)研究：在上述實(shí)驗(yàn)條件下，固定α-glucosidase的濃度，測(cè)定不同葛根素濃度條件下，底物濃度對(duì)α-glucosidase催化速率的影響，根據(jù)Lineweaver Burk雙倒數(shù)圖，計(jì)算并評(píng)估葛根素對(duì)α-glucosidase的抑制作用類(lèi)型，最終求出抑制常數(shù)Ki抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 葛根素對(duì)小鼠血糖含量的影響：對(duì)照組：用灌胃器吸取0.1～0.2 mL suerose (2 g/kg)溶液灌入第一組小鼠的胃中，15 min后再灌入同樣體積的雙重蒸餾水，之后從灌入雙重蒸餾水以后開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別在30，60，120 min時(shí)以斷尾取血的方法對(duì)小鼠的血糖值進(jìn)行測(cè)定。第2組～第5組將對(duì)照組中的雙重蒸餾水分別替換為阿卡波糖(10 μM)，葛根素(2.5, 5.0, 10 μM)，其他組份不變。測(cè)定血糖時(shí)，將每組每只小鼠不同的時(shí)間點(diǎn)都需進(jìn)行編號(hào)，并將血液收集在離心管中，然后進(jìn)行離心3000 r/min，時(shí)間為15～20 min左右，最后收集管中上層的血清，用分光光度計(jì)進(jìn)行比色測(cè)定血糖含量測(cè)定重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 葛根素對(duì)α-glucosidase的抑制活性 圖1為葛根素的分子結(jié)構(gòu)式。圖2顯示，隨著葛根素濃度的增加(0～20 μM)，抑制率在不斷升高，隨著葛根素的濃度達(dá)繼續(xù)增加，對(duì)α-glucosidase的抑制能力的趨于平緩，解析其半數(shù)抑制濃度(IC50)為(4.32±0.42)μM，與陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖(IC50)為(18.12±1.15)μM相比，葛根素對(duì)α-glucosidase的半抑制濃度低于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖，表現(xiàn)出了良好的α-glucosidase抑制活性。

圖1 葛根素的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of puerarin

圖2 葛根素抑制α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of puerarin on α-glucosidase

2.2 葛根素對(duì)α-glucosidase抑制動(dòng)力學(xué)研究 通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程作圖，求得和比較酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)表觀米氏常數(shù)(Kmapp)和最大反應(yīng)速率(Vmax)，Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖 (圖3)是相交于縱坐標(biāo)的一組直線(xiàn)，這表明體系中Vmax保持不變，而Kmapp逐漸增大，這是典型的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用類(lèi)型[6]。這表明葛根素可能會(huì)結(jié)合到α-glucosidase的活性中心區(qū)域并與周?chē)陌被釟埢l(fā)生相互作用，一方面會(huì)與底物競(jìng)爭(zhēng)活性位點(diǎn)，另一面會(huì)誘導(dǎo)酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化是酶自身的催化活性降低。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)二級(jí)曲線(xiàn)方程，求得抑制常數(shù)Ki=(0.41± 0.09)μM。

圖3 葛根素抑制α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲線(xiàn)Fig.3 Lineweaver-Burk plot for inhibition of puerarin on α-glucosidasec(葛根素)/(μM), 從下向上：0, 2.5, 5.0, 10.(n=3).

圖4 葛根素對(duì)血糖水平增長(zhǎng)的抑制作用Fig.4 The inhibition of puerarin on the increase of blood glucose levels

2.3 葛根素對(duì)小鼠血糖含量的影響 結(jié)果顯示，用蔗糖灌胃后的小鼠再用葛根素灌胃，由圖4可以看出，葛根素對(duì)抑制血糖值的升高方面有顯著的劑量依賴(lài)性，在對(duì)照組中，當(dāng)加入蔗糖后，血糖值由74.66 mg/dL升高到179.54 mg/dL，而隨后又降了下來(lái)，在葛根素和陽(yáng)性對(duì)照這四組中，在給藥后30 min，小鼠的血糖值與對(duì)照組相比都出現(xiàn)了明顯的降低，葛根素(5 μM)與阿卡波糖(10 μM)表現(xiàn)出了相當(dāng)抑制作用。

3 討論

體內(nèi)胰島素分泌不足所導(dǎo)致的一系列臨床綜合癥稱(chēng)之為糖尿病，這是一種與遺傳基因有著非常密切的疾病。多飲、多尿、多食和體重下降(三多一少)為糖尿病的主要臨床表現(xiàn)，此外其病理檢測(cè)手段主要是依據(jù)血糖高、尿液中含有葡萄糖等現(xiàn)象，而糖尿病所引起的并發(fā)癥[7-9]給人們的生理和心理上都造成了巨大的傷害，故安全，有效的降血糖藥物的開(kāi)發(fā)越來(lái)越受到專(zhuān)家和學(xué)者的重視。糖尿病的的主要類(lèi)型分為:1型和2型兩種，1型糖尿病始于體內(nèi)胰腺中胰島β-細(xì)胞產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)，黃酮類(lèi)物質(zhì)能改善這類(lèi)糖尿病的病癥，此外，黃酮類(lèi)物質(zhì)還能通過(guò)許多途徑激發(fā)出弱的胰島素效應(yīng)，比如影響磷酸蛋白激酶，α-glucosidase來(lái)降低血糖的活性。本研究可以初步推測(cè)：在降血糖方面，黃酮發(fā)揮了主要作用，在8種黃酮中，7種黃酮具有α-glucosidase抑制活性。

目前，Acarbose是常用于臨床輔助治療的α-glucosidase抑制劑，但是它會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生很強(qiáng)的毒副作用[1]，故不能被全部人群所接受，而新的化學(xué)合成藥物需要的步驟較繁瑣、毒性大和效率低等弊端顯著，這就使得開(kāi)發(fā)出具有低毒性、來(lái)源于藥用植物的新型α-glucosidase抑制劑迫在眉睫，而且這也是迫切需要和亟需解決的問(wèn)題。多種中草藥的提取液中進(jìn)行α-glucosidase活性的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，五味子、桑葉、大黃、虎杖等[10-11]對(duì)α-glucosidase具有良好的抑制效果；食品中含有很多功能性因子具有降血糖的功能，研究發(fā)現(xiàn)，豆制品包括豆鼓和腐乳等對(duì)α-glucosidase有較強(qiáng)的抑制活性[12]，這可能是由于豆制品自身的降血糖功能因子和微生物發(fā)酵物[13]共同對(duì)α-glucosidase抑制的結(jié)果。Kwon等[14]研究了8種茄子提取物對(duì)α-glucosidase活性的抑制作用，研究發(fā)現(xiàn)，茄子中酚類(lèi)分子的含量會(huì)直接影響到α-glucosidase活性的抑制大小。此外，烏龍茶、沙丁魚(yú)活性多肽以及食品添加劑D-木糖都對(duì)α-glucosidase具有良好的抑制作用。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，葛根素表現(xiàn)出了良好的α-glucosidase抑制效果，且這種抑制作用具有濃度依賴(lài)性，隨后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葛根素能夠顯著的降低飯后小鼠的血糖，這很可能是由于黃酮類(lèi)化合物的構(gòu)效效應(yīng)引起的；此外葛根素具有多種藥理活性，且其低毒性的特點(diǎn)對(duì)引起人體的的副作用的概率大大降低，很值得臨床推廣。

國(guó)內(nèi)外研究表明[15-16]，抑制劑對(duì)相關(guān)疾病有關(guān)的酶的抑制作用呈現(xiàn)可逆的競(jìng)爭(zhēng)性作用時(shí)，這時(shí)可以根據(jù)酶活性的高低，通過(guò)有效的控制抑制劑藥物的劑量，來(lái)高選擇性、可逆的降低酶的活性，而不是使酶徹底的失活，而引起其他不良反應(yīng)，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)葛根素是典型的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，這表明葛根素會(huì)以非共價(jià)力，高選擇性的結(jié)合到α-glucosidase的活性中心，可逆與底物競(jìng)爭(zhēng)活性位點(diǎn)，從而達(dá)到抑制的效果；除上述所列出的α-glucosidase抑制劑類(lèi)型外，還有包括動(dòng)物和微生物來(lái)源的抑制劑等。雖然現(xiàn)在很多合成藥物在臨床糖尿病的治療中起到了很好的治療效果，但是對(duì)人體的毒副作用也是不可小視的。例如，此類(lèi)藥物服用一段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)腸鳴音亢進(jìn)的反應(yīng)，還會(huì)出現(xiàn)腹痛、腹脹、排氣增多等胃腸功能的紊亂和皮膚反應(yīng)[17]。因此天然植物來(lái)源的抑制劑越來(lái)越來(lái)成為降血糖藥物開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)，然而植物成分的藥理藥效不明，會(huì)制約了降血糖藥物的開(kāi)發(fā)，因此探討天然活性成分對(duì)α-glucosidase抑制機(jī)理的研究也是現(xiàn)在迫切需要的，本課題中的研究表明葛根素是一種可逆的競(jìng)爭(zhēng)型α-glucosidase,誘導(dǎo)了酶活性的降低；與陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖對(duì)比，葛根素能夠明顯的抑制大鼠血糖水平的增長(zhǎng)，對(duì)調(diào)節(jié)血糖水平起到重要作用，為臨床降血糖提供了理論基礎(chǔ)。

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(編校：譚玲)

Study of the inhibitive mechanism of puerarin on α-glucosidase

XU Ting,CHU Jiang-hong,DING Ping-ying,NI Lian-songΔ

(Department of Endocrinology, Taizhou Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University, Lin hai 317000, China)

ObjectiveTo study the inhibitory mechanism of puerarin on α-glucosidase.Methods40 male mices were divided into 5 groups:control group,acarbose group, puerarin(2.5,5.0,10) μM group,8 mices in each group.Studied the inhibitory effect and inhibition kinetics of puerarin on α-glucosidase by enzyme inhibition kinetics method,and spectrophotometer was used to determine the effect of puerarin on blood glucose change in mices.ResultsPuerarin was a reversible competitive α-glucosidase inhibitor, the value half inhibition concentration (IC50) and inhibition constant (Ki) were obtained to be (4.32±0.42) μM and (0.41± 0.09) μM, respectively.Compared with acarbos,puerarin could inhibite the increase of the blood glucose levels. ConclusionPuerarin as a competitive α-glucosidase inhibitor, can reduce the enzyme actiuity, and play an important role in fall blood ylucose level.

puerarin; α-glucosidase; inhibitory effect; blood glucose levels; diabetes

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011KYA160)

徐婷，女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：糖尿病慢性并發(fā)癥及治療研究，E-mail：xutingdoc@163.com；倪連松，通訊作者，男，碩士，研究生導(dǎo)師，研究方向：糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制及治療研究，E-mail：412168451@qq.com。

R285

A

1005-1678(2015)01-0043-04