李想,田步先,閔連秋

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

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維生素D通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB活性對(duì)局灶性腦缺血大鼠的保護(hù)作用研究

李想,田步先,閔連秋

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

目的 探討維生素D(VD)通過(guò)調(diào)控NF-κB活性對(duì)局灶性腦缺血大鼠的保護(hù)作用。方法 72只SD大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組、對(duì)照組、VD缺乏組和VD治療組，每組18只。假手術(shù)組及對(duì)照組均給予正常飼料喂養(yǎng)。VD缺乏組給予維生素D缺乏飼料喂養(yǎng)。VD治療組給予補(bǔ)充維生素D飼料喂養(yǎng)。共喂養(yǎng)10周。除假手術(shù)組外，其余各組均建立局灶性腦缺血模型。對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。HE染色觀察梗死中心區(qū)及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)。免疫組化檢測(cè)細(xì)胞凋亡。電泳及免疫印跡觀察NF-κB蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組相比較，對(duì)照組、VD缺乏組及VD治療組的海馬CA1區(qū)NF-κB p65活性明顯升高(P<0.01)；與對(duì)照組相比，維生素D缺乏組NF-κB p65表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)，維生素D治療組NF-κB p65表達(dá)減弱(P<0.01)。結(jié)論 維生素D對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-κB活化發(fā)揮抗炎作用而實(shí)現(xiàn)的。

維生素D；腦缺血；NF-κB

近年來(lái)，隨著腦卒中疾病發(fā)病率逐年升高，發(fā)病年齡逐年下降，人們對(duì)腦卒中防治的研究逐步深入。有文獻(xiàn)報(bào)道，缺血性腦卒中患者約占腦卒中患者總數(shù)的80%。尋找到行之有效的減少或減慢腦缺血形成的措施，對(duì)于腦缺血的防治具有十分重要的臨床應(yīng)用意義。NF-κB是一種普遍存在的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，是由NF-κB/Rel蛋白家族成員組成的同源或異源二聚體。Nurmi等[1]研究證實(shí)，腦缺血發(fā)生后，NF-κB可被激活，促進(jìn)炎癥的發(fā)生、誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡、介導(dǎo)自由基的損傷，進(jìn)而加重腦缺血損傷。

維生素D是一種具有生物活性的脂溶性類固醇衍生物，包括維生素D2(麥角骨化醇)及維生素D3(膽骨化醇)2者。其中在人類和動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮主要生物作用的是維生素D3。此次研究應(yīng)用于治療組中的骨化三醇即為有活性的維生素D3。維生素D不僅在多種生理學(xué)過(guò)程起到關(guān)鍵的中介作用，而且對(duì)多種慢性疾病的發(fā)生發(fā)展起到調(diào)節(jié)作用[2]。近年來(lái)已有流行病學(xué)及臨床研究證實(shí)，人體內(nèi)維生素D水平與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)[3-4]。維生素D缺乏，可導(dǎo)致包括動(dòng)脈粥樣硬化在內(nèi)的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加[5]。最新研究證實(shí)，維生素D缺乏可能對(duì)心腦血管的功能產(chǎn)生不利影響，但并沒(méi)有結(jié)論性的研究支持這一觀點(diǎn)，心腦血管疾病的發(fā)生與維生素D含量關(guān)系的研究仍處于探索階段[6]。因此，本研究擬通過(guò)建立大鼠大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血模型，探討維生素D能否通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB活性對(duì)局灶性腦缺血大鼠發(fā)揮腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及主要試劑 采用健康成年SD雄性大鼠72只，體質(zhì)量250～280 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(遼)2003-0007。骨化三醇由上海羅氏制藥有限公司提供。NF-κB P65兔抗大鼠抗體及免疫組化染色試劑盒由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。蛋白定量試紙盒等免疫印跡試驗(yàn)試劑購(gòu)于上海銳賽生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥：72只實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將其隨機(jī)分成4組：假手術(shù)組、對(duì)照組、VD缺乏組和VD治療組，每組18只。VD治療組除給予正常鼠糧外，每天給予骨化三醇 0.3 μg/(kg·d)溶于丙二醇溶媒[7]灌胃。VD缺乏組給予維生素D缺乏飼料(包括：玉米面76%，小麥麩20%，碳酸鈣3%，碘化鹽1%，賴氨酸0.5%)，確保其中維生素D不超過(guò)20 IU/kg，并每天給予等劑量的蒸餾水灌胃。假手術(shù)組及對(duì)照組給予正常鼠糧及等劑量蒸餾水灌胃飼養(yǎng)。采用清潔飲用水，無(wú)紫外光的白熾燈光照，光暗周期12 h:12 h，飼養(yǎng)環(huán)境清潔。飼養(yǎng)10周。末次給藥后30 min建立腦缺血模型。

1.2.2 局灶性腦缺血模型的建立：在Longa[8]提出大腦中脈閉塞(MCAO)模型基礎(chǔ)上，采用其改進(jìn)方案[9]制備大鼠局灶性腦缺血模型。實(shí)驗(yàn)大鼠末次給藥30 min后，腹腔注射10%水合氯醛350 mL/kg麻醉。大鼠取仰臥位固定，行頸正中切口，依次鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。結(jié)扎左側(cè)CCA近心端和ECA分叉部，動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA遠(yuǎn)心端。在距CCA分叉處近心端約5 mm處剪口。選用頭端燒成光滑杵狀的國(guó)產(chǎn)尼龍線(直徑0.235 mm，長(zhǎng)6 cm)插入，系牢栓線。松開(kāi)動(dòng)脈夾。線栓進(jìn)入深度以頸總動(dòng)脈分叉處計(jì)算為(18.0±0.5)mm，此時(shí)輕推尼龍線有阻力感，即已到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始部，實(shí)現(xiàn)了對(duì)左側(cè)大腦中動(dòng)脈血流的阻斷。假手術(shù)組僅不插入線栓，余手術(shù)步驟同前。

參考Zea Longa法[10]對(duì)術(shù)后大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分。評(píng)分于大鼠清醒后的24 h內(nèi)進(jìn)行3次，最終取其平均值。

建模成功判斷標(biāo)準(zhǔn)[10]：①大鼠出現(xiàn)同側(cè)Horner征；②神經(jīng)功能缺失評(píng)分為1～3分者。剔除建模未成功的實(shí)驗(yàn)大鼠，并于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)充合格大鼠，以保證每組實(shí)驗(yàn)用鼠數(shù)目。

1.2.3 腦組織病理學(xué)標(biāo)本制備：分別在4個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，隨機(jī)各取出9只大鼠。于建模成功24 h后，以10%水合氯醛350 mL/kg進(jìn)行腹腔麻醉。經(jīng)對(duì)側(cè)頸總動(dòng)脈，先輸注冰生理鹽水50 mL及4%多聚甲醛50 mL，進(jìn)行灌流內(nèi)固定。立即斷頭取腦，并將腦組織在4%多聚甲醛中繼續(xù)固定24 h。制備冠狀腦片，選擇梗死中心進(jìn)行常規(guī)酒精脫水及石蠟包埋。制成4～6 μm厚的切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色。觀察梗死中心區(qū)及海馬CAl區(qū)存活的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目。

1.2.4 免疫組化測(cè)定NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：石蠟切片經(jīng)脫蠟至水及微波修復(fù)抗原。兔抗鼠NF-κB抗體，在4 ℃下孵育24 h。嚴(yán)格遵照SP法免疫組化試劑盒要求進(jìn)行操作，DAB顯色。以正常兔血清代替一抗作為陰性對(duì)照。光鏡下觀察大腦海馬CA1區(qū)NF-κB陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，染色陽(yáng)性反應(yīng)物為棕黃色顆粒。每只大鼠取1張相同部位缺血側(cè)大腦海馬CA1區(qū)切片進(jìn)行觀察。計(jì)算10個(gè)有代表性的高倍視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。CIAS-1000型圖像分析儀計(jì)算NF-κB的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并取平均值。

1.2.5 Western blot檢測(cè)大鼠海馬CA1區(qū)NF-κB蛋白的表達(dá)：取每組剩余的9只已成功建模的大鼠，斷頭取腦。將腦組織5 mg加入100 uL裂解液中，剪碎并機(jī)械勻漿。以4 ℃、17000 r/min離心20 min，取上清液，棄沉淀。用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取50 μg蛋白上樣進(jìn)行12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。濕轉(zhuǎn)法將電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉，抗體孵育。洗膜后進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色。以凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析測(cè)定目標(biāo)帶的密度值(density value，DV)，計(jì)算出各組目標(biāo)帶與β-actin DV比值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較 造模成功后對(duì)各組大鼠進(jìn)行評(píng)分：假手術(shù)組大鼠無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損，其余3組均有不同程度的神經(jīng)功能缺損，其中以VD缺乏組神經(jīng)功能缺損最嚴(yán)重，評(píng)分最高；VD治療組神經(jīng)功能缺損較對(duì)照組明顯減輕，評(píng)分低于對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 VD對(duì)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)影響±s)

**P<0.01與 假手術(shù)組相比，compared with sham-operative group；##P<0.01，與對(duì)照組相比, compared with control group；△△P<0.01，與VD缺乏組相比，compared with VD-deficient group

2.2 各組大鼠腦組織的病理學(xué)特征 光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色切片，假手術(shù)組僅可見(jiàn)正常神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)，其余3組均可見(jiàn)正常及不同損傷程度神經(jīng)元細(xì)胞混雜出現(xiàn)。正常神經(jīng)元，核圓形，邊界及核仁清楚。損傷神經(jīng)元，胞核腫大，偏位，核仁消失，胞漿著色淺、蒼白或核濃縮、深染，細(xì)胞呈三角形缺血性壞死變化。4組中，對(duì)照組及VD缺乏組損傷神經(jīng)元顯著增多，且以VD缺乏組的損傷神經(jīng)元特點(diǎn)表現(xiàn)的最為明顯；VD治療組中，維生素D能夠一定程度上改善神經(jīng)細(xì)胞的核深染、核固縮程度，減少細(xì)胞及間質(zhì)的水腫，使胞膜清楚、形態(tài)正常、核仁清晰可見(jiàn)的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增多。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠腦組織HE染色Fig.1 HE staining results of rat brain tissue

2.3 各組大鼠腦組織切片免疫組化染色結(jié)果比較 腦組織切片中如NF-κB p65蛋白陽(yáng)性表達(dá)，則胞漿或胞核中會(huì)顯示明顯棕褐色顆粒。在假手術(shù)組中，陽(yáng)性表達(dá)不明顯，僅在海馬皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)偶見(jiàn)；對(duì)照組中，陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目較假手術(shù)組上升，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；VD缺乏組中，陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目明顯高于其他各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，圖像顯示在皮層、海馬區(qū)神經(jīng)元胞內(nèi)均可見(jiàn)大量棕褐色顆粒，其中部分細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)物；VD治療組中，陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目低于對(duì)照組和VD缺乏組，但高于假手術(shù)組(P<0.01)。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 各組大鼠CA1區(qū)NF-κB p65蛋白表達(dá)的免疫組化染色結(jié)果(×400) Fig.2 Immunohistochemical staining results of NF-κB p65 protein expression in CA1 region of each group(×400)

組別例數(shù)NF-κBp65蛋白(/HPF)假手術(shù)組910.11±1.05對(duì)照組951.22±3.23**VD缺乏組972.22±4.66**##VD治療組923.56±3.64**##△△

**P<0.01與假手術(shù)組相比，compared with sham-operative group；##P<0.01，與對(duì)照組相比, compared with control group；△△P<0.01，與VD缺乏組相比，compared with VD-deficient group

2.4 Western-blot法檢測(cè)NF-κB蛋白表達(dá)水平 與假手術(shù)組相比較，對(duì)照組、VD缺乏組及VD治療組NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)。與對(duì)照組相比，VD缺乏組NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，VD治療組NF-κB蛋白表達(dá)降低(P<0.01)。見(jiàn)圖3、表3。

圖3 VD對(duì)大鼠腦缺血后海馬CA1區(qū)NF-кB表達(dá)的影響Fig.3 Effect of VD on NF-κB p65 protein expression in CA1 region of focal cerebral ischemia rats

組別例數(shù)NF-κBp65蛋白(/HPF)假手術(shù)組9132.56±7.33對(duì)照組9433.89±10.07**VD缺乏組9504.67±11.07**##VD治療組9382.00±9.14**##△△

**P<0.01與 假手術(shù)組相比，compared with sham-operative group；##P<0.01，與對(duì)照組相比, compared with control group；△△P<0.01，與VD缺乏組相比，compared with VD-deficient group

3 討論

維生素D作為一種脂溶性維生素，不僅可以調(diào)節(jié)鈣磷代謝，還可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞增殖、分化的調(diào)節(jié)，以及維持腦部細(xì)胞的發(fā)育及功能，進(jìn)而參與腦血管病的病理生理過(guò)程。在哥本哈根城市心臟研究中，經(jīng)過(guò)歷時(shí)30年的隨訪觀察，最終于2013年發(fā)表的研究結(jié)果表明：隨著血清中維生素D3濃度的減少，缺血性癥狀性腦卒中風(fēng)險(xiǎn)逐步增加。血清維生素D3水平最低的5%的個(gè)體較平均水平之上的個(gè)體發(fā)生缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)高出82%[11]；而血清中維生素D3濃度與出血性腦卒的發(fā)病率并無(wú)明顯相關(guān)性。類似的結(jié)論在Gotaro Kojima等[12]的夏威夷心臟研究項(xiàng)目中也有相似的發(fā)現(xiàn)。研究證實(shí)，低水平的維生素D3是致死性腦卒中的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，維生素D缺乏組大鼠局灶性腦缺血后，神經(jīng)功能評(píng)分明顯高于其他組別，且HE染色腦片中可見(jiàn)明顯核濃縮、深染，并出現(xiàn)較多三角形缺血性壞死細(xì)胞，表明維生素D的缺乏與腦缺血的發(fā)生有可能存在相關(guān)性。而接受維生素D治療的大鼠，神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分要優(yōu)于對(duì)照組，且HE染色中神經(jīng)細(xì)胞核深染、核固縮的程度明顯改善，細(xì)胞及間質(zhì)的水腫較對(duì)照組有所減輕，部分細(xì)胞可見(jiàn)胞膜或核仁清晰、形態(tài)正常，表明維生素D的干預(yù)可減輕或預(yù)防腦缺血的癥狀或發(fā)生，進(jìn)而證實(shí)了維生素D對(duì)缺血性腦卒中的保護(hù)作用。

NF-κB幾乎存在于所有細(xì)胞中，是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子。主要是多肽p50及p65亞基形成的同源及異源二聚體，其中p65亞基具有轉(zhuǎn)錄激活功能，在細(xì)胞轉(zhuǎn)化、調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中，NF-κB主要存在于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中。有研究顯示，NF-κB是血管內(nèi)皮受損的始動(dòng)機(jī)制之一。Clemens實(shí)驗(yàn)證實(shí)，腦缺血發(fā)生后，在腦梗死病灶及周圍，不僅處于靜息狀態(tài)下的NF-κB被激活，而且也增強(qiáng)了NF-κB在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上的表達(dá)[14]。腦缺血時(shí)，炎癥細(xì)胞因子高表達(dá)，活化的NF-κB誘導(dǎo)細(xì)胞因子、黏附因子、炎性酶類的表達(dá)[15]、氧自由基形成及鈣超載，引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而加重腦損傷。

Giarratana等[16]應(yīng)用胰島細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)維生素D類似物能夠通過(guò)下調(diào)IκBα的轉(zhuǎn)錄及NF-κB P65核移位，進(jìn)而顯著下調(diào)促炎趨化因子的生成，抑制炎癥反應(yīng)。本研究也發(fā)現(xiàn)，通過(guò)免疫組化及Western blot，假手術(shù)組NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)不明顯，而對(duì)照組、VD缺乏組及VD治療組均有不同程度的陽(yáng)性表達(dá)，支持目前已有研究結(jié)論，即腦缺血時(shí)NF-κB被激活。與對(duì)照組相比較，維生素D缺乏組NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目明顯升高，而維生素D治療組陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組有所下降，證實(shí)缺乏維生素D時(shí)，可加重NF-κB的激活，進(jìn)而加重腦缺血損傷；而接受維生素D干預(yù)的大鼠，NF-κB激活數(shù)目有所減少，提示維生素D可抑制NF-κB被激活，抑制炎癥反應(yīng)過(guò)程，進(jìn)而通過(guò)對(duì)NF-κB通路的阻礙對(duì)腦缺血大鼠起到保護(hù)作用。

隨著對(duì)維生素D作用機(jī)制的深入研究，有望為缺血性腦損傷的治療開(kāi)辟新的途徑，為其防治缺血性腦血管病提供理論依據(jù)。

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(編校：吳茜)

Protective effect of Vitamin D on focal cerebral ischemia rats by regulating the activity of NF-κB

LI Xiang,TIAN Bu-xian,MIN Lian-qiu

(Department of Neurology, The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of vitamin D on focal cerebral ischemia rats by regulating the activity of NF-κB.Methods72 male SD rats were randomly divided into sham-operative group, control group, VD-deficient group and VD-sufficient group,each had 18 rats.Rats in sham-operative group and control group received normal diet.Rats in VD-deficient group received VD-deficient diet.Rats in VD-sufficient group received VD-sufficient diet.The MCAO model was made after each group pretreated for 10 weeks.Surgical procedures of sham-operative group was the same as the above, but no thread inserted.Neuroethology evaluations for each group of rats and the cerebral pathological conformation were observed by HE staining.The expressions of nuclear factor-kappa B(NF-кB)detected by immunohistochemical and Western blot.ResultsThe neurological severity score in VD-sufficient group was lower than that in control group(P<0.01); the expression of NF-кB in VD-deficient group was highest than others (P<0.01), and the expression of NF-кB in VD-sufficient group was lower than that in control group (P<0.01). ConclusionVD has the protective effect on focal cerebral ischemia rats, and the mechanism may be related with the decreasing of NF-кB expression.

vitamin D; cerebral ischemia; NF-κB

遼寧省自然科學(xué)基金(20092192)；遼寧省科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目(2012225019)

李想，女，在讀碩士，研究方向：腦缺血的基礎(chǔ)研究，E-mail：mia.1988@live.cn；閔連秋，通訊作者，女，碩士，教授、主任醫(yī)師，研究方向：腦血管疾病，E-mail：minlianqiu@163.com。

R743.31

A

1005-1678(2015)01-0006-04