陸鴻略,米洋,梁媛,康菲

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科，河北 承德 067000;2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 體檢科，河北 承德 067000)

?

鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌中PCNA和C-erbB-2的表達(dá)及臨床意義研究

陸鴻略1,米洋1,梁媛1,康菲2

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科，河北 承德 067000;2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 體檢科，河北 承德 067000)

目的 探討鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌中增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和原癌基因蛋白質(zhì)(oncogene protein,C-erbB-2)的表達(dá)情況及臨床意義。方法 利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)45例鼻腔鼻竇鱗癌的PCNA和C-erbB-2的表達(dá)情況，并選擇15例正常鼻腔黏膜作為正常對(duì)照。結(jié)果 各級(jí)鼻腔鼻竇鱗癌之中，PCNA和C-erbB-2均有表達(dá)，與正常對(duì)照鼻腔黏膜相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且有隨鱗癌分級(jí)升高表達(dá)不斷增強(qiáng)的趨勢(shì)。但在鱗癌中的表達(dá)，PCNA和C-erbB-2不存在顯著的相關(guān)性。結(jié)論 PCNA和C-erbB-2的表達(dá)均能夠反映出鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌的增殖活性，且其表達(dá)強(qiáng)度可以反映出鱗癌細(xì)胞的增殖活性高低。

鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌；增殖細(xì)胞核抗原；原癌基因蛋白質(zhì)

鼻腔及鼻竇惡性腫瘤是一種臨床較為常見(jiàn)的疾病，且最為常見(jiàn)的是鱗狀細(xì)胞癌[1]。鼻腔鼻竇惡性腫瘤的發(fā)病可能與外傷以及長(zhǎng)期接觸各種致癌物質(zhì)，還有反復(fù)炎癥刺激等因素有關(guān)[2]。惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，涉及到多種因素和多基因突變的長(zhǎng)期、分階段過(guò)程[3]。但就目前的研究情況來(lái)看，關(guān)于鼻腔鼻竇惡性腫瘤的分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制尚不夠清楚。本研究中，筆者利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)45例鼻腔鼻竇鱗癌的增殖細(xì)胞(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和原癌基因蛋白質(zhì)(oncogene protein,C-erbB-2)，探討鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌中PCNA和C-erbB-2的表達(dá)情況及臨床意義?，F(xiàn)將本研究相關(guān)結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 45例鼻腔鼻竇鱗癌標(biāo)本均為承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)切除或活檢的存檔標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋。標(biāo)本來(lái)源患者中，男34例，女11例，年齡22～78歲，平均年齡(51.1±2.3 )歲。所有入選標(biāo)本均再作常規(guī)切片，行蘇木精(hematoxylin，HE)染色，與原始切片對(duì)照診斷無(wú)誤。并選擇15例正常鼻腔粘膜作為正常對(duì)照，男9例，女6例，年齡23～79歲，平均年齡(52.8±1.37)歲。

1.2 方法

1.2.1 試劑：鼠抗人PCNA單克隆抗體(PCIO)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、兔抗人C-erbB-2多克隆抗體(上海領(lǐng)成生物科技有限公司)和LSAB試劑盒(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)。兔抗鼠和豬抗兔生物素抗體(上海齊瑞生物技術(shù)有限公司)；鏈霉親和素(streptavidim,SA)購(gòu)自廣州天寶頃原生物科技開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2.2 檢測(cè)方法：所有標(biāo)本均切片，常規(guī)脫蠟至水化。利用蒸餾水進(jìn)行沖洗，并加緩沖液浸泡。滴加正常血清。于室溫下放置0.5 h后取出多余血清，并分別加兔抗人c-erbB-2多克隆抗體和鼠抗人PCNA單克隆抗體(PCIO)，于室溫下放置0.5 h后加緩沖液沖洗并浸泡。分別加1:100兔抗鼠和豬抗兔生物素化抗體，于室溫下孵育0.5 h后加緩沖液沖洗并浸泡。然后加1:400 SA于室溫下孵育0.5 h后加緩沖液沖洗并浸泡，利用DAB進(jìn)行顯色處理。利用流動(dòng)水進(jìn)行沖洗后使用蘇木素進(jìn)行復(fù)染，再次流水沖洗，并逐級(jí)進(jìn)行乙醇脫水，二甲苯透明。最終，利用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片處理。正常對(duì)照標(biāo)本利用TBS來(lái)代替一抗。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 利用低倍鏡于腫瘤細(xì)胞密集處進(jìn)行觀察，選擇5～8個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，取均數(shù)。按照陽(yáng)性細(xì)胞在視野細(xì)胞總數(shù)中所占的比例進(jìn)行結(jié)果判定，其中C-erbB-2：-：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為0；+：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤25%；++：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為26%～50%；+++：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>51%。PCNA：+：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤25%；++：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為26%～50%；+++：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51%～75%；++++：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>75%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，

2 結(jié)果

2.1 PCNA和C-erbB-2在鼻腔鼻竇鱗癌和正常鼻腔黏膜中的表達(dá)情況比較 經(jīng)檢驗(yàn)，C-erbB-2在鼻鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞核染成棕色顆粒。Ⅰ級(jí)鱗癌中，陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在癌巢周?chē)幕准?xì)胞區(qū)，癌巢中的棘細(xì)胞數(shù)量較少，且隨著組織學(xué)分級(jí)的升高，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例更高。Ⅲ級(jí)鱗癌時(shí)，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞遍布于整個(gè)癌細(xì)胞團(tuán)塊中、條索中(見(jiàn)圖1)。

圖1 C-erbB-2在鼻鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá) (×400)Fig.1 Expression of C-erbB-2 in nasal squarmous cell carcinoma(×400)

C-erbB-2在不同級(jí)別鱗癌中的表達(dá)率分別為53.5%、60.0%、67.7%。正常對(duì)照組未出現(xiàn)著色現(xiàn)象，經(jīng)χ2檢驗(yàn)P<0.05，且趨勢(shì)χ2檢驗(yàn)P<0.05。在鱗癌Ⅰ級(jí)中，陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在癌巢周?chē)幕准?xì)胞區(qū)，癌巢中的棘細(xì)胞數(shù)量較少。隨著組織學(xué)分級(jí)的升高，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例更高。Ⅲ級(jí)時(shí)，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞遍布在整個(gè)癌細(xì)胞團(tuán)塊中、條索中(見(jiàn)圖2)。

圖2 PCNA在鼻鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá) (×400)Fig.2 Expression of PCNA in nasal squamous cell carcinoma(×400)

按照PCNA染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行分組，分為低表達(dá)(+、++)和高表達(dá)(+++、++++)2組，并將正常黏膜均視為低表達(dá)，則鱗癌不同級(jí)別中的高表達(dá)分別為46.7%、73.3%、86.7%，正常對(duì)照組未出現(xiàn)著色現(xiàn)象，經(jīng)χ2檢驗(yàn)P<0.05，且趨勢(shì)χ2檢驗(yàn)P<0.05。見(jiàn)表1。

表1 PCNA和C-erbB-2在鼻腔鼻竇鱗癌和正常鼻腔黏膜中的表達(dá)情況比較(n=15)

2.2 PCNA和C-erbB-2表達(dá)的相互關(guān)系分析 在鱗癌中的表達(dá)，PCNA和C-erbB-2均過(guò)度表達(dá)，且與鱗癌的分化程度有一定關(guān)系。但2者在鼻腔鼻竇鱗癌中的表達(dá)經(jīng)χ2檢驗(yàn)不存在顯著的相關(guān)性，表達(dá)強(qiáng)度亦無(wú)明顯的聯(lián)系(r=0.51，P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 PCNA和C-erbB-2表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

鼻腔及鼻竇鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，可能與反復(fù)炎癥刺激、長(zhǎng)期接觸致癌物質(zhì)、良性腫瘤惡變、外傷等因素有關(guān)。而且，惡性腫瘤的發(fā)生受到多種因素影響、多基因突變導(dǎo)致的長(zhǎng)期的、分階段的過(guò)程。

對(duì)不同的細(xì)胞而言，細(xì)胞增殖是其生命的基本特征，并與機(jī)體的生長(zhǎng)、生理性再生、創(chuàng)傷修復(fù)、細(xì)胞程序性死亡以及各種惡性腫瘤的發(fā)生之間存在十分密切的關(guān)系。腫瘤的增殖活動(dòng)會(huì)對(duì)其生物學(xué)行為、臨床過(guò)程和對(duì)治療的反應(yīng)等多方面產(chǎn)生影響，因此，通過(guò)對(duì)各種腫瘤細(xì)胞增殖期標(biāo)志物的檢測(cè)可以準(zhǔn)確客觀反映腫瘤的增殖潛能。目前關(guān)于鼻腔鼻竇惡性腫瘤的分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，而PCNA和C-erbB-2和重要的反應(yīng)細(xì)胞增值活性的標(biāo)志物，可以用來(lái)對(duì)疾病情況進(jìn)行評(píng)估等，因此被廣泛應(yīng)用于對(duì)鼻腔及鼻竇鱗狀細(xì)胞癌的臨床檢測(cè)之中[4-5]。C-erbB-2原癌蛋白又被稱(chēng)為neu或者HER-2基因，原本是細(xì)胞正常生命活動(dòng)的必要蛋白，然而其發(fā)生結(jié)構(gòu)變異或過(guò)度表達(dá)時(shí)則往往導(dǎo)致癌變[6]。C-erbB-2過(guò)度表達(dá)見(jiàn)于多種惡性腫瘤，具有較強(qiáng)的免疫原性，并定位于細(xì)胞膜表面的特性。C-erbB-2基因所編碼的蛋白是分子量為185kDa的穿膜蛋白，可以抑制酪氨酸激酶活性，該基因的過(guò)度表達(dá)和擴(kuò)增可見(jiàn)于多種腫瘤，與腫瘤的分化程度和分級(jí)有密切關(guān)系。在機(jī)體處于正常狀態(tài)的時(shí)候，C-erbB-2原癌蛋白處于非激活狀態(tài)，并參與到機(jī)體的多種活動(dòng)之中，例如細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分化調(diào)節(jié)等[7-8]。在正常的組織中，C-erbB-2原癌蛋白表達(dá)大多發(fā)生在上皮細(xì)胞膜。但如果人體出現(xiàn)異常，便會(huì)出現(xiàn)C-erbB-2異常表達(dá)的情況[9]。有學(xué)者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)[10]，如果采用免疫組化SP法檢測(cè)乳腺癌組織中C-erbB-2表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析，可以發(fā)現(xiàn)C-erbB-2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體、孕激素受體相關(guān)，并認(rèn)為，C-erbB-2檢測(cè)對(duì)判斷乳腺癌預(yù)后有重要意義。本次研究結(jié)果顯示，各級(jí)鼻腔鼻竇鱗癌之中C-erbB-2均有表達(dá)，較之正常對(duì)照鼻腔黏膜差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且有隨鱗癌分級(jí)升高表達(dá)不斷增強(qiáng)的趨勢(shì)。即說(shuō)明，C-erbB-2參與到了細(xì)胞增殖過(guò)程，在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面發(fā)揮出重要的作用，其反常表達(dá)可能與鱗癌細(xì)胞的惡性發(fā)展之間存在一定的關(guān)系。PCNA是一種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，參與到了DNA的合成過(guò)程。PCNA在核中的水平從G1，后期開(kāi)始上升，先于DNA的合成，S期達(dá)到高峰，G2期開(kāi)始下降，M期和靜止期維持最低水平。PCNA 被認(rèn)為是多種細(xì)胞內(nèi)過(guò)程的聯(lián)系點(diǎn)，包括細(xì)胞周期控制、DNA復(fù)制、核苷酸切除修復(fù)、復(fù)制后錯(cuò)配修復(fù)、堿基切除修復(fù)和至少一種凋亡途徑等[11-12]。PCNA的表達(dá)程度可以較為直觀的反應(yīng)出不同腫瘤的增殖活性。趙醒[13]等應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法分別檢測(cè)150例食管鱗癌組織和35例正常食管黏膜組織(距離癌灶邊緣5 cm以上經(jīng)病理證實(shí))中PCNA蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCNA蛋白在正常食管黏膜組織中的表達(dá)明顯低于食管鱗癌組織(P<0.05)。并認(rèn)為，PCNA蛋白過(guò)表達(dá)可能與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展以及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本次研究結(jié)果顯示，各級(jí)鼻腔鼻竇鱗癌之中，PCNA均有表達(dá)，較之正常對(duì)照鼻腔黏膜差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且有隨鱗癌分級(jí)升高表達(dá)不斷增強(qiáng)的趨勢(shì)。即說(shuō)明，腫瘤細(xì)胞分裂、增殖十分活躍，PCNA蛋白的表達(dá)也隨之出現(xiàn)顯著增強(qiáng)的情況，表明PCNA可能與鱗癌細(xì)胞的惡性發(fā)展之間存在一定的關(guān)系，提示臨床可以將PCNA作為對(duì)鼻腔鼻竇鱗癌惡性程度進(jìn)行判定的生物學(xué)指標(biāo)之一。本次研究結(jié)果還顯示，在鱗癌中的表達(dá)，PCNA和C-erbB-2經(jīng)χ2檢驗(yàn)不存在顯著的相關(guān)性。但2者均出現(xiàn)過(guò)度表達(dá)的情況，且與鼻腔鼻竇鱗癌的分化程度之間存在一定的關(guān)系。即說(shuō)明，PCNA和C-erbB-2可能通過(guò)不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，并積極的參與到鼻腔鼻竇鱗癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中。另外，本研究利用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行PCNA和C-erbB-2表達(dá)情況的檢測(cè)，獲得了良好的研究結(jié)果。但是，所使用的病理標(biāo)本可能受到存檔蠟塊時(shí)間的影響而出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表面抗原丟失的情況[14]。因此可能存在抗原分布不均的現(xiàn)象，導(dǎo)致一定研究誤差的出現(xiàn)。因此，本研究還存在一些缺陷和不足，還需要在今后的研究中予以不斷完善。

綜上所述，PCNA和C-erbB-2的表達(dá)均能夠反映出鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌的增殖活性，且其表達(dá)強(qiáng)度可以反映出鱗癌細(xì)胞的增殖活性高低。提示PCNA和C-erbB-2在鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中起到了一定的作用，可以用來(lái)對(duì)臨床治療和預(yù)后等提供一定的參考依據(jù)。

[1] 馬健.胃腫瘤中EGFR、C-erbB-2和PCNA的表達(dá)及其臨床意義[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15(12)：2058-2060.

[2] 應(yīng)功武，邵偉.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤組織中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，10(32)：45-47.

[3] 張宗敏，唐平章，徐震綱，等.鼻腔篩竇鱗狀細(xì)胞癌146例治療分析[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2010，45(7)：555-559.

[4] 張艷，梁耕田，孫廣濱，等.鼻咽癌中表皮生長(zhǎng)因子受體、C-erbB-2表達(dá)及其與細(xì)胞增殖的關(guān)系[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2011，25(2)：67-70.

[5] 賈宗良，林子晶，車(chē)向明，等.乳腺癌癌旁組織中PCNA、C-erbB-2、p53、ER、PR基因的表達(dá)[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，31(2)：212-216.

[6] 唐智，孫瑾，王繼群，等.鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌中以CD34標(biāo)記微血管密度的測(cè)定[J].廣東醫(yī)學(xué)，2013，34(22)：3443-3445.

[7] 李利紅，董雪蕾，田秀芬，等.PRL-3和EGFR在鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46(4)：366-369.

[8] 韓振強(qiáng)，王建國(guó).血清鱗狀細(xì)胞癌抗原在鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌患者中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，10(12)：39-40，43.

[9] 王勝資，陳浮，李驥，等.現(xiàn)代放療技術(shù)下鼻腔鼻竇惡性腫瘤轉(zhuǎn)歸分析[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2011，25(14)：636-640，644.

[10] 張繼運(yùn)，沙新海，于明濤，等.C-erbB-2、p53、Ki-67及VEGF在乳腺癌中的表達(dá)及相關(guān)性[J].實(shí)用癌癥雜志，2012，27(3)：241-243.

[11] 王毅，解衛(wèi)平，王虹，等.Iptakalim對(duì)低氧誘導(dǎo)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及TGF-β和PCNA表達(dá)的影響[J].中國(guó)生化藥物雜志，2010，31(3)：158-161.

[12] 謝青，王進(jìn)，王菊英，等.依托泊苷對(duì)雌激素周期小鼠陰道上皮細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響[J].中國(guó)生化藥物雜志，2009，30(1)：21-24.

[13] 趙醒，焦春敬，李春輝，等.150例食管鱗癌Caveolin-1和PCNA蛋白的表達(dá)及其生物學(xué)意義[J].重慶醫(yī)學(xué)，2013，42(32)：3889-3890，3893.

[14] 王麗燕，張冬梅.鼻腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的表達(dá)變化及意義[J].山東醫(yī)藥，2013，53(3)：74-75.

(編校：譚玲)

Study on the expression of PCNA and C-erbB-2 in nasal cavity paranasal sinus squamous cell carcinoma and it clinical significance

LU Hong-lue1,MI Yang1,LIANG Yuan1,KANG Fei2

(1.Department of Otorhinoloaryngology, Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, China;2.Department of physical Examination,Affiliated Hospital of Chengde Medical College,Chengde 067000,China)

ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of proliferating cell nuclear antigen (PCNA)and oncogene protein (C-erbB-2)in the nasal cavity paranasal sinus squamous cell carcinoma.MethodExpression of PCNA and C-erbB-2 were tested in 45 cases of the nasal cavity paranasal sinus squamous cell carcinoma by the immunohistochemical method, and 15 cases of normal nasal mucosa were selected as the normal control.ResultsAll levels of sinonasal squamous cell carcinoma, PCNA and C-erbB-2 expressed in nasal mucosa, and compared with the normal control group, the differences were statistically significant (P<0.05), and with the increasing grade of squamous, cell carcinoma expression increased.But expression in squamous cell carcinoma, PCNA and C-erbB-2 had no significant correlation. ConclusionExpression of PCNA and C-erbB-2 can reflect the sinonasal squamous cell carcinoma proliferation activity, and the expression can reflect the proliferation activity of squamous cell carcinoma.

sinus nasal squamous cell carcinoma; proliferating cell nuclear antigen;oncogene protein

陸鴻略，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：鼻部腫瘤的研究，E-mail:luhonglue@126.com。

R739.6

A

1005-1678(2015)01-0094-03