孟 燕， 梁永杰

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200120)

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·基礎(chǔ)研究·

紫草素誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究

孟 燕， 梁永杰

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200120)

目的 研究紫草素(shikonin， SK)誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制。方法 不同濃度紫草素作用于肺腺癌A549細(xì)胞后，CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖情況；DAPI熒光染色法和FCM檢測細(xì)胞凋亡；Western blotting檢測紫草素處理48h后Bax、Bcl-2、p-Akt、p-ERK1/2的蛋白水平。結(jié)果 紫草素顯著抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖活性(P<0.05)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與空白對照組比較，紫草素處理組Bax表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2、p-Akt、P-ERK1/2表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 紫草素可以顯著抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與線粒體凋亡途徑，PI3K/Akt信號通路和ERK 1/2信號通路有關(guān)。

紫草素； 非小細(xì)胞肺腫瘤； 細(xì)胞凋亡； PI3K/Akt信號通路； ERK 1/2信號通路

紫草素是從紫草科植物紫草的根部提取得到的一種萘醌類化合物。據(jù)報(bào)道，紫草素具有解毒，抗炎，抗菌和抗腫瘤作用，早在公元5世紀(jì)，就被應(yīng)用于藥物治療。研究證實(shí)，紫草素可以通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖，改變細(xì)胞周期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等途徑，對多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生作用[1-2]。本研究選用人肺腺癌A549細(xì)胞系，觀察紫草素對A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并對其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步探討，為紫草素用于肺癌的臨床治療奠定理論基礎(chǔ)，同時也為開發(fā)利用中藥資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)體系 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549來自于同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)平臺，用含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM(高糖)培養(yǎng)液(Gibco)于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2～3天換液一次，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.1.2 藥物及試劑 紫草素(Shikonin)為Sigma產(chǎn)品，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示；DAPI(Sigm a)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(Becton Dickinson)；Bcl-2(#2876S)、Bax(#2774S)，phospho-Akt(Ser473)(#9271S)、phospho-ERK 1/2(#9101)，β-actin(#5125s)、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(#7074P2)均購自美國Cell Signaling Technology公司。

圖1 紫草素的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of Shikonin

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫草素溶液配制及實(shí)驗(yàn)分組 稱取粉末狀紫草素3.5mg，按DMSO： Medium=1∶9進(jìn)行溶解，配制成1.2mmol/L的藥物母液，之后進(jìn)行稀釋，使藥物濃度分別為1.5、3.0、6.0、12.0和24.0μmol/L，抽濾滅菌，4℃避光保存。試驗(yàn)所應(yīng)用的藥物濃度及藥物作用時間均為前期預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選所得的最佳用藥濃度和用藥時間。

1.2.2 CCK-8法檢測紫草素對人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，按4×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白調(diào)零組(不接種細(xì)胞)、對照組(只含等量培養(yǎng)基)及實(shí)驗(yàn)組(紫草素終濃度分別為1.5μmol/L、3.0μmol/L、6.0μmol/L、12.0μmol/L和24.0μmol/L)，每組設(shè)5個復(fù)孔。分別于培養(yǎng)12h、24h、48h、72h后加入10μl CCK-8溶液，于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2h后全自動酶聯(lián)免疫測定儀490nm處測定各孔吸光度D值。以對照組細(xì)胞活性為參照，計(jì)算各處理組細(xì)胞活性。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞活性為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.3 DAPI染色法檢測紫草素對人肺腺癌A549細(xì)胞形態(tài)變化的影響 取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，按1×105/孔接種于含有蓋玻片(10%多聚賴氨酸包被)的6孔板內(nèi)。不同濃度紫草素處理48h后，4%多聚甲醛固定30min，3% BSA封閉30min，1μg/ml DAPI溶液避光染色30min，PBS洗滌，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.4 FCM法檢測紫草素對人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡率的影響 取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，按1×105/孔接種于6孔板內(nèi)。培養(yǎng)24h后，予不同濃度紫草素濃度處理，48h后0.25%胰酶消化(不含EDTA)，100μl Annexin V binding buffer(1X)重懸，再加入Annexin V-FITC和PI染色液各5μl，混勻，室溫避光15min，上機(jī)前再加入400μl Annexin V binding buffer(1X)混勻，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，F(xiàn)ACS Diva軟件分析細(xì)胞凋亡分布情況。

1.2.5 Western blotting檢測紫草素對人肺腺癌A549細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響 人肺癌A549細(xì)胞經(jīng)紫草素(1.5μmol/L、3.0μmol/L、6.0μmol/L、12.0μmol/L和24.0μmol/L)作用48h后，加入RIPA細(xì)胞裂解液100μl，細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，冰浴30min。4℃條件下12000×g離心20min(r=5cm)，離心半徑10cm，收集上r/min清液，按照BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。取各樣品等量總蛋白100μg，加入等體積的5x上樣緩沖液，混勻，煮沸變性10min，在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠上進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，一抗(p-Akt 1∶1000；p-ERK 1∶1000；Bax 1∶1000；Bcl-2 1∶500；β-actin 1∶5000)4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5000)室溫孵育1h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色劑顯色，BIO-Rad凝膠成像儀曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 紫草素抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖

CCK-8法檢測結(jié)果(圖2)顯示，紫草素能夠明顯抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖，并且隨著作用濃度和作用時間的增加，紫草素對A549細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。各濃度組與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 紫草素誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡

紫草素(3.0μmol/L和12.0μmol/L)作用于A549細(xì)胞48h后，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，胞體變圓，縮小，即出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象(圖3A)。經(jīng)DAPI染色后，可見紫草素處理組細(xì)胞核破裂，固縮，染色質(zhì)凝集(圖3B)。同時用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡比率，結(jié)果顯示，隨著紫草素濃度的增加，細(xì)胞凋亡比率逐漸增高。實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞的總凋亡率(早期凋亡率和晚期凋亡率)分別為13.78%、37.78%、55.90%、68.10%和69.40%，顯著高于對照組6.71%(圖4)。

圖2 CCK-8法檢測紫草素對肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect ofdifferent concentrations of SK on viability of A549 cells detected by CCK-8 assay

圖3 熒光顯微鏡下觀察不同濃度紫草素作用后肺腺癌A549細(xì)胞的形態(tài)變化Fig.3 Effect of different concentrations of SK on morphology and DNA condensation of A549 cells

圖4 FCM法檢測不同濃度紫草素作用后肺腺癌A549細(xì)胞的凋亡率變化Fig.4 Effects of different concentrations of SK on the apoptosis of A549 cells detected by flow cytometry

2.3 紫草素影響肺腺癌A549細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)水平

Bcl-2蛋白家族是主要的細(xì)胞凋亡調(diào)控因子。在線粒體上，Bcl-2家族蛋白通過與其他凋亡蛋白的協(xié)同作用，調(diào)控線粒體結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性，發(fā)揮著細(xì)胞凋亡“主開關(guān)”的作用。Western blotting(圖5)顯示，與空白對照組相比，紫草素處理組Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)，，Bax/Bcl-2明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 紫草素影響肺腺癌A549細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

PI3K/Akt通路廣泛存在細(xì)胞中，是參與細(xì)胞生長、增殖、分化調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。PI3K/Akt信號通路，有“抗凋亡途徑”之稱，該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常，可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖引起腫瘤，被認(rèn)為是癌細(xì)胞存活的首要通路。Western blotting結(jié)果(圖6)顯示，與空白對照組相比，紫草素處理組p-Akt表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 紫草素影響肺腺癌A549細(xì)胞中ERK 1/2信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

ERK是MAPK家族成員之一，參與細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)錄、分化及凋亡，是細(xì)胞信號傳導(dǎo)的重要途徑。Western blotting結(jié)果(圖6)顯示，與空白對照組相比，紫草素處理組p-ERK1/2表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖6 蛋白質(zhì)印跡法檢測不同濃度紫草素作用后肺腺癌A549細(xì)胞中P-ERK和P-Akt蛋白的表達(dá)水平Fig.6 The expression levels of P-ERK and P-Akt proteins in A549 cells treated with SK detected by Western blotting

3 討 論

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)顯示，2012年全球新增肺癌患病例數(shù)約為180萬，約有159萬患者死于肺癌，位居癌癥相關(guān)死亡的首位。在中國，肺癌病死率已超過癌癥死因的20%，且其發(fā)病率和死亡率仍呈逐年上升趨勢[5]。非小細(xì)胞肺癌(the non-small cell lung cancer， NSCLC)是肺癌的主要表現(xiàn)形式，約占肺癌的80%～85%，包括腺癌，鱗癌和大細(xì)胞癌[3-4]。

手術(shù)、放療和化療仍然是現(xiàn)階段治療肺癌的主要手段。盡管基于多年的分子學(xué)研究結(jié)果而誕生的分子靶向治療把肺癌治療模式提高了一個嶄新的高度，但肺癌的防治效果仍然達(dá)不到根本的改觀，在美國，肺癌患者的5年生存率低于15.9%，在中國則更低[4-5]。因此，人們迫切尋求一種療效高，不良反應(yīng)少的新型治療方法。

為了尋求新的治療手段，補(bǔ)充和替代醫(yī)學(xué)(complementary and alternative medicine， CAM)將關(guān)注焦點(diǎn)轉(zhuǎn)移到中醫(yī)療法[6]。已有研究證實(shí)，部分中醫(yī)藥與順鉑聯(lián)合應(yīng)用后，能夠有效緩解晚期非小細(xì)胞肺癌患者癥狀，減少不良反應(yīng)，提高療效，改善病人生活質(zhì)量。

紫草素是從紫草科植物紫草的根部提取得到的一種萘醌類化合物，研究發(fā)現(xiàn)，其對乳腺癌、肝癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用[7-8]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，紫草素對肺腺癌A549細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用。小劑量紫草素作用后，A549細(xì)胞的凋亡率約為13.78%，大劑量紫草素作用后的細(xì)胞凋亡率可達(dá)69.4%，周黎明等臨床觀察發(fā)現(xiàn)，紫草素增加小鼠肝癌和Lewis肺癌放射治療效應(yīng)，對正常細(xì)胞毒副作用小[9]。綜上所述，紫草素對肺癌的治療具有高效、低毒的特性，具有良好的應(yīng)用前景。

本研究結(jié)果表明，紫草素處理A549細(xì)胞后，胞體變圓，縮小，核破裂，染色質(zhì)凝集，表現(xiàn)為典型的凋亡形態(tài)改變。細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括線粒體凋亡途徑、死亡受體凋亡途徑以及非依賴caspase凋亡途徑。已有研究證實(shí)，紫草素及其衍生物可通過多種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Chang等研究證實(shí)，紫草素通過刺激活性氧的產(chǎn)生，活化ERK信號通路，調(diào)節(jié)BcL-2蛋白，最終誘導(dǎo)骨肉瘤143B細(xì)胞的凋亡[10]。本研究從與線粒體密切相關(guān)的Bcl-2家族蛋白入手，對紫草素誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行了初步研究。結(jié)果顯示，紫草素作用A549細(xì)胞后，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)，且隨著藥物濃度的增加，作用效果更加明顯。推測紫草素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與線粒體凋亡途徑有關(guān)。

PI3K/Akt信號通路廣泛存在細(xì)胞中，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖和分化等功能，PI3K/Akt信號通路上調(diào)抗凋亡基因的表達(dá)，抑制cmyc誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，有“抗凋亡途徑”之稱，該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常，可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖引起腫瘤，被認(rèn)為是癌細(xì)胞存活的首要通路[11]。Akt是PI3K/AKt通路的直接下游靶點(diǎn)，可通過直接磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB和哺乳類動物雷帕霉素(the mammalian target of rapamycin， mTOR)等參與調(diào)節(jié)多種生命活動過程[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，紫草素可劑量依賴性地抑制P-AKt的表達(dá)，表明紫草素可能通過抑制PI3K/AKt信號通路的傳導(dǎo)誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡。

ERK是MAPK家族成員之一，能將多種細(xì)胞外信號(如生長因子)傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，參與細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)錄、分化及凋亡，是細(xì)胞信號傳導(dǎo)的重要途徑[12]。已有研究顯示，ERK1/2通路可以通過抑制Bad和Bim的活性以及促進(jìn)Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，紫草素可劑量依賴性地抑制P-ERK1/2的表達(dá)，表明紫草素可能通過抑制ERK1/2信號通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡。

化療仍是當(dāng)代治療肺癌的主要手段，但化療所帶來的諸如受體耐藥，細(xì)胞毒性等問題，迫使人們尋求新的治療手段。眾多研究者將焦點(diǎn)投注于天然抗腫瘤藥物及其衍生物。本研究結(jié)果表明，紫草素在體外可抑制A549細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與線粒體凋亡途徑以及PI3K/Akt信號通路相關(guān)。為臨床上應(yīng)用紫草素治療肺癌提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)和理論基礎(chǔ)。然而，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展涉及多個方面，紫草素是否對肺癌細(xì)胞的PTEN、mTOR、P-JNK等產(chǎn)生作用，有待進(jìn)一步研究。此外，本實(shí)驗(yàn)主要為體外實(shí)驗(yàn)研究，紫草素對肺癌的抑制作用在體內(nèi)是否仍有效，有待進(jìn)一步探討。

[1] Fan YY， Jin S， He J， et al. Effect of β， β-dimethylacrylshikonin on inhibition of human colore-ctal cancer cell growth in vitro and invivo[J]. Int J Mol Sci， 2012，13： 9184-9193.

[2] Dugoua JJ， Wu P， Seely D， et al. Astragalus-containing Chinese herbal combinations for advanced non-small-cell lung cancer： a metaanalysis of 65 clinical trials enrolling 4751 patients[J]. Lung Cancer， 2010，1： 85-100.

[3] Siegel R， Naishadham D， Jemal A. Cancer statistics， 2013 [J]. CA Cancer J Clin， 2013，63(1)： 11-30.

[4] Galvani E， Peters GJ， Giovannetti E. EGF receptor-targeted therapy in non small-cell lung cancer： role of germline polymorphisms in outcome and toxicity[J]. Future Oncol， 2012，8： 1015-1029.

[5] 王昌惠.肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究進(jìn)展[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)： 醫(yī)學(xué)版，2011，32(2)： 1-4.

[6] Chang KH， Brodie R， Choong MA， et al. Complementary and alternative medicine use in oncology： a questionnaire survey of patients and health care professionals[J]. BMC Cancer， 2011，11： 196.

[7] Wenju an L， Joan L， Kasey J， et al. Sensitizing the therapeutic efficacy of taxol with shikonin in human breast cancer cells[J]. Plos One， 2014，9(4)： e94079.

[8] Wu YY， Wan LH， Zheng XW， et al. Inhibitory effects of β， β-dimethylacrylshikonin on hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo[J]. Phytother Res， 2012，26： 764-771.

[9] 繆世坤，羅剛，周黎明.乙酰紫草素注射液對小鼠Lew is肺癌生長抑制的研究[J].四川生理科學(xué)雜志，2007，29(4)： 154-155.

[10] Chang IC， Huang YJ， Chiang TI， et al. Shikonin induces apoptosis through reactive oxygen species/extracellular signal-regulated kinase pathway in osteosarcoma cells[J].Biol Pharm Bull， 2010，33(5)： 816-824.

[11] Lauring J， Park BH, Wolff AC. The phospho-inositide-3-kinase-akt-mTOR pathway as a therapeutic target in breast cancer[J]. J Natl Compr Canc Netw， 2013，11： 670-678.

[12] Zhao S， Qiu ZX， Zhang L， et al. Prognostic values of ERK1/2 and p-ERK1/2 expressions for poor survival in non-small cell lung cancer[J]. Tumour Biol， 2015，36(6)： 4143-4150.

Mechanisms of shikonin-induced apoptosis in lung adenocarcinoma A549 cells

MENGYan，LIANGYong-jie

(Dept. of Respiratory Medicine， East Hospital， Tongji University， Shanghai 200120， China)

Objective To investigate the effects of shikonin(SK) on apoptosis in human lung adenocarcinoma A549 cells and its underlying mechanism. Methods After treatment with SK at various concentrations for different times， the viabilities of A549 cells were examined by CCK-8 assay. Cell morphological changes were measured by DAPI staining. Cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The expressions of Bax， Bcl-2， p-Akt and p-ERK1/2 proteins were detected by Western blotting. Results The CCK-8 assay showed that SK inhibited the proliferation of A549 cells in a dose-and time-dependent manner. Florescence microscope with DAPI staining showed apoptotic changes in A549 cells after treatment with SK. Compared with control group， the expression of Bax protein was up-regulated while the expressions of Bcl-2， P-Akt and P-ERK proteins were down-regulated(P<0.05). Conclusion The results suggest that SK may inhibit the growth of lung cancer A549 cells and induce apoptosis， and mitochondrial apoptosis pathway， PI3K/Akt pathway and ERK 1/2 pathway might be involved in the process.

shikonin; non-small cell lung cancer; cell apoptosis; PI3K/Akt signal g pathway; ERK 1/2 signal pathway

10.16118/j.1008-0392.2015.06.008

2015-06-23

上海市醫(yī)學(xué)會資助項(xiàng)目(SY10-5)

孟 燕(1987—)，女，碩士研究生.E-mail： m1340123915@163.com

梁永杰.E-mail： liangyj2008@yaho.com

R 734.2

A

1008-0392(2015)06-0040-06