黃飛，屈飛強(qiáng)，李長(zhǎng)江，陳海龍

(1.黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽 黃山 245041；2.安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，安徽 黃山 245000)

煙堿又稱(chēng)為尼古丁，是煙葉的主要成分之一。長(zhǎng)期以來(lái)，煙堿被認(rèn)為是煙葉中的主要毒性物質(zhì)，其實(shí)這是一種誤解。中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所趙保路教授課題組研究發(fā)現(xiàn)，煙葉煙氣中的自由基、多環(huán)芳烴、亞硝胺等主要有害物質(zhì)才是香煙中真正的健康“殺手”，它們?cè)斐扇梭w組織和細(xì)胞氧化，導(dǎo)致癌癥等疾病的發(fā)生[1]。流行病學(xué)研究報(bào)告表明，煙堿是一種較好的抗氧化劑，可以有效清除活性氧自由基，能夠抑制多巴胺自氧化；煙堿可以絡(luò)合金屬銅和鋅，防止其在腦中積聚，預(yù)防并降低老年癡呆癥和帕金森氏綜合癥的發(fā)病率[2–3]；煙堿可以治療行為異常、認(rèn)知障礙、精神分裂癥、抑郁癥等，對(duì)婦女乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、纖維腺瘤、纖維囊腫等雌激素依賴(lài)性疾病有較好的療效[1]。煙堿還可以用于吸煙者戒煙，減輕戒煙時(shí)出現(xiàn)的戒斷癥狀，提高戒煙的成功率，避免吸煙產(chǎn)生的有害物質(zhì)對(duì)身體的毒害[4–5]。煙堿作為殺蟲(chóng)劑，具有高效、廣譜性、持效期長(zhǎng)、低毒、對(duì)天敵有選擇性、內(nèi)吸性強(qiáng)、對(duì)刺吸式口器害蟲(chóng)防治有特效[1]等優(yōu)點(diǎn)。

目前從煙葉中提取煙堿的常見(jiàn)方法有溶劑萃取法[6]、液膜萃取法[7]、超臨界萃取法[8]、水蒸汽蒸餾法[9]、離子交換法[10]、連續(xù)逆流提取法[11]、超聲輔助酶法[12]等。溶劑萃取法溶液分離不徹底，煙堿提取率不高；水蒸汽蒸餾法所需設(shè)備龐大，能耗較高，煙堿提取率和純度較低；液膜萃取法、超臨界萃取法、離子交換法、連續(xù)逆流提取法、超聲輔助酶法等方法提取煙堿條件要求較高，后處理過(guò)程復(fù)雜，對(duì)環(huán)境有污染，煙堿提取率和純度不高。微波輔助提取(MAE)是將微波能與物質(zhì)的分離純化耦合的快速有效手段，它是集化學(xué)分離提取技術(shù)、微波加熱技術(shù)于一體的新型提取方法，被廣泛用于中藥材有效成分的提取中。它采用微波加熱，溫度梯度較小，可以對(duì)不同材料進(jìn)行選擇性加熱，微波轉(zhuǎn)換熱能效率較高，降低反應(yīng)能耗[13–14]。在微波輔助提取過(guò)程中，微波加熱使植物細(xì)胞內(nèi)的極性物質(zhì)吸收微波能量，細(xì)胞內(nèi)溫度迅速升高，在細(xì)胞表面形成微小的裂紋和空洞，使細(xì)胞外溶劑較容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而達(dá)到快速提取分離煙堿的目的[15]。因此微波輔助提取煙堿原料，試劑消耗少，提取時(shí)間短，提取溫度低，產(chǎn)品質(zhì)量好，提取率較高，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[16]，與以上煙堿提取方法相比較，微波輔助提取法更方便簡(jiǎn)捷，精確度、準(zhǔn)確度更高。筆者以廢次煙葉為原料，利用MAE 法提取煙堿，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)法考察了浸泡時(shí)間、固液比、微波功率、微波輻射時(shí)間等因素對(duì)煙堿提取率的影響，獲得了微波輔助提取煙堿的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

廢次煙葉購(gòu)于黃山市煙草收購(gòu)站，批號(hào)20131015。99%煙堿標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于西安云芝生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)20140216。甲基橙、氯仿、乙醇、檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖溶液均為分析純，購(gòu)于中國(guó)國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器有：UV–2100 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京北分瑞利分析儀器有限責(zé)任公司)；NMS72SF 型微波爐(上海微波爐有限公司)；FZ102 型微量植物粉碎機(jī)(上海申光儀器儀表有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 煙堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取煙堿標(biāo)準(zhǔn)液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL，分別注入60mL 分液漏斗中，加入檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖溶液2mL、甲基橙溶液2mL，混合均勻后加入氯仿5mL，萃取2min，靜置分層，取氯仿層溶液，加入1 cm 比色皿中，測(cè)其波長(zhǎng)420 nm 處的吸光度[19]。以吸光度為縱坐標(biāo)，煙堿體積分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程Y=0.354 32X– 0.023 26，其中Y 為吸光度，X 為煙堿體積分?jǐn)?shù)，相關(guān)系數(shù)r= 0.999 5。

1.2.2 微波輔助提取煙堿

取10.00g 廢次煙葉，用微型植物粉碎機(jī)粉碎，以一定的固液比加入乙醇，浸泡一定時(shí)間后，以一定功率的微波處理一定時(shí)間，冷卻后于3 500 r/min 轉(zhuǎn)速下離心15min，取上清液1mL，加入2mL 檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液和2mL 飽和的甲基橙溶液，搖勻后加入5mL 氯仿，振蕩3min，靜置分層。取氯仿層溶液，加入1 cm 比色皿中，測(cè)其420 nm 處吸光度[20–21]。用回歸方程計(jì)算出煙堿體積分?jǐn)?shù)，得煙堿提取率。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

分別考察浸泡時(shí)間、固液比、微波功率、微波輻射時(shí)間等因素對(duì)煙堿提取率的影響。

1) 取10.00g 廢次煙葉，以1∶3 的固液比加入乙醇，以400 W 的微波輻射3min，測(cè)定浸泡時(shí)間分別為2、3、4、5、6 h 的煙堿提取率。

2) 取10.00g 廢次煙葉，以1∶3 的固液比加入乙醇，浸泡時(shí)間為2 h，以400 W 的微波輻射，測(cè)定微波輻射時(shí)間分別為3、4、5、6、7min 的煙堿提取率。

3) 取10.00g 廢次煙葉，浸泡時(shí)間為 2 h，以400 W 的微波輻射3min，測(cè)定固液比分別為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 的煙堿提取率。

4) 取10.00g 廢次煙葉，以1∶3 的固液比加入乙醇，浸泡時(shí)間為2 h，微波輻射3min，測(cè)定微波功率分別為400、500、600、700、800 W 的煙堿提取率。

1.2.4 正交試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)法對(duì)煙堿提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。以煙堿的提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察浸泡時(shí)間(A)、微波輻射時(shí)間(B)、固液比(C)、微波功率(D)對(duì)煙堿提取率的影響。正交試驗(yàn)影響因素和水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)的因素和水平 Table 1 The factors-levels of the orthogonal experiment

2 結(jié)果與分析

不同浸泡時(shí)間、微波輻射時(shí)間、固液比、微波功率下的煙堿提取率列于表1。

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 浸泡時(shí)間對(duì)煙堿提取率的影響

隨著浸泡時(shí)間的增加，煙堿的提取率逐漸升高，浸泡4 h 后，煙堿提取率增加逐漸放緩并趨于平穩(wěn)，因此選擇最佳浸泡時(shí)間為4 h。

表1 不同浸泡時(shí)間、微波輻射時(shí)間、固液比、微波功率的煙堿提取率 Table 1 The soaking time, microwave time, ratios of solvent, microwave power corresponding to the yield of nicotine

根據(jù)不同浸泡時(shí)間對(duì)應(yīng)的煙堿提取率，由偏差分析可知，煙堿提取率的標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.844，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.926%，煙堿提取率的標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，說(shuō)明浸泡時(shí)間對(duì)應(yīng)的煙堿提取率在誤差范圍內(nèi)波動(dòng)，波動(dòng)幅度較小，具有較高的準(zhǔn)確度。

2.1.2 微波輻射時(shí)間對(duì)煙堿提取率的影響

隨著微波輻射時(shí)間的增加，煙堿的提取率也隨之升高，當(dāng)微波輻射5min 后，增加趨勢(shì)逐漸變小并趨于平穩(wěn)。若延長(zhǎng)微波輻射時(shí)間，溶劑揮發(fā)較多，煙堿提取率降低；若時(shí)間太短，煙葉中的煙堿未能充分溶出，煙堿提取率偏低，因此，選擇最佳微波輻射時(shí)間為5min。

根據(jù)不同微波輻射時(shí)間對(duì)應(yīng)的煙堿提取率，由偏差分析可知，煙堿提取率的標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.355，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.459%，煙堿提取率的標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，說(shuō)明微波輻射時(shí)間對(duì)應(yīng)的煙堿提取率在誤差范圍內(nèi)波動(dòng)，波動(dòng)幅度較小，具有較高的準(zhǔn)確度。

2.1.3 固液比對(duì)煙堿提取率的影響

隨著固液比的逐步減小，煙堿提取率逐漸升高。當(dāng)固液比降低至1∶5 后，煙堿提取率趨于平穩(wěn)。僅增加溶劑量，并不能提高煙堿提取率，因此，選擇最佳固液比為1∶5。

根據(jù)不同固液比對(duì)應(yīng)的煙堿提取率，由偏差分析可知，煙堿提取率的標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.273，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.228%，煙堿提取率的標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，說(shuō)明固液比對(duì)應(yīng)的煙堿提取率在誤差范圍內(nèi)波動(dòng)，波動(dòng)幅度較小，具有較高的準(zhǔn)確度。

2.1.4 微波功率對(duì)煙堿提取率的影響

隨著微波功率的增大，煙堿的提取率升高，當(dāng)輻射功率達(dá)到600 W 后，增加趨勢(shì)逐漸變小，因此，選擇最佳微波功率為600 W。

根據(jù)不同微波功率對(duì)應(yīng)的煙堿提取率，由偏差分析可知，煙堿提取率的標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.055，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.953%，煙堿提取率的標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，說(shuō)明微波功率對(duì)應(yīng)的煙堿提取率在誤差范圍內(nèi)波動(dòng)，波動(dòng)幅度較小，具有較高的準(zhǔn)確度。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果列于表2。由表2 可知，4 種因素對(duì)煙堿提取率的影響程度大小依次為微波功率、微波輻射時(shí)間、浸泡時(shí)間、固液比，最佳工藝條件為D3B3A1C3，即微波功率為800 W，微波輻射時(shí)間為7min，浸泡時(shí)間為4 h，固液比為1∶7，在此條件下煙堿的提取率最高為98.68 %。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果 Table 2 Results of orthogonal experimen

由表3 方差分析結(jié)果可知，微波功率對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較顯著；微波輻射時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，浸泡時(shí)間、固液比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著。各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響大小依次為微波功率、微波輻射時(shí)間、浸泡時(shí)間、固液比。

表3 方差分析結(jié)果 Table 3 Results of variance analysis

由極差和方差分析可以得出：微波功率對(duì)煙堿的提取率影響最大，當(dāng)微波功率為800 W 時(shí)，煙堿的提取率最高。微波輻射時(shí)間對(duì)煙堿的提取率影響次于微波功率，隨著微波功率的升高，煙堿的提取率逐漸增加。浸泡時(shí)間和固液比對(duì)煙堿的提取率也有影響，但不顯著，隨著微波功率和微波輻射時(shí)間的增加，煙堿的提取率逐漸增加。

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