劉會(huì)珍，羅為桂，謝偉民，胡月清，蘇益，蕭浪濤，藺萬(wàn)煌

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物激素與生長(zhǎng)發(fā)育湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

植物生長(zhǎng)素是最早被發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)植物激素，其中IAA(indole–3–acetic acid)是主要的活性物質(zhì)[1]。作為信號(hào)分子，IAA 在植物胚胎中軸建立[2]、側(cè)生器官形成[3]、葉序排列[4]、維管束發(fā)育[5]、向光反應(yīng)[6]以及根向重力[7]等方面都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)，有關(guān)生長(zhǎng)素生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究取得了巨大的進(jìn)展，生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的基本輪廓已經(jīng)形成[8]。在生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中包含一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄抑制因子AUX/IAAs[9–12]，它能與生長(zhǎng)素受體TIR1(transport inhibitor response 1)形成共受體[13–15]。Aux/IAA 蛋白具有4個(gè)結(jié)構(gòu)域(DI、DII、DIII 和DⅣ)，在低濃度IAA 環(huán)境中，Aux/IAA 與多個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)因子(ARFs)形成復(fù)合物，可阻礙響應(yīng)IAA 的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[16–18]；Aux/IAA 又是一種短命的核蛋白，在高濃度IAA 環(huán)境中，IAA 就像分子膠一樣可促使 SCFTIR1與Aux/IAA 相互結(jié)合，誘發(fā)Aux/IAA 蛋白的泛素化降解，從而解除對(duì)生長(zhǎng)素應(yīng)答基因的阻遏作用[19–20]。

目前，模式植物擬南芥的IAA1[21]、IAA4[22]、IAA7[23]、IAA9[24]和IAA28[25]等Aux/IAA 蛋白質(zhì)家族成員的重要功能已經(jīng)有了較詳細(xì)的解析。Aux/IAA 蛋白與AtTIR1、AFB1 和AFB3 等蛋白具有較強(qiáng)的相互作用[19]，并且這種結(jié)合與生長(zhǎng)素信號(hào)緊密相關(guān)，這就預(yù)示著Aux/IAA 蛋白可能具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。據(jù)此，本研究中構(gòu)建IAA7 的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)IAA7 蛋白，通過(guò)GST 親和樹(shù)脂獲得純化的IAA7 蛋白，旨在為后續(xù)對(duì)IAA7 的應(yīng)用研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

擬南芥(Arabidopsis thaliana L.) 野生型Columbia(Col–0)；大腸桿菌(Escherichia coli)克隆菌株 DH5α；大腸桿菌表達(dá)菌株 Tuner(DE3)、Rosetta(DE3) 、 BL21(DE3) 及 原 核 表 達(dá) 載 體pGEX–KG。以上材料均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物激素與生長(zhǎng)發(fā)育湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

Trizol 試劑購(gòu)自Life Technologies 公司；反轉(zhuǎn)錄酶、DNA 限制性?xún)?nèi)切酶和T4DNA 連接酶等系TaKaRa(大連)公司產(chǎn)品；Pfu DNA 聚合酶、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(marker protein rulerⅡ)及其他分子生物學(xué)相關(guān)試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；GST SefiroseTMresin 親和樹(shù)脂購(gòu)自上海生物工程有限公司；凝血酶購(gòu)自Sigma 公司；引物合成及DNA 測(cè)序由華大基因公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物的合成及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)TAIR(http://www.arabidopsis.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的AtIAA7 序列以及質(zhì)粒pGEX–KG 圖譜設(shè)計(jì)PCR引物： 5′–ggatccATGCAGAAGCGAATAGCCTT G–3′ 和 5′–gaattcTTATAATCCGTTAGTAGTAATG– 3′，其中酶切位點(diǎn)BamHI 和EcoRI 用小寫(xiě)字母表示。

采用Trizol 法提取野生型擬南芥總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA 為模板擴(kuò)增IAA7 基因。用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI 和EcoRI 對(duì)PCR 產(chǎn)物及載體質(zhì)粒pGEX–KG 分別進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠回收目的DNA，用T4DNA 連接酶將IAA7 連接入pGEX–KG 載體，篩選并測(cè)序正確后，利用熱激法將重組質(zhì)粒PGEX–KG/GST–IAA7 分別轉(zhuǎn)化入3 種大腸桿菌表達(dá)菌株Rosetta、BL21 和Tuner 中。

1.2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

取37℃過(guò)夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒的菌液，按1∶500 接種于新的LB 培養(yǎng)液(含100mg/L 的氨芐青霉素)中，37℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)至菌液OD600nm約為0.6。于不同溫度(16、25、37℃)和不同IPTG誘導(dǎo)濃度(0.2、0.4、0.6 mmol/L)條件下，200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600nm約為1.0，即可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。

1.2.3 融合蛋白的純化

收集菌液，離心棄上清，用PBS(pH7.4)緩沖液清洗沉淀3次，按0.1g 沉淀加1mL PBS(pH7.4)緩沖液的比例重懸菌體，超聲波破碎細(xì)胞，4℃、13 000g、5min 離心后取上清，按上清體積的1/20 加入GST SefiroseTMresin 樹(shù)脂，4℃孵育1 h，使GST–IAA7 與樹(shù)脂充分結(jié)合，離心取沉淀并用等體積的PBS(pH7.4)緩沖液清洗5次，GST SefiroseTMresin 樹(shù)脂中即包含了純化后的GST–IAA7 融合蛋白。

1.2.4 GST 標(biāo)簽的切除

取結(jié)合有 GST–IAA7 融合蛋白的 GST SefiroseTMresin 樹(shù)脂，按每1mL GST SefiroseTMresin 樹(shù)脂加入10 U 的凝血酶和 3mL PBS(pH7.4)緩沖液的比例進(jìn)行蛋白質(zhì)酶切反應(yīng)，反應(yīng)溫度為22℃，反應(yīng)時(shí)間為6 h[26]，離心收集反應(yīng)容器中的上清，即為切除GST 標(biāo)簽后的IAA7 蛋白質(zhì)溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 IAA7 基因原核表達(dá)載體的鑒定

用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI 和EcoRI 雙酶切鑒定pGEX–KG/GST–IAA7 重組質(zhì)粒，酶切片段符合預(yù)期設(shè)想(圖1)。將酶切陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送華大基因公司測(cè)序，基因序列與GenBank 中公布序列完全匹 配，證明pGEX–KG/GST–IAA7 重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。最后成功轉(zhuǎn)入Rosetta、BL21 和Tuner 3 種原核表達(dá)菌株中。

表1 表達(dá)載體的雙酶切鑒定結(jié)果 Fig.1 Detection result of construction through double digestion

2.2 GST–IAA7 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

2.2.1 溫度對(duì)GST–IAA7 融合蛋白表達(dá)的影響

參照以往的蛋白質(zhì)原核表達(dá)經(jīng)驗(yàn)，以pGEX–KG載體為基礎(chǔ)骨架構(gòu)建的表達(dá)載體，重組蛋白一般在約0.4 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)下可大量表達(dá)[27–28]，故本研究中首先固定IPTG 濃度為0.4 mmol/L，在不同溫度(16、25、37℃)，不同大腸桿菌表達(dá)菌株(Tuner、Rosetta、BL21)中誘導(dǎo)GST–IAA7 的表達(dá)，其中，GST 相對(duì)質(zhì)量約26 000，IAA7 相對(duì)質(zhì)量約26 400，因此，GST–IAA7 融合蛋白約為52 400。由圖2 可知，無(wú)論在何種誘導(dǎo)溫度下，GST–IAA7 在3 種菌株中都能高效表達(dá)，但在Rosetta 中的表達(dá)比在Tuner和BL21 中的好，能滿(mǎn)足后續(xù)純化的需要，因此，選擇Rosetta 菌株為GST–IAA7 的最適表達(dá)菌株。另外，在16、25 和37℃條件下，GST–IAA7 在Rosetta 中均能較好表達(dá)，鑒于溫度越高蛋白質(zhì)活性越低，一般應(yīng)避免在30℃以上表達(dá)蛋白，溫度太低又會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，降低蛋白總產(chǎn)量，故選擇16 ～25℃為GST–IAA7 的誘導(dǎo)溫度。

圖2 不同溫度下GST–IAA7 的誘導(dǎo)表達(dá) Fig.2 Expression of GST–IAA7 at different temperatures

2.2.2 誘導(dǎo)劑IPTG 對(duì)GST–IAA7 融合蛋白表達(dá)的影響

誘導(dǎo)劑IPTG 是影響蛋白質(zhì)表達(dá)的另一種重要因素，因此，確定了誘導(dǎo)GST–IAA7 表達(dá)的溫度條件后，進(jìn)一步討論誘導(dǎo)劑IPTG 對(duì)GST–IAA7 融合蛋白表達(dá)的影響。為了便于條件控制，固定誘導(dǎo)溫度為25℃，設(shè)置0.2、0.4、0.6 mmol/L 3個(gè)不同IPTG濃度誘導(dǎo)GST–IAA7 表達(dá)。由圖3 可以看出，在25℃誘導(dǎo)條件下，GST–IAA7 在Rosetta 中表達(dá)較好，其中0.4 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)條件下GST–IAA7 表達(dá)量最多。

圖3 不同IPTG 濃度下GST–IAA7 的誘導(dǎo)表達(dá) Fig.3 Expression of GST–IAA7 at different concentrations of IPTG

綜合上述結(jié)論，后續(xù)研究選用Rosetta 菌株表達(dá) GST–IAA7 融合蛋白，最佳誘導(dǎo)條件為 0.4 mmol/L IPTG、16 ～25℃。在此誘導(dǎo)條件下，對(duì)所表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行定量分析，如圖4 所示。0.1g Rosetta 菌體在1mL PBS(pH 7.4)緩沖液中經(jīng)超聲波破碎后，取10 μL 上清與10 μL 上樣緩沖液充分混合， 取10 μL 混合液點(diǎn)樣，GST–IAA7 蛋白質(zhì)含量與0.4mg/mL 的BSA 標(biāo)準(zhǔn)樣品的相當(dāng)，經(jīng)折算，GST–IAA7 蛋白質(zhì)總含量可達(dá)1.6mg，占菌體總質(zhì)量的1.6%，能滿(mǎn)足后續(xù)大量純化的要求。

圖4 GST–IAA7 定量分析結(jié)果 Fig.4 Quantitative analysis of GST–IAA7

2.3 苯甲基磺酰氟(PMSF)對(duì)GST–IAA7 融合蛋白降解的影響

IAA7 作為一種短命的核蛋白，在植物體內(nèi)容易通過(guò)泛素化途徑降解。前期研究發(fā)現(xiàn)，IAA7 在PBS(pH 7.4)緩沖液中隨保存時(shí)間的增加而快速降解，嚴(yán)重阻礙了后續(xù)對(duì)IAA7 的應(yīng)用研究。為了解決這一問(wèn)題，本試驗(yàn)中在純化出的GST–IAA7 蛋白中加入蛋白酶抑制劑——苯甲基磺酰氟(終濃度為1 mm/L)，于4℃放置，每12 h 取樣1次，分析PMSF溶液對(duì)GST–IAA7 蛋白降解的影響。由圖5–A 和圖5–B 可以看出，加有PMSF 的GST–IAA7 融合蛋白在2 d 內(nèi)幾乎沒(méi)有降解，在5 d 內(nèi)降解一半；由圖5–C和圖5–D 可以看出，不加PMSF 的GST–IAA7 融合蛋白在2 d 內(nèi)即可降解一半，在4 d 內(nèi)幾乎完全降解，因此，苯甲基磺酰氟(PMSF)可大大延長(zhǎng)GST–IAA7 融合蛋白體外(溫度為4℃)保存的時(shí)間。但是，由于蛋白質(zhì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的升高，其活性和穩(wěn)定性會(huì)降低，因此，應(yīng)該在4℃短時(shí)(暫時(shí))保存GST–IAA7 融合蛋白和IAA7 蛋白，而在–80℃長(zhǎng)期保存。

圖5 PMSF 對(duì)GST–IAA7 蛋白穩(wěn)定性的影響 Fig.5 Impact of PMSF on the stability of GST–IAA7 protein

2.4 GST 標(biāo)簽的切除

用GST SefiroseTMresin 樹(shù)脂可對(duì)表達(dá)菌株中產(chǎn)生的GST–IAA7 進(jìn)行分離純化，GST–IAA7 可特異地結(jié)合在親和樹(shù)脂上。為了得到單一的IAA7 蛋白溶液用于后續(xù)研究，還需將IAA7 從柱床中分離開(kāi) 來(lái)，因此，本研究在體外用凝血酶切除了GST 標(biāo)簽，如圖6 所示。酶切后，上清中蛋白質(zhì)的相對(duì)質(zhì)量近似于IAA7 相對(duì)質(zhì)量的大小(26 400)，GST 樹(shù)脂的相對(duì)質(zhì)量近似于GST 蛋白標(biāo)簽相對(duì)質(zhì)量的大小(26 000)，這與預(yù)期結(jié)果一致，證明酶切成功。

圖6 IAA7 蛋白分離 Fig.6 Isolation of IAA7 protein

3 結(jié)論與討論

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展，以微生物(如大腸桿菌、酵母等)、昆蟲(chóng)細(xì)胞系(如果蠅胚胎細(xì)胞系、蛾胚胎細(xì)胞)以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞系為載體的蛋白質(zhì)重組技術(shù)已經(jīng)日趨成熟，其亦成為了蛋白質(zhì)功能研究及其應(yīng)用的基本手段[29–30]。通常情況下，在大腸桿菌表達(dá)菌株中表達(dá)異源重組蛋白是首選方案，因?yàn)槔肊.coli 表達(dá)重組蛋白具有培養(yǎng)要求低、生長(zhǎng)速度快、蛋白質(zhì)產(chǎn)量高、試劑耗材價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，這保證了研究中能快速獲得大量活性重組蛋白，既提高了效率，又可節(jié)省成本。另外，蛋白質(zhì)標(biāo)簽的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，進(jìn)一步為重組蛋白的鑒定及快速、高效純化提供了便利。目前，常用的蛋白質(zhì)標(biāo)簽有

His–tag、Flag–tag、HSV–tag、S–tag、MBP–tag、GST–tag 等，其中，具有親和性高、技術(shù)成熟、操作快捷的GST 融合表達(dá)目的蛋白質(zhì)的方式被普遍使用。由于pGEX 系列和pIEx 系列表達(dá)載體本身已經(jīng)含有GST 標(biāo)簽序列，并且還包括了thrombin (Tb) 和enterokinase (Ek) 等蛋白質(zhì)酶切位點(diǎn)，可以一步完成標(biāo)簽的切除，因此，本研究中以pGEX–KG為基礎(chǔ)構(gòu)架構(gòu)建表達(dá)載體，選用常用的大腸桿菌表達(dá)菌株Tuner、Rosetta、BL21 表達(dá)重組蛋白，用GST 的親和樹(shù)脂純化融合蛋白，并利用thrombin 切除GST 標(biāo)簽獲得目的蛋白。

影響重組蛋白原核表達(dá)的因素很多，客觀條件主要包括誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度、表達(dá)菌株基因型及培養(yǎng)基等。過(guò)低濃度的IPTG 對(duì)細(xì)菌的刺激不夠，從而導(dǎo)致重組蛋白表達(dá)量較少；過(guò)高濃度的IPTG對(duì)細(xì)胞具有毒性，同樣會(huì)降低重組蛋白產(chǎn)量。前人的研究[27–28]表明，在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白質(zhì)時(shí)，誘導(dǎo)劑IPTG 濃度一般都在0.4 mmol/L 左右，本研究的結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致。誘導(dǎo)溫度主要通過(guò)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)速度來(lái)影響蛋白質(zhì)表達(dá)，對(duì)于異源重組蛋白質(zhì)的原核表達(dá)，一般選擇較低的誘導(dǎo)溫度，這可以較好的保證蛋白質(zhì)的生物活性[31]。如果溫度過(guò)高，細(xì)胞快速生長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的快速產(chǎn)生，還可能使更多的重組蛋白沉積于包涵體中，不利于蛋白質(zhì)分離純化。培養(yǎng)基成分也可能影響蛋白質(zhì)表達(dá)，如在配制用于原核表達(dá)的LB 培養(yǎng)基時(shí)，必須用peptone 代替tryptone。當(dāng)然，不同基因型的大腸桿菌株系對(duì)某種異源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)能力也可能有差別。另外，目的蛋白本身的肽鏈長(zhǎng)度、毒性強(qiáng)弱以及類(lèi)別也會(huì)影響其表達(dá)，對(duì)于毒性蛋白和膜蛋白，通常情況下不宜做原核表達(dá)，而改用真核系統(tǒng)。本研究中的IAA7 蛋白質(zhì)為核蛋白，分子量較小，對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒害作用，因此選用原核表達(dá)系統(tǒng)比較經(jīng)濟(jì)適用。

Aux/IAAs家族蛋白是生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的核心因子之一，其功能的研究對(duì)于解析整個(gè)生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程至關(guān)重要[32]。Aux/IAAs在植物體內(nèi)存在的時(shí)間很短，在較高的生長(zhǎng)素濃度條件下，其與TIR1 結(jié)合，從而通過(guò)泛素化途徑快速降解[18]。為了能在體外進(jìn)一步研究Aux/IAAs 的一些功能和特性，本研究中對(duì)IAA7 進(jìn)行了原核表達(dá)，同時(shí)對(duì)其在PBS(pH 7.4)緩沖液中的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)蛋白酶抑制劑PMSF 可顯著增加IAA7在體外的穩(wěn)定性。

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