楊堃　鄭小平　阮陶仁

摘要 [目的]建立同時測定六味地黃膠囊中馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚3種成分含量的反相高效液相色譜法（RPHPLC）。[方法]以Waters ODS C18（ 4.6 mm×250 mm，5 μm）柱為分析柱、甲醇-0.1%磷酸為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，檢測波長芍藥苷和馬錢苷為230 nm、丹皮酚為274 nm，柱溫40 ℃。[結果]芍藥苷在0.066 5～1.663 2 μg、馬錢苷在0.107 9～2.697 7 μg、丹皮酚在0.122 4～3.060 0 μg范圍內均具有良好的線性關系，相關系數（r）分別為0.999 4、0.999 8、0.999 9，平均回收率為芍藥苷97.63%（RSD=0.82%）、馬錢苷97.66%（RSD=0.74%）、丹皮酚96.22%（RSD=1.21%）。[結論]該方法簡便、準確、重復性好，可用于六味地黃膠囊的質量控制。

關鍵詞 六味地黃膠囊；芍藥苷；馬錢苷；丹皮酚；RPHPLC

中圖分類號 S-03 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）15-074-04

Simultaneous Determination of Three Constituents in Liuwei Dihuang Capusule by RPHPLC

YANG Kun1， ZHENG Xiaoping1， RUAN Taoren2*

（1. Chongqing Food and Drug Control Institute， Chongqing 401121； 2. Chongqing City Hospital of Traditional Chinese Medicine， Chongqing 401121）

Abstract [Objective] To establish RPHPLC method for simultaneous determining paeoniflorin， loganin and paeonol in Liuwei Dihuang Capsule. [Method] RPHPLC assay was carried out using a Waters ODS C18 （4.6 ×250 ，5 ） column.The mobile phase was consisted of methanol -0.1% phosphoric acid in gradient elution.The flow rate was 1.0 ml/min.The UV detection wavelength was set at 230 for paeoniflorin and loganin，and 274 for paeonol.The column temperature was 40 ℃. [Result] The linear ranges of paeoniflorin， loganin and paeonol were 0066 5-1.663 2 （r=0.999 4 ）， 0.107 9-2.697 7 （r=0.9998 ）， 0.122 4-3.060 0 （r=0.999 9 ）， respectively. The average recoveries of paeoniflorin， loganin and paeonol were 97.63% （RSD was 0.82%） ， 97.66% （RSD was 0.74%） ， and 96.22% （RSD was 121%） ， respectively. [Conclusion] The method is simple， accurate and reproducible. It can be used for the quality control of Liuwei Dihuang Capsule.

Key words Liuwei Dihuang Capsule； Paeoniflorin； Loganin； Paeonol； RPHPLC

六味地黃膠囊是由滋陰補腎的經典代表方劑六味地黃丸改進制劑方法而成的，是《中國藥典》2010版一部收載的常用復方制劑。六味地黃膠囊依然由熟地黃、酒萸肉、山藥、牡丹皮、茯苓和澤瀉六味中藥組成，只是改進了制備方法，減少了服用量，易于保存和增加病人的依從性。所以六味地黃膠囊同樣具有滋陰補腎的功效，可用于腎陰虧損、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、骨蒸潮熱、盜汗遺精的治療[1]。喻箴等通過臨床研究表明六味地黃膠囊總療效明顯優(yōu)于傳統(tǒng)劑型六味地黃丸[2]；韋詠蓮也通過臨床研究發(fā)現六味地黃膠囊治療2型糖尿病有助于控制血糖，減輕病情[3]。

2010版《中國藥典》記載采用高效液相色譜法測定六味地黃膠囊中丹皮酚的含量，用薄層掃描法測定熊果酸的含量[1]；遲富杰等采用HPLC法測定六味地黃膠囊中熊果酸含量[4-5]和丹皮酚的含量[6-7]；水彩紅等采用HPLC法測定六味地黃膠囊中馬錢苷的含量[8-9]和芍藥苷的含量[10]。這些方法均是對單一成分的檢查，而六味地黃膠囊中成分多，為提高其質量控制標準，筆者參考和改進了李向陽等對于六味地黃丸采用HPLC法進行含量測定的方法[11-12]，從而建立了同時測定六味地黃膠囊中芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚3種成分的HPLC方法，為提高質量標準、全面評價其內在質量提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器 美國Waters2695型高效液相色譜儀；KQ500B型超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司）；BP221S萬分之一分析天平（德國Sartorius）；AX205十萬分之一分析天平（瑞士METTLER TOLEDO）。

1.2 試藥 六味地黃膠囊（吉林省撫松制藥股份有限公司 0.3 g×24粒）；芍藥苷對照品（中國食品藥品檢定所，定量測定用，批號110736-201136）；馬錢苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，定量測定用，批號110640-201005）；丹皮酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，定量測定用，批號110708-200505）；甲醇為色譜純；水為純化水，其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配置。

1.3.1.1 對照品溶液的制備。取芍藥苷和馬錢苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml分別含芍藥苷66.528 0 μg、馬錢苷107.906 5 μg的混合溶液，即得。取丹皮酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含丹皮酚122.4 μg的溶液，即得。

1.3.1.2 供試品溶液的制備。取同一批次樣品（批號120202 85），取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，超聲處理（500 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減少的重量，搖勻，濾過，續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.3.2 色譜條件及系統(tǒng)適應性試驗。色譜柱為Waters ODS C18（ 4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)，梯度洗脫，梯度洗脫程序如表1所示；體積流量1.0 ml/min；進樣量10 μl ；檢測波長芍藥苷和馬錢苷為230 nm、丹皮酚為274 nm。

1.3.3 標準曲線的繪制。精密吸取“1.3.1.1”項下的2種對照品溶液1、5、10、15、20、25 μl，分別注入液相色譜儀，測定芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積，以進樣量（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.4 精密度試驗。精密吸取“1.3.1.1”項下的2種對照品溶液，分別連續(xù)進樣6次，進樣體積為10 μl，測定馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚峰面積，分別計算芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積的相對標準偏差（RSD）。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗。取“1.3.1.2”項下同一供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、15 h注入液相色譜儀，進樣體積為10 μl，測定芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積，分別計算芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積的RSD。

1.3.6 重復性試驗。取同一批次樣品（批號120202 85），按“1.3.1.2”方法平行制備6份供試品溶液，分別測得芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚的含量，并分別計算芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積的RSD。

1.3.7 加樣回收率試驗。取已測定的六味地黃膠囊樣品（芍藥苷0.377 0 mg/粒、馬錢苷0.603 0 mg/粒、丹皮酚3.990 4 mg/粒），取約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入含芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚對照品的混合甲醇溶液（芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚的濃度分別為0.013 3、0.021 6、0.135 6 mg/ml）25 ml，以下按“1.3.1.2”項下制備方法操作，平行操作，制得6份加樣供試品溶液。吸取加樣供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀，測定芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚，計算加樣回收率和RSD。

1.3.8 樣品含量測定。按“1.3.1.2”項下方法制備供試品溶液，測定3個廠家六味地黃膠囊中芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚，平行測定3次，計算含量和RSD。

2 結果與分析

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應性試驗 從圖1可看出，該方法所得對照品色譜峰峰形尖銳，對稱性好；供試品中的芍藥苷和馬錢苷色譜峰對稱性好，與前后其他峰分離度>1.5，可見芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚色譜峰與相鄰成分可達基線分離，且陰性試驗無干擾，理論板數按芍藥苷峰計算不低于6 000，故該方法可行。

2.2 標準曲線的繪制

通過以上色譜條件測定，繪制標準曲線，數據經過回歸處理，得芍藥苷、馬錢苷、丹皮酚的回歸方程分別為Y=9.0×104X-419（r=0.999 4）、Y=1.5×105X-1.5×104（r=0.999 8）、Y=6.7×105X-7.9×104（r=0.999 9），表明芍藥苷在0.066 5～1.663 2 μg、馬錢苷在0107 9～2.697 7 μg、丹皮酚在0.122 4～3.060 0 μg范圍內有良好的線性關系。

2.3 精密度試驗 分別連續(xù)進樣6次，進樣體積為10 μl，測得馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為0.57%、045%和0.30%，表明該方法的精密度良好。

安徽農業(yè)科學 2015年

2.4 穩(wěn)定性試驗 按“1.3.5”方法操作，測得芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為0.32%、0.55%和0.46%，表明供試品溶液在15 h內穩(wěn)定性較好。

2.5 重復性試驗 按“1.3.6”方法操作，測得芍藥苷、馬錢苷、丹皮酚的平均含量分別為0.377 0（RSD=0.28%）、0.603 0（RSD=0.57%）、3.990 4 mg/粒（RSD=1.20%），表明該方法重復性好。

2.6 加樣回收率試驗

由表2～4可見，芍藥苷、馬錢苷、丹皮酚的平均回收率分別為97.63%、97.66%、96.22%、RSD

分別為0.82%、0.74%、1.21%，均達到相關要求，說明該方

2.7 樣品含量測定 由表5可見，吉林撫松、四川泰華堂、修正藥業(yè)3個廠家的樣品用該方法均能檢出芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚及其含量，表明該方法準確、可靠，可推廣用于六味地黃膠囊的質量控制。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 試驗前查參考文獻[13]得知芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚的最大吸收波長分別為230、236和274 nm。由于所用檢測器為雙波長檢測器，故丹皮酚選擇其最大吸收波長274 nm；而芍藥苷的最大吸收波長230 nm與馬錢苷的最大吸收波長236 nm比較接近，故通過試驗選擇芍藥苷和馬錢苷共用的波長。取同一供試品溶液進樣10 μl，分別在230和236 nm波長下測定芍藥苷和馬錢苷的含量，結果顯示（表6），由于230和236 nm 2個波長比較接近，所以含量測定時影響不大，但由于芍藥苷含量比馬錢苷低，所以選擇了芍藥苷的最大吸收波長230 nm為芍藥苷和馬錢苷的共用檢測波長。

3.2 流動相的選擇 由于是3種物質同時進行分離，芍藥苷、馬錢苷2個苷類物質的極性與丹皮酚酚酸類物質極性相差較大，如果僅采用等度洗脫，很難完全、快速地將3種物質分離，故采用梯度洗脫。開始水相的比例較大，流動相極性較大，將同樣極性較大的芍藥苷和馬錢苷洗脫處理；然后再逐漸加大甲醇的比例，降低流動相極性，將極性較小的丹皮酚洗脫出來；最后由于六味地黃膠囊為中藥復方提取物，雜質較多，反復進樣，易導致色譜柱的柱效下降，且由于采用自動進樣，連續(xù)進樣后會出現雜質峰干擾，因此最后用高濃度甲醇溶液沖洗雜質一段時間。試驗開始時使用的為0.05%的磷酸溶液，但芍藥苷色譜峰拖尾現象嚴重，故加大酸性，采用0.1%的磷酸溶液，峰型因此變得比較對稱。同時試驗中發(fā)現，芍藥苷與馬錢苷的極性比較接近，最開始采用的為甲醇∶0.1%磷酸（25∶75），兩峰大部分重合，逐漸增加水相比例，降低溶劑強度，比例為甲醇∶0.1%磷酸（20∶80）時才使兩峰達到基線分離。

3.3 提取溶劑的選擇

取同一批次樣品（批號120202 85），取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇和甲醇各25 ml，稱定重量，超聲處理（500 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用相應溶劑補足減少的重量，搖勻，濾過，續(xù)濾液用0.45微孔濾膜濾過，分別測定芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚的含量。結果顯示（表7），以甲醇為提取溶劑時馬錢苷與丹皮酚的提取含量最高，以50%甲醇為提取溶劑時芍藥苷的提取含量最高，從含量以及操作方面綜合考慮，選擇甲醇為提取溶劑，與2010版中國藥典品種六味地黃膠囊采用溶劑無差別。

3.4 提取時間的選擇

取同一批次樣品（批號120202 85），取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，分別超聲處理（500 W，40 kHz）20、30、40 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減少的重量，搖勻，濾過，續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，分別測定芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚的含量。結果顯示（表8），超聲30 min基本已提取完全，故超聲時間選擇30 min。

3.5 小結

芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚均具有明確的藥理作用，屬六味地黃膠囊方中的重要有效成分。該試驗建立了同時測定六味地黃膠囊中馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚3種成分含

量的反相高效液相色譜法（RPHPLC），結果表明，芍藥苷在0.066 5～1.663 2 μg、馬錢苷在0.107 9～2.697 7 μg、丹皮酚在0.122 4～3.060 0 μg范圍內均具有良好的線性關系，相關系數（r）分別為0.999 4、0.999 8、0.999 9，平均回收率分別為芍藥苷97.63%（RSD=0.82%）、馬錢苷97.66%（RSD=0.74%）、丹皮酚96.22%（RSD=1.21%）?？梢姡兜攸S膠囊樣品中丹皮酚的含量均符合中國藥典2010版不得低于規(guī)定0.3 mg/粒的規(guī)定[1]。這樣同時測定3個成分，能同時檢測六味地黃膠囊中牡丹皮和酒萸肉的含量，更加方便、快捷和具有代表性。同時該方法穩(wěn)定性和重復性好，可更科學、全面地用于六味地黃膠囊質量控制和評價。

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