陳亞莉　王貴虎　張全星等

摘要 水蛭（螞蝗）是一種重要的中藥材，其唾腺分泌的水蛭素具有抗凝血作用，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療手術(shù)和心血管疾病治療，具有較高的醫(yī)療價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。水蛭腸道微生物與水蛭的消化、營(yíng)養(yǎng)、免疫和抗菌等功能密切相關(guān)，也可能與水蛭素的分泌有關(guān)。對(duì)水蛭腸道微生物的研究方法、菌群組成及作用等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為水蛭腸道微生物的深入研究和利用提供理論和方法參考，為推動(dòng)水蛭養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和擴(kuò)展水蛭和水蛭素的醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 水蛭；腸道微生物；研究方法

中圖分類(lèi)號(hào) S917.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）15-164-03

The Research Progress of Leech Gut Microbes

CHEN Yali1 ， WANG Guihu2， ZHANG Quanxing1 et al

（1. Shaanxi Normal University， Xian， Shaanxi 710062； 2. National Local Joint Engineering Research Center of Biodiagnostics & Biotherapy， Xian Jiao Tong University， Xian， Shaanxi 710004）

Abstract Leech is a traditional Chinese medicine with great importance， its salivary gland secretion hirudin has been widely used into medical surgery， therefore， has a very high economic value. Microbes dwell in leech gut have several functions， such as synthesizing the necessary nutrients for their hosts， stimulating the immune system， and defensing the extraneous pathogens， closely related to the secretion of hirudin and the health of leech. In this research， a review of the study methods， composition and activity of the microbe communities dwell in the Leech gut was given， in order to provide some theoretical and methodological guidance for the further study of gut microbiota in leech， setting theoretical basis for the development of the leech aquaculture industry and for the further expansions of the medical application of hirudin and leech.

Key words Leech； Gut microbes； Research method

動(dòng)物腸道內(nèi)棲息著大量的微生物，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期共同進(jìn)化，最終形成復(fù)雜且呈動(dòng)態(tài)平衡的微生物群落。大量研究表明，這些消化道內(nèi)的微生物對(duì)宿主健康有極其重要的意義，如果微生態(tài)平衡失調(diào)，機(jī)體正常的生理功能便會(huì)紊亂，引發(fā)疾病[1]。動(dòng)物的食性選擇和覓食行為也是經(jīng)歷長(zhǎng)期而復(fù)雜的選擇壓力的進(jìn)化結(jié)果[2]，動(dòng)物自身缺失合成某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力，導(dǎo)致其必須依賴(lài)體內(nèi)的共生菌來(lái)完成相應(yīng)功能，比如幫助宿主從食物中進(jìn)一步攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，合成一些關(guān)鍵代謝反應(yīng)的化合物[3]。因此，動(dòng)物腸道微生物對(duì)宿主的影響及其與疾病等的聯(lián)系已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[4-6]。

水蛭（Leech）隸屬環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)、蛭綱，俗稱(chēng)螞蟥。目前全世界已報(bào)道的水蛭共有300多種[7]，我國(guó)已知2目8科33屬約76種和亞種，廣泛分布于我國(guó)大部分地區(qū)[8]。絕大多數(shù)水蛭靠吸血生存，吸血水蛭每次攝取血液的量相當(dāng)于其自身體重的2.5～10.0倍，吸食1次血液可維持長(zhǎng)達(dá)1年的生存需求[7]。此過(guò)程中，水蛭前端的吸盤(pán)將刺吸性口器刺入皮膚，其咽頭和食道外側(cè)分布的大量唾液腺能分泌具有阻止血液凝固的抗凝劑水蛭素（Hirudin）、麻醉劑以及能使血管寄主擴(kuò)張的類(lèi)組胺（Histamine）物質(zhì)，這類(lèi)物質(zhì)能夠促使傷口血流量增大，抗凝劑能阻止攝入水蛭消化道內(nèi)的血液凝固。在此過(guò)程中，腸道微生物也起著重要的作用，如合成必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、刺激免疫系統(tǒng)和抵抗外來(lái)致病菌的侵襲等[9]。水蛭素具有很好的抗凝血、抗血栓和抗纖維化等作用[10]，在當(dāng)今的醫(yī)療領(lǐng)域中不僅應(yīng)用于術(shù)后緩解靜脈充血，而且廣泛應(yīng)用于整形外科手術(shù)中，提高了手術(shù)的成功率[11]。

傳統(tǒng)的腸道微生物的分離大多采用培養(yǎng)方法，但絕大多數(shù)腸道微生物因?yàn)闊o(wú)法培養(yǎng)而未能進(jìn)行研究和鑒定。隨著新的分子生物學(xué)技術(shù)在腸道微生物研究中的不斷應(yīng)用，尤其是一些分子生物學(xué)方法（如末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Terminalrestriction fragment length polymorphism，TRFLP）和熒光原位雜交（Fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）等）的應(yīng)用，使研究中對(duì)培養(yǎng)方法的依賴(lài)大大降低。這些方法能夠?qū)㈦y以培養(yǎng)以及不能培養(yǎng)的微生物直接進(jìn)行分子鑒定，對(duì)于全面了解腸道微生物的組成、分布及其功能有很大的幫助。筆者對(duì)水蛭腸道微生物的研究方法、腸道微生物的菌群組成以及腸道微生物的作用等方面進(jìn)行了綜述，以期為推動(dòng)水蛭腸道微生物的研究提供理論及方法參考。

1 水蛭腸道的結(jié)構(gòu)

水蛭腸道依據(jù)形態(tài)和功能可分為前腸、中腸和后腸。前腸由咽和食管組成，主要功能是攝取寄主血液（體液）；中腸由嗉囊和嗉囊盲囊組成，主要功能是貯藏食物（寄主血液）。大多數(shù)水蛭的嗉囊有1～12對(duì)向兩側(cè)伸展的盲囊，其中最后1對(duì)最長(zhǎng)并且彎向身體的后方。嗉囊是在水蛭攝食后儲(chǔ)存血液的主要區(qū)域，可以吸收血液中的水和鹽；后腸由腸和直腸組成。腸可以是1根寬闊的縱管，也可以是具有4對(duì)細(xì)長(zhǎng)的側(cè)盲囊，對(duì)血液的消化和吸收在此進(jìn)行。腸的后端通過(guò)一括約肌開(kāi)口在一短而薄壁的直腸上[8]。

2 水蛭腸道微生物的研究方法

2.1 傳統(tǒng)分類(lèi)鑒定方法

由于腸道微生物個(gè)體小、種類(lèi)多、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，形態(tài)特征上很難區(qū)分。以前腸道微生物的研究主要采用微生物分離培養(yǎng)技術(shù)，分為直接觀察法和純培養(yǎng)法。在水蛭腸道微生物的研究中主要采用的是純培養(yǎng)法，即使用不同營(yíng)養(yǎng)成分的固體培養(yǎng)基對(duì)可培養(yǎng)的微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后根據(jù)微生物的菌落形態(tài)及其菌落數(shù)來(lái)計(jì)測(cè)微生物的數(shù)量及其類(lèi)型，若要得到種類(lèi)信息，則需進(jìn)一步地分離、純化和鑒定[12]。人工培養(yǎng)所能獲得的只有自然環(huán)境中很小部分的微生物（0.10%～0.15%），大多數(shù)微生物種類(lèi)由于不能在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而不能被檢出，一些形態(tài)和生化指標(biāo)也易受到操作方法和判斷主觀性影響，從而影響到鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性[13]。

2.2 分子生物方法

20世紀(jì)60年代，隨著分子技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用到水蛭腸道微生物的研究中來(lái)。新的方法大大地降低了對(duì)微生物培養(yǎng)的依賴(lài)性，能將腸道中無(wú)法培養(yǎng)以及難以培養(yǎng)的細(xì)菌分離出來(lái)，因此廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析。水蛭腸道微生物研究中較常用的分子生物學(xué)技術(shù)主要有熒光原位雜交技術(shù)、末端限制性片段長(zhǎng)多態(tài)性和宏基因組技術(shù)等[14]。

末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)可以分析樣品中微生物的組成和不同微生物的種屬關(guān)系，從而進(jìn)行各種微生物群落之間比較群落的多樣性、結(jié)構(gòu)特征等方面的研究。目前，TRFLP 技術(shù)已被廣泛用于分析各種環(huán)境中（如腸道和土壤等）某類(lèi)微生物的群落結(jié)構(gòu)[15-16]，其原理是采用一端熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增全長(zhǎng)16S rRNA 基因，然后用合適的限制性?xún)?nèi)切酶消化 PCR產(chǎn)物，由于不同菌的16S rRNA 基因序列存在差異，因此酶切后會(huì)產(chǎn)生不同長(zhǎng)度特征的限制性片段[17]。該技術(shù)具有快速、重復(fù)性高、靈敏、高通量等優(yōu)點(diǎn)，其缺點(diǎn)是由于 PCR 擴(kuò)增存在偏好性，即使使用通用引物，也有可能忽略微生物生態(tài)群落中某些功能重要但數(shù)量稀少的細(xì)菌[18]。

熒光原位雜交技術(shù)是20世紀(jì)80年代末在已有放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，根據(jù)核酸堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，用半抗原標(biāo)記DNA或者RNA探針與經(jīng)過(guò)變性的單鏈核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，通過(guò)帶有熒光基團(tuán)的抗體去識(shí)別半抗原進(jìn)行檢測(cè)，或者用熒光基團(tuán)對(duì)探針進(jìn)行直接標(biāo)記并與目標(biāo)序列結(jié)合，最后利用熒光顯微鏡直接觀察目標(biāo)序列在細(xì)胞核、染色體或切片組織中的分布情況[19]。熒光原位雜交具有安全、快速、靈敏度高、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)和雜交特異性高等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞遺傳學(xué)、 腫瘤生物學(xué)、基因定位、基因作圖、基因擴(kuò)增、產(chǎn)前診斷及染色體進(jìn)化研究等領(lǐng)域[20] 。

2.3 宏基因組技術(shù)

宏基因組學(xué)（Metagenomics）是指在特定環(huán)境樣品中基因組的總和，宏基因組學(xué)顯著的特征包括非傳統(tǒng)培養(yǎng)方法獲得環(huán)境微生物基因組，所獲得的基因包含可培養(yǎng)的不能培養(yǎng)的微生物的總基因，從而避免了微生物分離培養(yǎng)的難題，能最大限度地挖掘微生物資源，并研究其功能和彼此之間的關(guān)系和相互作用，從而揭示其內(nèi)在規(guī)律[21]。宏基因組學(xué)研究策略包括宏基因組DNA的提取、宏基因組測(cè)序樣品及DNA提取、宏基因組測(cè)序和宏基因組文庫(kù)的制備[22]。宏基因組學(xué)技術(shù)克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的限制，在微生物多樣性、新基因發(fā)現(xiàn)及新生物活性物質(zhì)等方面展現(xiàn)出了前所未有的魅力，現(xiàn)已被已泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、土壤、海洋、人體醫(yī)學(xué)和藥物等各個(gè)領(lǐng)域[23]。

3 水蛭腸道微生物的菌群組成及作用

3.1 水蛭腸道微生物菌群

水蛭腸道的微生物對(duì)于攝取的血食的消化有重要關(guān)系。以前以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的研究認(rèn)為，醫(yī)蛭腸道內(nèi)的微生物主要是氣單胞菌屬（Aeromonas），而且該屬是水蛭消化道里唯一的共生體[24]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的方法和技術(shù)被應(yīng)用到腸道微生物的研究中。Paul 等通過(guò)末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性研究了側(cè)紋醫(yī)蛭（Hirudo verbana）腸道微生物，證實(shí)了側(cè)紋醫(yī)蛭腸道細(xì)菌群體的主導(dǎo)菌是維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）和clone PW3。其中，clone PW3屬于理研菌科（Rikenellaceae）的新種。此外，在腸道中還檢測(cè)到細(xì)菌有α變形菌門(mén)、γ變形菌門(mén)、δ變形菌門(mén)（Proteobacteria）、梭桿菌門(mén)（Fusobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）[15]。Alison等運(yùn)用培養(yǎng)和非培養(yǎng)的限制性片段長(zhǎng)多態(tài)性的方法研究東方醫(yī)蛭（Hirudo orientalis）的消化道微生物，結(jié)果證實(shí)在消化道中的細(xì)菌有維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌（Aeromonas jandaei）、類(lèi)似于理研菌屬（Rikenella）的菌和脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）[25]。隨著研究技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，近年來(lái)有學(xué)者將宏基因技術(shù)應(yīng)用到水蛭腸道微生物的研究中。Michele A.Maltz等應(yīng)用宏基因組的高通量測(cè)序進(jìn)一步對(duì)水蛭腸道微生物菌群進(jìn)行了探究，結(jié)果表明消化道內(nèi)的主要的共生體是：類(lèi)似于理研菌屬（Rikenella）的菌、維氏氣單胞菌（Aeromonas.veronii）和變形桿菌屬（Proteus）。此外，檢測(cè)到的細(xì)菌有梭菌屬（Clostridium）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）和梭桿菌屬（Fusobacterium）[26]。

3.2 水蛭腸道微生物的作用

高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了對(duì)大多數(shù)不能培養(yǎng)的細(xì)菌生理特性、代謝功能及在環(huán)境中的作用的研究，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究醫(yī)蛭腸道微生物的特性[27]。在一些水蛭腸道中發(fā)現(xiàn)維氏氣單胞菌是革蘭氏陰性的兼性厭氧菌，并且許多氣單胞菌屬的菌已經(jīng)鑒定為人以及一些動(dòng)物包括魚(yú)和兩棲類(lèi)的致病菌[28]，能夠引起傷口感染和敗血癥等，預(yù)防性的抗生素能夠減少感染的發(fā)病率[29]。最近的研究熱點(diǎn)是探究水蛭腸道微生物菌群與抗菌素的敏感性[30]。

關(guān)于水蛭腸道微生物的相關(guān)功能，早期的研究者認(rèn)為腸道微生物有3個(gè)主要功能：①輔助血食的消化；②提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；③抵抗外來(lái)致病菌的侵襲[31]。隨后的許多研究表明在腸道里存在宿主產(chǎn)生的蛋白酶，在消化時(shí)細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白酶可能有重要的作用[32]。在后期的研究中發(fā)現(xiàn)水蛭所攝食的血液的消化與腸道的微生物的關(guān)系可能是提供抵抗外來(lái)有害或致病菌的侵入，特定的腸道微生物能夠?yàn)橄瘮z取的血液提供最佳的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境[33]。

4 展望

目前，盡管通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)與非培養(yǎng)的方法在水蛭腸道微生物的研究中取得了一些進(jìn)展，但腸道微生物與宿主之間的作用機(jī)制以及與水蛭素的分泌、水蛭素的質(zhì)量及保存中的作用等問(wèn)題研究較少。由于水蛭素在醫(yī)學(xué)上具有舉足輕重的作用，因此水蛭腸道微生物的功能和作用機(jī)制的研究是今后研究的方向。深入了解水蛭腸道微生物群落組成和功能以及腸道微生物對(duì)水蛭素的影響機(jī)制，對(duì)于醫(yī)療以及相關(guān)腸道疾病的研究都有重要的意義。

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