鄒寧　蔡雯雯　孫東紅等

摘要 研究了0.15、0.30、0.75、1.50 g/L 4種不同硝酸鈉營(yíng)養(yǎng)濃度條件對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)狀況的影響，同時(shí)探究了該試驗(yàn)條件對(duì)雨生紅球藻中蝦青素起始積累期和后期積累量的影響，以尋找既能使雨生紅球藻在氮源用盡后細(xì)胞密度達(dá)到或接近最大，同時(shí)又能最快直接進(jìn)入蝦青素積累階段的硝酸鈉營(yíng)養(yǎng)添加濃度。試驗(yàn)結(jié)果表明，硝酸鈉濃度為0.15 g/L時(shí)雨生紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)狀況最好，細(xì)胞濃度最高可以達(dá)到5.19×105個(gè)/ml。此條件下細(xì)胞尚未停止生長(zhǎng)即已有細(xì)胞開(kāi)始積累蝦青素，變紅（培養(yǎng)的第23天）。使用有機(jī)溶劑萃取法以丙酮提取蝦青素，硝酸鈉濃度為0.15 g/L時(shí)，最終蝦青素濃度達(dá)到19.136 mg/L，是其他硝酸鈉濃度下的蝦青素含量最大值。

關(guān)鍵詞 雨生紅球藻；硝酸鈉濃度；蝦青素；丙酮

中圖分類(lèi)號(hào) S968.41+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）15-232-03

Effect of NaNO3 Concentrations on Growth of Haematococcus pluvialis and Astaxanthin Accumulation

ZOU Ning， CAI Wenwen， SUN Donghong et al

（College of Life Science， Ludong University， Yantai， Shandong 264025）

Abstract Effects of four different NaNO3 concentrations， 0.15， 0.30， 0.75， and 1.50 g/L， on growth of Haematococcus pluvialis and accumulation of astaxanthin were studied. The optimal NaNO3 concentration for growth of H. pluvialis and accumulation of astaxanthin， early as well as high content was determined when nitrogen is depleted. The extracting agent of astaxanthin is acetone in the process. The results showed that the optimal NaNO3 concentration was 0.15 g/L with 5.19×105 cells/ml the maximal cell density and 19.136 mg/L the maximal astaxanthin content， while the astaxanthin accumulation started at 23th day from the culture.

Key words Haematococcus pluvialis； Sodium nitrate content； Astaxanthin； Acetone

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)抗氧化產(chǎn)品的需求量在不斷增加，天然蝦青素作為目前已知的最強(qiáng)的抗氧化劑在抗癌、增強(qiáng)免疫力[1-3]等醫(yī)藥保健和綠色食品添加劑、化妝美容等相關(guān)行業(yè)的需求量不斷攀升，國(guó)內(nèi)外研究人員致力于天然蝦青素產(chǎn)品研制，但蝦青素的純度和產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。探究天然蝦青素的高效生產(chǎn)、提取純化工藝是亟待解決的問(wèn)題。

天然蝦青素的來(lái)源主要是細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌、微藻和甲殼類(lèi)動(dòng)物，其中以利用真菌和藻類(lèi)及甲殼類(lèi)動(dòng)物提取天然蝦青素為主。目前，天然蝦青素的主要分離純化方法有：酶解法[4]、有機(jī)溶劑萃取法、層析法、高效液相色譜法等[5-7]，其中以有機(jī)溶劑萃取法的工業(yè)化應(yīng)用最為廣泛，后兩者由于成本較高等諸多原因多應(yīng)用于產(chǎn)品研發(fā)階段。

雨生紅球藻[8-9]（Haematococcus pluvialis Flotow）被譽(yù)為天然蝦青素的“濃縮品”[10]，因此雨生紅球藻生產(chǎn)天然蝦青素的工藝也成了人們研究的熱點(diǎn)[11]。雖然雨生紅球藻比螺旋藻、小球藻等人類(lèi)常用保健的微藻具有更強(qiáng)的抗氧化能力，但由于其自身營(yíng)養(yǎng)階段對(duì)光照強(qiáng)度敏感[12]、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等特點(diǎn)，使得養(yǎng)殖雨生紅球藻的技術(shù)要求更高，所以雨生紅球藻的大規(guī)模生產(chǎn)較困難，這就意味著雨生紅球藻的商業(yè)化有著很大的發(fā)展前景。

雨生紅球藻有2種細(xì)胞狀態(tài)，即具有鞭毛的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞和無(wú)鞭毛的厚壁孢子。它的繁殖方式為無(wú)性繁殖[13-16]和有性繁殖[17] 。雨生紅球藻在多種逆境脅迫條件下能夠大量并迅速地積累蝦青素[18]，這是雨生紅球藻的自我保護(hù)方式[19]。研究表明，雨生紅球藻只在紅色厚壁孢子階段積累類(lèi)胡蘿卜素，且其中80%以上為蝦青素[20]。

氮是蛋白質(zhì)、核酸、磷脂的主要成分，是細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和酶的組成部分，在植物生命中占有首要地位，被稱(chēng)為生命元素。在雨生紅球藻生長(zhǎng)過(guò)程中氮也是不可缺少的元素，一些國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究了氮對(duì)其生長(zhǎng)的影響，但結(jié)果卻不盡相同。Borowitzka 等認(rèn)為，硝酸鹽對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的效果好于銨鹽[21]，然而，根據(jù)應(yīng)巧蘭等對(duì)797株雨生紅球藻的研究表明，氨氮對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)速率的影響是硝酸鹽的1.5倍[22]。有關(guān)硝酸鹽濃度的研究中，Borowitzka 等得出對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)最有利的硝酸鹽濃度范圍是0.5～1.0 g/L[21]。而吳長(zhǎng)斌等的研究結(jié)果與Borowitzka 等的研究相差甚遠(yuǎn)[22]。由于結(jié)果的不一致，近幾年對(duì)氮素濃度的研究也是有關(guān)雨生紅球藻生長(zhǎng)與蝦青素積累研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一[24-26]。

工業(yè)生產(chǎn)中生產(chǎn)工藝時(shí)間的縮短，必然帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)利益。筆者的研究目的便是探究能使雨生紅球藻從生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)入蝦青素積累階段的時(shí)間縮短的氮濃度條件。雨生紅球藻的工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中氮源常有剩余，且這些未耗盡的氮源無(wú)法回收利用，或回收成本過(guò)高，因而造成資源和成本的浪費(fèi)，故而該研究對(duì)于雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的工藝時(shí)間的縮短以及成本投入的降低和利潤(rùn)的提高都有較大的指導(dǎo)意義。

筆者研究了4種不同的硝酸鈉濃度（0.15、0.30、0.75、150 g/L）對(duì)雨生紅球藻的生長(zhǎng)及蝦青素積累的影響，探究此4種試驗(yàn)條件中何種氮濃度條件下雨生紅球藻在氮源耗盡后可立即進(jìn)入蝦青素積累階段并最終獲得較高細(xì)胞密度和蝦青素積累量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種。

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis Flotow），藻種由魯東大學(xué)藻類(lèi)研究所提供。

1.1.2 主要試劑。

次氯酸鈉，硫代硫酸鈉，檸檬酸鐵，磷酸二氫鉀，檸檬酸，EDTANa2 ，CaCl2， H3BO3，Na2MnO4·2H2O，ZnSO4，MnCl2·4H2O，CuSO4·5H2O。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備。

UV4802H型分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；

PHS3C型酸度計(jì)，上海雷磁儀器廠；

FY1HN型真空泵，浙江飛越機(jī)電有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雨生紅球藻培養(yǎng)基的配制。

使用BG11培養(yǎng)基，配制4個(gè)5 000 ml體系的培養(yǎng)基，并對(duì)4個(gè)體系作不同的處理，使其硝酸鈉濃度分別為 0.15、0.30、0.75、1.50 g/L。

1.2.2 雨生紅球藻培養(yǎng)條件的控制。

在室溫條件下，將4組不同硝酸鈉濃度的藻液放到日光下培養(yǎng)，pH范圍7.5～90，剛開(kāi)始藻種密度低時(shí)放在陽(yáng)光不強(qiáng)的地方，以免光照太強(qiáng)藻種光氧化。用ACO系列電磁式空氣泵通氣，供以無(wú)機(jī)碳源。根據(jù)光合作用的原理每天日升前接通空氣泵電源給藻液通氣，日落后切斷空氣泵的電源，既可保證雨生紅球藻生長(zhǎng)過(guò)程中光合作用所需無(wú)機(jī)碳源的供應(yīng)又可節(jié)約能源，提高了能源的利用率。

1.2.3 雨生紅球藻生長(zhǎng)測(cè)定。

雨生紅球藻細(xì)胞密度測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)板顯微細(xì)胞計(jì)數(shù)法[21，23]。 細(xì)胞干重的測(cè)定采用分光光度法，使用分光光度計(jì)在674 nm下測(cè)雨生紅球藻藻液的吸光度[27]，確定細(xì)胞干重和吸光度之間的關(guān)系。OD674 nm值和細(xì)胞干重之間的相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

1.2.4 蝦青素的提取方法。

使用有機(jī)溶劑萃取法提取蝦青素。研究表明，以丙酮作為萃取劑來(lái)提取蝦青素的效果好于其他有機(jī)溶劑[28]，且根據(jù)魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室以往經(jīng)驗(yàn)，丙酮萃取雨生紅球藻中蝦青素的效果要好于乙醇等其他有機(jī)溶劑，故該試驗(yàn)使用丙酮提取雨生紅球藻中的蝦青素。

取5 ml雨生紅球藻在藻液離心后去除上清液，用丙酮分3次進(jìn)行提取，之后將3次提取液合并并定容至10 ml，用分光光度計(jì)測(cè)定其OD473值。

1.2.5 蝦青素的計(jì)算方法。蝦青素含量計(jì)算公式如下：

蝦青素含量（mg/L）=4×A475×丙酮的體積/樣品體積[29]

據(jù)有關(guān)資料記載，蝦青素在475 nm處有最高吸收波峰，由于儀器設(shè)備存在差異，經(jīng)測(cè)定蝦青素在該試驗(yàn)所用的分光光度計(jì)中最高吸收波峰為473 nm。故該試驗(yàn)所用公式為：

蝦青素含量（mg/L）=4×OD473×丙酮的體積/樣品體積

2 結(jié)果與分析

2.1 硝酸鈉濃度對(duì)雨生紅球藻密度的影響 雨生紅球藻在不同硝酸鈉濃度下從培養(yǎng)第0天至第102天內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目的變化如圖2所示。由圖2可以看出，在4個(gè)不同硝酸鈉濃度下，雨生紅球藻細(xì)胞的數(shù)量隨著時(shí)間的推移均逐漸增多。在0～4 d時(shí)間內(nèi)，各硝酸鈉濃度下的細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)幅度相似，但從第4天之后，細(xì)胞數(shù)量的增長(zhǎng)狀況出現(xiàn)了差別。在7～12 d時(shí)，雨生紅球藻生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，硝酸鈉濃度為0.15 g/L的反應(yīng)器中所測(cè)得的細(xì)胞數(shù)目最多，為2.23×105個(gè)/ml；硝酸鈉濃度為0.3和0.75 g/L的反應(yīng)器中測(cè)得的細(xì)胞數(shù)目相似，為（2.1±0.1）×105個(gè)/ml；而硝酸鈉濃度為150 g/L的反應(yīng)器中測(cè)得的細(xì)胞數(shù)目最少。進(jìn)入穩(wěn)定期后，硝酸鈉濃度為0.15 g/L條件下生長(zhǎng)的雨生紅球藻的細(xì)胞數(shù)目較平穩(wěn)地高于其他三者，其細(xì)胞數(shù)目最終達(dá)到5.194×105個(gè)/ml。 0.75 g/L的硝酸鈉濃度的反應(yīng)器中雨生紅球藻生長(zhǎng)狀況次之，細(xì)胞濃度最終為4.961×105個(gè)/ml。硝酸鈉濃度為0.30 g/L的反應(yīng)器中雨生紅球藻的生長(zhǎng)狀況最差，細(xì)胞濃度為3.726×105個(gè)/ml。硝酸鈉濃度為1.50 g/L的反應(yīng)器中的細(xì)胞數(shù)目變化趨勢(shì)線低于0.75 g/L的條件下的雨生紅球藻細(xì)胞數(shù)目變化趨勢(shì)線，但試驗(yàn)結(jié)束時(shí)細(xì)胞數(shù)達(dá)5.511×105個(gè)/ml。綜合經(jīng)濟(jì)效益、生產(chǎn)效率等因素，從該試驗(yàn)的結(jié)果可見(jiàn)，推薦選用0.15 g/L硝酸鈉濃度培養(yǎng)雨生紅球藻。

2.2 硝酸鈉濃度對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞干重的影響 由圖3可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加雨生紅球藻的細(xì)胞干重呈上升趨勢(shì)。前期4種硝酸鈉濃度條件下生長(zhǎng)的雨生紅球藻都出現(xiàn)了細(xì)胞干重的快速增加的情況。培養(yǎng)約7 d后，不同硝酸鈉濃度條件下生長(zhǎng)的雨生紅球藻的細(xì)胞干重出現(xiàn)了差異。試驗(yàn)最后，硝酸鈉濃度為0.15 g/L的條件下生長(zhǎng)的雨生紅球藻細(xì)胞干重最高，為1.525 3 g/L； 硝酸鈉濃度為0.30 g/L的條件下生長(zhǎng)的雨生紅球藻的細(xì)胞干重最低，為0.719 2 g/L；硝酸鈉濃度為0.75 g/L條件下的雨生紅球藻的細(xì)胞干重為0.757 6 g/L；硝酸鈉濃度為1.50 g/L的條件下生長(zhǎng)的雨生紅球藻的細(xì)胞干重為0.949 9 g/L。

2.3 硝酸鈉濃度對(duì)雨生紅球藻中蝦青素積累的影響

試驗(yàn)過(guò)程中的鏡檢結(jié)果表明，在雨生紅球藻培養(yǎng)的第23天，即雨生紅球藻生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，硝酸鈉濃度條件為0.15 g/L的反應(yīng)器中的雨生紅球藻即開(kāi)始積累蝦青素，細(xì)胞開(kāi)始變紅。蝦青素最終含量達(dá)19.136 mg/L，占細(xì)胞干重的1.26%，高于其他試驗(yàn)條件下的蝦青素含量（圖4、5）。

圖4所示為4種不同的硝酸鈉濃度條件下的雨生紅球藻最終的蝦青素積累量。圖5所示為4種不同的硝酸鈉濃度條件下的雨生紅球藻培養(yǎng)過(guò)程中蝦青素積累的情況。硝酸鈉濃度條件為0.30 g/L的反應(yīng)器中的雨生紅球藻最終蝦青素含量為12.848 mg/L，占細(xì)胞干重的1.787%；硝酸鈉濃度條件為0.75 g/L的反應(yīng)器中的雨生紅球藻最終蝦青素積累量為15.872 mg/L，占細(xì)胞干重的2.09%；硝酸鈉濃度條件為1.50 g/L的反應(yīng)器中的雨生紅球藻蝦青素最終積累量為10.888 mg/L，占細(xì)胞干重的1.146%。

3 結(jié)論

在硝酸鈉濃度條件分別為0.15、0.30、0.75、1.50 g/L，而其他培養(yǎng)條件相同的情況下，硝酸鈉濃度為0.15 g/L的反應(yīng)器中雨生紅球藻生長(zhǎng)狀況最好，且在氮源耗盡后最先開(kāi)始積累蝦青素并獲得最高的蝦青素積累量，為19.136 mg/L，占細(xì)胞干重的1.26%。

目前，在雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的工業(yè)中常使用的氮濃度條件為1.50 g/L，生產(chǎn)中未利用的氮回收困難，造成成本和資源的浪費(fèi)。前人研究論文中所得培養(yǎng)雨生紅球藻的最優(yōu)氮濃度為0.75 g/L，該研究所得結(jié)論的最優(yōu)硝酸鈉濃度015 g/L，低于前人研究所得最優(yōu)氮濃度，更是工業(yè)用1.50 g/L的氮濃度條件的1/10。

且在培養(yǎng)的第23天，硝酸鈉濃度為0.15 g/L的試驗(yàn)條件下的雨生紅球藻先于其他3個(gè)試驗(yàn)條件下的雨生紅球藻進(jìn)入蝦青素積累階段，并最終獲得該試驗(yàn)條件下最高的蝦青素積累量，19.136 mg/L，是1.50 g/L硝酸鈉濃度條件下蝦青素積累量的1.758倍，是0.75 g/L的硝酸鈉濃度條件下蝦青素積累量的1.206倍。

該試驗(yàn)得出的雨生紅球藻培養(yǎng)所需硝酸鈉濃度低于工業(yè)用氮濃度和前人研究所得培養(yǎng)雨生紅球藻的最優(yōu)氮濃度條件，對(duì)雨生紅球藻生產(chǎn)工藝上時(shí)間的縮短和成本投入的降低有一定參考意義。

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