楊春琳，許秀蘭，徐明慶，劉應(yīng)高*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，四川 雅安 625014；2.攀枝花市東區(qū)林業(yè)局，四川 攀枝花 617067)

云杉屬(Picea Dietr.)植物為高大常綠喬木，分布于北半球溫帶及亞熱帶山地，全球現(xiàn)約有40 種，中國約有20 種。云杉是中國西部海拔1 000～4 500 m地區(qū)的主要造林樹種。隨著云杉廣泛栽種，由散斑殼菌(Lophodermium sp. )引起的落針病日趨嚴(yán)重，對林木健康生長已造成影響。筆者以四川川西云杉(P. balfouriana)為研究對象，測定不同海拔云杉針葉枯死脫落前的生理生化指標(biāo)，以期探明云杉落針前期針葉生理變化，為有效防治云杉落針病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試云杉

選擇四川省甘孜州瀘定縣馬廠梁林場(位于四川西部，青藏高原東部邊緣，東經(jīng)101°46′ ～ 102°25′，北緯29°54′ ～30°10′)海拔高度2 500 ～2 800 m 的川西云杉林為研究對象。

1.2 方法

1.2.1 樣地環(huán)境和云杉落針病害調(diào)查

采用分級計數(shù)法，試驗地選擇海拔高度2 590、2 690 和2 790 m 的3個樣地，每樣地選取發(fā)病普遍的林分標(biāo)準(zhǔn)地10 塊(10 m×10 m)。按照云杉落針程度分為4 級，即：0 級代表未發(fā)病植株；Ⅰ級代表植株針葉變黃，少量脫落，針葉發(fā)病百分率區(qū)間為(0，30]；Ⅱ級代表植株針葉多數(shù)變黃、變褐，針葉發(fā)病百分率區(qū)間為(30，65]；Ⅲ級代表植株針葉大量枯死，幾乎完全脫落，針葉發(fā)病百分率區(qū)間為(65，100]。于2013年3、5、7、10月對各樣地環(huán)境狀況、云杉落針發(fā)病植株數(shù)等進(jìn)行記錄，計算病情指數(shù)。

1.2.2 云杉針葉生化指標(biāo)測定

對每海拔各病級云杉，隨機(jī)采樣(考慮到數(shù)據(jù)的合理性和科學(xué)性，每次均定點采樣，即每水平定點選取2 ～3 株植株進(jìn)行隨機(jī)采樣，采樣地均在向陽面)，同一海拔不同病級云杉采集1年生針葉約20g，編號后存于冰桶中，用于生理生化指標(biāo)測定。采樣與病害調(diào)查同時進(jìn)行。

過氧化物酶(POD)與過氧化氫酶(CAT)活性測定參照文獻(xiàn)[2]的方法；多酚氧化酶(PPO)活性測定參照閻鑒等[3]的方法；苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定參照謝世勇[4]的方法；針葉葉綠素含量測定參照朱蓮等[5]的方法；丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸顯色法[6]。重復(fù)測定3次，酶活以相對酶活性表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0和Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計和分析。采用Duncan 法進(jìn)行多重比較分析，同時運用Origin 8.5 進(jìn)行繪圖。為便于數(shù)據(jù)分析，依據(jù)試驗地實際情況，將病原菌的一個侵染循環(huán)分為侵染前期(3—5月)、侵染期(5—9月)和侵染后期(9—11月)。

2 結(jié)果與分析

2.1 海拔高度對云杉落針病害的影響

樣地川西云杉均為17 ～20 齡幼林，密度6.5×103株/hm2左右。幼齡林發(fā)病在林場范圍內(nèi)相當(dāng)普遍，呈版塊狀分布，已嚴(yán)重影響到林場云杉正常生長發(fā)育和蓄材。表1 表明，海拔越高，云杉落針病病情指數(shù)就越高。經(jīng)調(diào)查統(tǒng)計，在海拔2 790 m 處，云杉平均發(fā)病植株率為72.13%；海拔2 690 m 處為70.57%；海拔2 590 m 處為52.1%。在發(fā)病最嚴(yán)重的10月，海拔2 790 m 處云杉發(fā)病株率達(dá)到80%；海拔2 690 m 處達(dá)76.08%；海拔2 590 m 處僅53.27%。

表1 不同海拔高度云杉的病情指數(shù) Table 1 Disease indexes of P. balfouriana at different altitudes

2.2 川西云杉針葉生化指標(biāo)變化

2.2.1 酶活性變化

由表2 可知，不同海拔，云杉落針病的病級越高，其針葉POD 活性也越高，且不同病級間差異顯著；同一病級針葉中POD 活性，海拔2 650 m 處最高，海拔2 590 m 處最低。不同病級POD 活性變化呈先下降后上升或下降后上升再下降趨勢。各月份間，針葉POD 活性差異不大。

表2 各海拔高度不同病級云杉針葉的POD 活性 Table 2 POD activities of different disease level P. balfouriana at three altitudes

表2 (續(xù))

表3 表明，病級為Ⅱ、Ⅲ級的云杉針葉的PPO活性高于病級為0、Ⅰ級的PPO 活性，兩者間差異顯著。同一病級，2 590 m 處PPO 活性低于其余2處。不同病級，PPO 活性變化大多數(shù)呈下降后再上升趨勢。

表3 各海拔不同病級云杉針葉的PPO 活性 Table 3 PPO activities of different disease level P. balfouriana at three altitudes

由表4 知，隨病級增加，各海拔高度云杉針葉的CAT 活性變化無明顯規(guī)律。同一病級針葉的CAT活性，高海拔的略高于低海拔處。海拔2 590 m 處不同病級云杉CAT 活性變化呈下降再上升趨勢；海拔2 690 和2 790 m 處病級為Ⅱ、Ⅲ級的云杉的CAT活性變化呈先上升后下降再上升趨勢。

表4 各海拔不同病級云杉針葉的CAT 活性 Table 4 CAT activities of different disease level P. balfouriana at three altitudes

由表5 可知，病級越高，云杉針葉PAL 活性也越高(10月除外)，且差異顯著。同一病級云杉針葉，高海拔處PAL 活性略高于低海拔處。不同病級中，多數(shù)云杉針葉PAL 活性變化呈先下降再上升趨勢，特別是海拔2 590 m 處，但后期PAL 活性較前期低。

表5 各海拔不同病級云杉針葉的PAL 活性 Table 5 PAL activities of different disease level P. balfouriana at three altitudes

2.2.2 葉綠素含量變化

表6 顯示，葉綠素a(Chl a)較葉綠素b(Chl b)變化不規(guī)律，但病級為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級的云杉針葉Chl a 含量最終均有不同程度增加，而健康云杉的Chl a含量變化較大，最終降低至較低水平，同時與其他病級間差異顯著；Chl b 含量變化則與Chl a 相反，即病級越高，各海拔云杉針葉的Chl b 含量越低，但病級間差異不明顯。另外，病級為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級的云杉針葉的Chl b 含量最終有不同程度減少，而健康云杉的Chl a 含量最終有一定程度的增加。不同病級中，云杉針葉Chl b 含量變化多呈先上升后下降趨勢。

表6 各海拔不同病級云杉針葉中的葉綠素a 和葉綠素b 含量 Table 6 Chl a (chl b) concentration of different disease level P. balfouriana at three altitudes

在各海拔處，病級越高，云杉針葉的總?cè)~綠素含量在減少，總?cè)~綠素含量呈先上升后下降趨勢；在海拔2 590 m 處，病級為0、Ⅰ、Ⅱ的云杉，針葉總?cè)~綠素含量在侵染初期還有下降過程，但最終總?cè)~綠素含量均有不同程度的減少(表7)。

表7 各海拔不同病級云杉中總?cè)~綠素含量 Table 7 Chl (a+b) concentration of different disease level P. balfouriana at three altitudes

2.2.3 MDA 含量變化

表8 中，健康云杉的MDA 含量基本都顯著低于發(fā)病云杉。此外，MDA 含量在侵染后期多數(shù)比前期高。總體而言，同一病級云杉針葉MDA 含量，高海拔處的比低海拔處要高。

表8 各海拔不同病級云杉中的MDA 含量 Table 8 MDA concentration of different disease level P. balfouriana at three altitudes

3 結(jié)論與討論

試驗樣地的云杉為幼齡林，散斑殼菌為其主要病原菌[7]，該菌侵染周期為2年，共經(jīng)歷5個階段[8]。1) 5—9月為子囊孢子釋放期，子囊果成熟并破裂，同時釋放子囊孢子經(jīng)氣孔或傷口等侵染針葉；2) 9—11月為癥狀發(fā)生期，針葉逐漸變?yōu)辄S褐色或紅褐色；3) 11 至次年3月為休眠期，病原菌以菌絲體等形式在針葉體內(nèi)越冬，針葉癥狀無明顯變化；4) 翌年3—5月為脫落期，前年被侵染針葉逐漸脫落，同時子囊果逐漸形成；5) 進(jìn)入下一輪侵染循環(huán)，針葉中子囊孢子釋放后，針葉逐漸被地表腐生物所分解。病原菌的持續(xù)侵染，可能導(dǎo)致寄主體內(nèi)代謝紊亂，活性氧(ROS)含量增加[9]。本研究結(jié)果表明，隨月份變化，云杉針葉POD 和CAT 酶活性均有所增加，兩者在清除機(jī)體多余ROS 方面發(fā)揮了一定作用。有報道稱，CAT 較POD 具有更高的H2O2催化效率[10]，但病原菌引起機(jī)體過敏性反應(yīng)(HR)時，CAT 活性將會受到抑制[11]，這不利于ROS 的有效清除。另外，H2O2激增會反作用于病原菌[12]，但過多H2O2會誘發(fā)植物細(xì)胞HR，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。PPO 和PAL 活性前期均較高，對病原菌有一定抑制作用，但后期偏低，說明兩者不能有效防御病原菌的侵染。隨著海拔升高，云杉針葉的POD、PPO 和CAT活性以及MDA含量均有不同程度升高(PAL活性無顯著差異)，而且隨病級增加有所增加，這說明海拔越高，云杉所承受的干擾力度越強(qiáng)(病級越高也是一樣)，體內(nèi)會迅速產(chǎn)生并積累ROS，這種氧化猝發(fā)可能激活各防御酶基因，使其迅速轉(zhuǎn)錄并翻譯酶蛋白，從而參與機(jī)體的抗病反應(yīng)[14–15]。同時，這種氧化猝發(fā)也可能導(dǎo)致機(jī)體的蛋白質(zhì)大量氧化，從而誘導(dǎo)機(jī)體自噬來緩解氧化脅迫[16]。雖然海拔越高，病級越高，各防御酶活性均有所升高，但MDA含量也在增加，這說明機(jī)體ROS 并沒有因防御酶活性的增加而得到有效清除。可能是病原菌的持續(xù)侵染，使寄主細(xì)胞的DNA 遭受了損傷[17]，最終使機(jī)體的ROS 含量增加，促使膜脂的進(jìn)一步氧化。近來研究[18]發(fā)現(xiàn)，病菌持續(xù)侵染也會誘導(dǎo)寄主細(xì)胞自噬而發(fā)生過敏反應(yīng)程序性細(xì)胞死亡(HR–PCD)，這也能引起氧化猝發(fā)而使MDA 含量增加，而病原菌誘發(fā)HR–PCD 可能是導(dǎo)致云杉大量落針的主要原因。另外，總?cè)~綠素含量隨病級增加而減少，而且不同病級云杉的總?cè)~綠素含量最終均有不同程度減少，也表明病原菌的持續(xù)侵染逐漸降低了針葉的光合作用。

[1] 楊春琳，許秀蘭，黃曉麗，等．粗枝云杉幼林落針病的生理生化特性[J]．東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，42(9)：148–152．

[2] 高俊鳳．植物生理學(xué)試驗指導(dǎo)[M]．北京：高等教育出版社，2006：217–219．

[3] 閻鑒，麻彥明，張云龍，等．油松不同器官多酚氧化酶年變化規(guī)律的研究[J]．山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001(2)：135–137．

[4] 謝世勇，盧同，李本金，等．苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶與甘薯抗青枯病的關(guān)系[J]．福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2003，18(4)：236–238．

[5] 朱蓮，劉應(yīng)高，李賢偉．老鷹茶白粉病罹病植株的生理生化研究[J]．華北農(nóng)學(xué)報，2007，22(增刊)：266–270．

[6] 李合生．植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M]．北京：高等教育出版社，2003：165–260．

[7] 邱書志．云杉落針病發(fā)病規(guī)律的研究[J]．西北林學(xué)院學(xué)報，1998，13(4)：76–81．

[8] Jasinski J P P，Payette S．Holocene occurrence of Lophodermium piceae，a black spruce needle endophyte and possible paleoindicator of boreal forest health[J]. Quaternary Research，2007，67(1)：50–56．

[9] 薛鑫，張芊，吳金霞．植物體內(nèi)活性氧的研究及其在植物抗逆方面的應(yīng)用[J]．生物技術(shù)通報，2013(10)：6–11．

[10] Kinnula V L，Lehtonen S，Sormunen R，et al. Overexpre- ssion of peroxiredoxins Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ，and in Ⅵmalignant mesothelioma[J]．Journal of Pathology，2002，196(3)：316–323．

[11] 劉延忠，王利民，李昶，等．植物細(xì)胞程序性死亡調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展[J]．山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，44(11)：58–60．

[12] 郭澤建，李德葆．活性氧與植物抗病性[J]．植物學(xué)報，2000，42(9)：881–891．

[13] Levine A，Tenhaken R，Dixon R，et al．H2O2from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response[J]．Cell，1994，79(4)：583．

[14] Choi D，Bostock R M，Avdiushkos，et al. Lipid-derived signals that discriminate wound and pathogen-responsive isoprenoid pathways in plants：Methyl jasmonate and the fungal elicitor arachiclonic acid induce different 3–hydroxy–3 methylglutary–l coenzyme A reductasegenes and antimicrobial isoprenoids in Solanum tuberosum L[J]．Porc Natl Acad Sci USA，1994，91(6)：23–29．

[15] 吳明江，于萍．植物過氧化物酶的生理作用[J]．生物學(xué)雜志，1994(6)：14–16．

[16] Xiong Y，Contento A L，Nguyen P Q，et al．Degradation of oxidized proteins by autophagy during oxidative stress in Arabidopsis[J]．Plant Physiol，2007，143(1)：291–299．

[17] 鐘鳴，陳琢，劉宛，等．逆境脅迫下植物DNA 損傷和DNA 錯配修復(fù)研究進(jìn)展[J]．生態(tài)學(xué)雜志，2012，31(9)：2404–2411．

[18] Liu Y L，Schiff M，Czymmek K，et al．Autophagy regulates programmed cell death during the plant innate immune response[J]．Cell，2005，121(4)：567–577．