陳雯，李英倫，葉剛，施飛

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014)

酒石酸泰樂(lè)菌素即泰樂(lè)菌素酒石酸鹽，其在腸道吸收好，體內(nèi)分布快，血藥濃度高，對(duì)G+和一些G–有效，其中對(duì)支原體作用最強(qiáng)，臨床上常用于防治雞慢性呼吸道疾病、豬支原體肺炎[1]。酒石酸泰樂(lè)菌素為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的混合物。泰樂(lè)菌素A(TA)是其主要的物質(zhì)，在發(fā)酵的過(guò)程中會(huì)形成相關(guān)的組分，即泰樂(lè)菌素B(TB)、泰樂(lè)菌素C(TC)、泰樂(lè)菌素D(TD)[2]。桔梗(Platycodongrandiflorum)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦、辛，性平，歸肺經(jīng)。《藥鑒》稱其“誠(chéng)諸藥之舟楫，肺經(jīng)之引藥也”；《景岳全書》曰“用此者，用其載藥上升，故有舟楫之號(hào)”。在現(xiàn)今運(yùn)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的方法研究傳統(tǒng)中醫(yī)藥已成為趨勢(shì)，學(xué)者對(duì)桔?！拜d藥上行”的現(xiàn)代化研究已有了一定成果。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中，利用化學(xué)藥物結(jié)構(gòu)明晰，便于檢測(cè)的特點(diǎn)，將桔梗(肺經(jīng)藥物)與化學(xué)藥物混合使用，發(fā)現(xiàn)桔梗能改變羅紅霉素在兔體內(nèi)的組織分布狀況，其在肺中的分布時(shí)間提前，并提高了藥物在肺中的濃度[3]。同時(shí)，通過(guò)研究桔梗水煎液對(duì)雞藥代動(dòng)力學(xué)特征的影響等，發(fā)現(xiàn)桔梗有明顯的“引經(jīng)”作用，能使左氧氟沙星在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征更加明顯[4]。本試驗(yàn)中利用酒石酸泰樂(lè)菌素結(jié)構(gòu)清晰、便于定量檢測(cè)的特點(diǎn)，將石油醚萃取的桔梗醇提取物與酒石酸泰樂(lè)菌素混合使用，探討桔梗提取物對(duì)酒石酸泰樂(lè)菌素在小鼠體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄的影響，旨在為進(jìn)一步探索桔梗發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試動(dòng)物

SPF 級(jí)昆明小鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量為18 ～22g，由簡(jiǎn)陽(yáng)達(dá)碩動(dòng)物科技有限公司提供，編號(hào)為SCXK(川)2013–24。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

Agilent 高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；HC–3017 高速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳公司)；渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；GZX–9076MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；SY–5000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；雷磁PHS–3C pH 計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；HANGPING YP502N 電子天平(福州華志科學(xué)儀器有限公司)。

1.1.3 主要藥品與試劑

川桔梗(Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC)的干燥根部，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院范巧佳先生鑒定為正品，購(gòu)自雅安康盛中藥材有限公司；酒石酸泰樂(lè)菌素購(gòu)自浙江普洛康裕制藥有限公司，批號(hào)為1208013；酒石酸泰樂(lè)菌素對(duì)照品由四川省獸藥監(jiān)察所提供；高氯酸鈉、乙腈、甲醇為色譜級(jí)，石油醚為AR 級(jí)。

1.2 方法

1.2.1 桔梗石油醚醇提取物的制備

稱取川桔梗粉末100g 于3 000mL 圓底燒杯中，按1∶8(m∶V)加入95%乙醇，回流提取2次，每次2 h。合并2次提取液，濃縮揮干乙醇，用水定容至100mL，得到1g/mL 的桔梗醇提取物。取10mL 醇提取液，用石油醚按1∶1 萃取，重復(fù)萃取3次，合并石油醚萃取液并濃縮揮干石油醚，備用。

1.2.2 供試液的配制

精密稱取酒石酸泰樂(lè)菌素藥品3g，置于100mL 容量瓶中，加入桔梗石油醚醇提取物(約0.15g)，加入0.5%吐溫–80，用水溶解并定容至100mL，得到桔梗試驗(yàn)組供試液，備用。精密稱取酒石酸泰樂(lè)菌素藥品3g，置于100mL 容量瓶中，加入0.5%吐溫–80，用水定容至100mL，得到空白組供試液，備用。

1.2.3 給藥及采樣方法

小鼠禁食過(guò)夜，隨機(jī)分組，使每個(gè)時(shí)間點(diǎn)有4只小鼠，按0.2mL/10g 體質(zhì)量灌服供試液，分別于服藥后10、20、30、40、50、60、80、100、120、180、240、360min 采血，置于抗凝管中，離心(3 000 r/min)10min，取血漿，置于–20℃冰箱凍存，待測(cè)；采血后剖解小鼠，分離各組織(心、肝、肺、腎)，并用生理鹽水清洗干凈，置于–20℃冰箱凍存，待測(cè)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿及組織中的藥物濃度。

1.2.4 酒石酸泰樂(lè)菌素含量的測(cè)定

1) 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液的配制。精密稱取酒石酸泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品32.0mg，置于100mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至100mL，得質(zhì)量濃度為320μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，備用。

2) 色譜條件的選定。色譜柱為ODS C18色譜柱(150 nm ×4.6 nm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈–高氯酸鈉(2 mol/L，pH 值為2.5±0.1)，體積比為40 60∶ ；流速為1.0mL/min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

3) 血漿及組織樣品的制備。血漿樣品制備：取小鼠血漿0.5mL，加入乙腈1.5mL，漩渦混合2min，超聲波振蕩10min，12 000 r/min 離心10min，上清液用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，取20 μL 過(guò)濾液直接進(jìn)樣。組織樣品制備：按1g組織加入1mL 蒸餾水的比例進(jìn)行勻漿，充分勻漿后，取0.25mL 于PE 管中，加入乙腈0.75mL，漩渦混合2min，超聲波振蕩10min，離心15min，上清液用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，取20 μL 過(guò)濾液直接進(jìn)樣。

4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別取空白血漿0.5mL，依次加入酒石酸泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)貯備液，使質(zhì)量濃度依次為32、16、8、4、2μg/mL。按上述血漿樣品制備方法處理空白血漿并進(jìn)行HPLC 分析，記錄色譜圖及峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，藥物濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。運(yùn)用最小二乘法將峰面積對(duì)藥物濃度進(jìn)行回歸分析，得到酒石酸泰樂(lè)菌素血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取出組織勻漿0.25mL，依次加入酒石酸泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配制成含酒石酸泰樂(lè)菌素的系列濃度(64、32、16、8、4、2μg/mL)，按組織樣品制備方法處理組織勻漿并進(jìn)行HPLC 分析，以峰面積Y 對(duì)泰樂(lè)菌素濃度C 進(jìn)行線性回歸，得到各組織標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

5) 血漿回收率和精密度試驗(yàn)。按上述方法配制低、中、高3 種濃度(分別為2、8、32μg/mL)的酒石酸泰樂(lè)菌素血漿樣品3 份，24 h 內(nèi)按血漿處理方法及色譜分析方法平行測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定3 d，每天1次，計(jì)算日間精密度。配制32、8、2μg/mL 3個(gè)濃度的酒石酸泰樂(lè)菌素血漿樣品，按血漿樣品處理方法操作，以與3個(gè)劑量對(duì)應(yīng)的相同進(jìn)樣量的對(duì)照品進(jìn)行分析，計(jì)算絕對(duì)回收率和相對(duì)回收率。

絕對(duì)回收率=血漿樣品處理后所得的峰面積/對(duì)應(yīng)濃度的對(duì)照品的峰面積×100%；相對(duì)回收率=實(shí)際測(cè)得峰面積計(jì)算出的濃度/血漿樣品實(shí)際加入標(biāo)準(zhǔn)品的濃度×100%。

6)組織樣品的回收率及精密度試驗(yàn)。取小鼠空白組織勻漿0.25mL，加入酒石酸泰樂(lè)菌素對(duì)照品，配制低、中、高3 種濃度(2、8、64μg/mL)，24 h 內(nèi)平行測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)3 d，計(jì)算日間精密度。另配制低、中、高3 種濃度(2、8、64μg/mL)組織樣品，按組織樣品制備方法處理樣品，計(jì)算組織樣品的相對(duì)回收率、絕對(duì)回收率。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用PKsolver 軟件進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)分析；血液及組織的藥物濃度采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 血漿樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以酒石酸泰樂(lè)菌素峰面積(Y)對(duì)血漿藥物濃度(C) 進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=15.495C－0.229 2，r=0.999 7。

2.2 組織樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以酒石酸泰樂(lè)菌素峰面積(Y)對(duì)各組織中的藥物濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得到各組織的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程等見表1。各組織酒石酸泰樂(lè)菌素色譜圖見圖1。

表1 酒石酸泰樂(lè)菌素在各組織中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 Table 1 Standard curve of tylosin tartrate in several tissues

圖1 各組織空白組與桔梗試驗(yàn)組的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖 Fig.1 Standard chromatograms of tylosin tartrate in controlgroups and treatmentgroups

2.3 血漿的回收率和試驗(yàn)的精密度

從表2 可以看出，血漿中3 種質(zhì)量濃度酒石酸泰樂(lè)菌素的絕對(duì)回收率均大于75%，藥物提取率均較高，說(shuō)明血漿樣品處理方法能使酒石酸泰樂(lè)菌素較好的從血漿中分離；血漿樣品精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值均小于5%，符合生物供試品分析的要求，證明本試驗(yàn)所采用的測(cè)定方法和血漿樣品 處理方法可靠。

表2 酒石酸泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品在血漿中的回收率、日內(nèi)及日間精密度 Table 2 Standard substance recoveries and precisions of tylosin tartrate in plasma

2.4 組織樣品的精密度與試驗(yàn)的回收率

將與3個(gè)酒石酸泰樂(lè)菌素質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的相同進(jìn)樣量的對(duì)照品進(jìn)行分析，計(jì)算組織樣品的相對(duì)、絕對(duì)回收率，結(jié)果見表3。各組織中的絕對(duì)回收率均大于75%，說(shuō)明組織樣品處理方法能使藥物從各組織中很好的分離；組織樣品的精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于10%，證明采用的測(cè)定方法及組織處理方法可靠。

表3 組織勻漿中酒石酸泰樂(lè)菌素的精密度與回收率 Table 3 Recoveries and precisions of tylosin tartrate at different tissues

2.5 血藥的質(zhì)量濃度

對(duì)照組與桔梗試驗(yàn)組的血藥質(zhì)量濃度見表4。從表4 中可看出，與對(duì)照組相比，桔梗試驗(yàn)組藥物吸收入血程度減輕，血藥濃度達(dá)峰時(shí)間提前，且從血漿消除代謝的時(shí)間縮短，在4 h 后便檢測(cè)不到藥物。

表4 對(duì)照組與桔梗試驗(yàn)組的血藥質(zhì)量濃度(n =3) Table 4 Comparison the tylosin tartrate concentration in mice plasma at differentgroups(n =3)

2.6 小鼠的藥代動(dòng)力學(xué)特征

小鼠灌胃酒石酸泰樂(lè)菌素后，不同時(shí)間血藥濃度的藥時(shí)曲線見圖2。從圖2 可知，與對(duì)照組相比，桔梗試驗(yàn)組的達(dá)峰時(shí)間提前，證明桔梗石油醚提取物可使酒石酸泰樂(lè)菌素的吸收加快，能夠更快的發(fā)揮藥效。

圖 2 藥時(shí)曲線 Fig. 2 Curves of tylosin tartrate concentration versus time in mice plasma at different treatments

將給藥后不同時(shí)間收集的血液的血藥濃度經(jīng)PKsolver 藥代動(dòng)力學(xué)軟件處理，用非房室模型估算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，得到的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表5。這與對(duì)照組相比，桔梗石油醚提取物能明顯縮短酒石酸泰樂(lè)菌素的達(dá)峰時(shí)間，且加速了血中泰樂(lè)菌素向組織的分布。

表5 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=3) Table 5 Comparison pharmacokinetic variance of tylosin tartrate at different treaments in plasma of mice(n=3)

2.7 藥物在組織中的分布

小鼠灌胃給藥后，不同組織的藥物濃度－時(shí)間變化趨勢(shì)見圖3。從圖3 中可看出，與對(duì)照組相比，桔梗組小鼠心臟中藥物濃度明顯增大，肺、肝、腎組織中的藥物濃度卻未見增加，且分布時(shí)間及峰值有明顯改變。說(shuō)明桔梗石油醚提取物改變了泰樂(lè)菌素在小鼠體內(nèi)的組織分布，顯著提高了藥物在小鼠心臟中的濃度。

圖3 不同給藥時(shí)間的各組織的藥物濃度 Fig.3 Trends of tylosin tartrate concentration with time at different tissues

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，酒石酸泰樂(lè)菌素的血–藥時(shí)曲線呈現(xiàn)多峰。對(duì)于多峰現(xiàn)象，最常見的解釋便是腸–肝循環(huán)(EHC)和胃腸道吸收的非齊性所導(dǎo)致。另外，藥物在體內(nèi)的代謝過(guò)程和吸收部位的多少，藥物對(duì)胃腸的刺激，細(xì)胞對(duì)藥物的儲(chǔ)存與釋放等因素也與多峰現(xiàn)象有關(guān)[5]。早在20 世紀(jì)90年代，便有文獻(xiàn)[6–7]報(bào)道，藥時(shí)曲線出現(xiàn)多峰現(xiàn)象的藥物已有幾十種，包括安定、速尿、阿司匹林、青霉胺、卡馬西平、苯妥英等等。有文獻(xiàn)[8–9]報(bào)道，雞口服泰樂(lè)菌素，豬口服酒石酸泰樂(lè)菌素均會(huì)出現(xiàn)血–藥曲線多峰的現(xiàn)象。由于泰樂(lè)菌素在體內(nèi)經(jīng)肝腸循環(huán)再吸收，故會(huì)出現(xiàn)內(nèi)服后血藥濃度再次升高的可能[10]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素與胃動(dòng)素受體結(jié)合后依賴鈣離子系統(tǒng)起作用，增強(qiáng)胃腸動(dòng)力[11]，據(jù)此推測(cè)引起泰樂(lè)菌素內(nèi)服吸收后出現(xiàn)多峰現(xiàn)象的原因不僅僅是肝腸循環(huán)，極有可能也與其對(duì)腸道動(dòng)力的影響有關(guān)。

房室模型采用結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)假設(shè)，實(shí)際上常有一個(gè)以上模型和數(shù)據(jù)吻合，在確定哪一個(gè)模型正確方面不可避免帶有隨意性，且模型的選定對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果有很大的影響。在針對(duì)EHC 引起的多峰動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算方面，有學(xué)者采用非房室模型的方法[12]。該方法不受經(jīng)典房室模型的限制，僅假設(shè)藥物末端以單指數(shù)消除，適用于任何房室。綜合考慮，本試驗(yàn)選擇非房室模型分析藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

從藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果可知，與對(duì)照組相比，桔梗石油醚提取物與酒石酸泰樂(lè)菌素混合灌服后，藥物達(dá)峰時(shí)間變短，說(shuō)明桔梗石油醚提取物加快了酒石酸泰樂(lè)菌素的吸收，但吸收程度并未增大，分析原因可能是桔梗石油醚提取物加速了血中泰樂(lè)菌素向組織中的分布速度。表觀分布容積大于對(duì)照組，也證實(shí)了這一結(jié)論。藥物半衰期比對(duì)照組變短，說(shuō)明桔梗石油醚提取物的成分使泰樂(lè)菌素迅速向組織中進(jìn)行分布，血的藥物濃度下降，而組織的藥物濃度升高，實(shí)測(cè)的組織藥物濃度也證實(shí)了這一結(jié)果。由此推測(cè)桔梗的“引經(jīng)”作用實(shí)際上是桔梗促進(jìn)其他藥物加快向組織中分布，使組織中藥物的濃度增高，從而增強(qiáng)其他藥物的藥理作用。但是，本次測(cè)定的心臟藥物濃度明顯比肺、肝、腎中藥物濃度高，而大量文獻(xiàn)[13–17]表明，桔梗具有載藥上行的功效，其中多數(shù)是對(duì)肺臟的引經(jīng)效果的報(bào)道，那么，桔梗的“載藥上行”這個(gè)“上”是否還應(yīng)該包括引藥入心的內(nèi)涵在其中？當(dāng)然中醫(yī)的“心”包含了現(xiàn)代解剖學(xué)里面的心和腦，下一步將探究桔梗石油醚提取物對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)在小鼠腦組織中濃度的影響，以充分驗(yàn)證這一結(jié)論。

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