張 濤， 張 錦， 史艷可， 武镕浩， 方曉波,2， 鄭華寶,2

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院， 杭州311300； 2. 浙江省土壤污染生物修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江農(nóng)林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院， 杭州311300； 3. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境資源與土壤肥料研究所， 杭州310021)

泰樂菌素(Tylosin，TYL)是一種廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)的抗生素[1]。泰樂菌素的藥效主要是對(duì)革蘭氏陽性菌、厭氧細(xì)菌和支原體等產(chǎn)生很強(qiáng)的抑制性作用，同時(shí)對(duì)動(dòng)物生長有良好的促進(jìn)作用[2]。泰樂菌素在動(dòng)物體內(nèi)無法被充分吸收和利用，導(dǎo)致30%～90%的泰樂菌素以母體化合物的形式殘留在排泄物中并通過排泄物等方式轉(zhuǎn)移到環(huán)境中[3]，最終通過灌溉和施肥等方式進(jìn)入土壤環(huán)境和水環(huán)境中[4]。自然環(huán)境中殘留抗生素的長期存在會(huì)導(dǎo)致人和動(dòng)物的發(fā)病率升高[5]，植物和土壤微生物受到嚴(yán)重負(fù)面影響[6]，同時(shí)環(huán)境中殘留的抗生素是抗生素抗性基因產(chǎn)生的主要原因[7]，抗性基因的存在會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致嚴(yán)重的生態(tài)毒性和環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。

通過生物降解和非生物降解能有效應(yīng)對(duì)環(huán)境中抗生素殘留的污染問題[10]。已報(bào)道的研究工作主要是抗生素高效降解菌的篩選和表征，并沒有對(duì)降解菌的降解機(jī)理以及抗生素的酶促降解進(jìn)行深入的研究[11-13]。具有降解作用的酶是一種兼具高效率和選擇性優(yōu)異的綠色生物催化劑[14]；微生物分泌表達(dá)的降解酶能夠有效降解環(huán)境中殘留的抗生素[15]?？股亟到饷赴é?內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)[16]、氨基糖苷類修飾酶(Aminoglycoside modifying enzyme)[17]、大環(huán)內(nèi)酯類鈍化酶(Macrolide inactivating enzyme)[18]和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Chloramphenicol acetyltransferase)[19]。降解酶能夠在微生物難以生存的環(huán)境下存在并且降解作用更加高效[20]，因此，使用降解酶去除泰樂菌素的殘留可能比使用微生物更具有優(yōu)勢(shì)[21]。前人研究泰樂菌素降解菌過程中測(cè)定了生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物并推測(cè)了生物轉(zhuǎn)化的途徑，但是并沒有進(jìn)一步研究降解產(chǎn)物的生態(tài)學(xué)毒性[13,22-24]?？股氐慕到猱a(chǎn)物對(duì)環(huán)境的生態(tài)毒性可能會(huì)高于母體抗生素[25]，因此對(duì)抗生素的生物降解產(chǎn)物毒性的研究十分關(guān)鍵。

本研究從有機(jī)肥廠長期堆放畜禽糞便的土壤中篩選獲得一株泰樂菌素高效降解菌株TYL-T1，鑒定為產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)。通過制備產(chǎn)酸克雷伯氏菌胞內(nèi)粗酶液，表征溫度、pH值、胞內(nèi)粗酶液投加量和金屬離子對(duì)胞內(nèi)粗酶液降解泰樂菌素的影響，研究泰樂菌素酶促降解動(dòng)力學(xué)特性，探究泰樂菌素生物降解產(chǎn)物的生物學(xué)毒性，為去除環(huán)境中殘留的泰樂菌素提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

磷酸泰樂菌素(分析純，95%)；甲醇和乙腈均為色譜純，購自Sigma Scientific(美國)；色譜純甲酸購自阿拉丁公司(中國)；娃哈哈純凈水(500 mL瓶裝)用于HPLC流動(dòng)相配置；其他化學(xué)藥品均為分析純。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，溶于1 L超純水中，滅菌(121 ℃、30 min)后備用。

金屬離子母液配置：分別稱取適量MgSO4、ZnCl2、MnSO4、FeCl2、FeCl3、CuSO4、CoCl2和CaCl2配制濃度為0.02 mol/L的金屬離子母液。

PBS緩沖液配置(0.01 mol/L，pH 7.5)：稱取1.44 g Na2HPO4和0.24 g NaH2PO4溶于1 L去離子水中，滅菌(121 ℃、30 min)后冷藏備用。

胞內(nèi)粗酶液提取所使用的菌株為本課題組前期研究的成果，經(jīng)過鑒定后確認(rèn)屬于產(chǎn)酸克雷伯氏菌屬(Klebsiellaoxytoca)，菌株的保藏及專利申請(qǐng)均以TYL-T1為名稱。TYL-T1菌株現(xiàn)保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)：M2021098，研究成果已經(jīng)提交專利申請(qǐng)(專利申請(qǐng)?zhí)?02110128437.3)。TYL-T1菌株在溫度為35 ℃，pH 7.0的條件下經(jīng)過36 h的反應(yīng)，對(duì)初始質(zhì)量濃度為25 mg/L的泰樂菌素能夠達(dá)到99.34%的降解。

1.2 方法

1.2.1 TYL-T1胞內(nèi)粗酶液提取及蛋白質(zhì)含量測(cè)定

接種TYL-T1菌株到LB培養(yǎng)基中，35 ℃活化培養(yǎng)24 h后，收集菌液低溫離心(4 ℃，8 000 r/min，10 min)后去除上清液，菌體用PBS緩沖液洗滌兩次后加入PBS緩沖液重懸，對(duì)重懸液進(jìn)行總時(shí)長為12 min的冰浴超聲破碎，超聲程序?yàn)槠扑? s，停頓3 s；超聲破碎液低溫離心后收集上清液，即為TYL-T1胞內(nèi)粗酶液；蛋白質(zhì)濃度測(cè)定采用Bradford方法[26]。

1.2.2 TYL-T1對(duì)泰樂菌素降解定位

分別添加5 mL的TYL-T1活菌菌液(Live Bacteria，LB)、TYL-T1胞內(nèi)成分(Intracellular Component，IC)、TYL-T1胞外成分(Extracellular Component，EC)、TYL-T1滅活菌液(Inactivated Bacteria，IB)到100 mL泰樂菌素初始質(zhì)量濃度為25 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，在35 ℃、180 r/min條件下恒溫反應(yīng)24 h后測(cè)定泰樂菌素的殘留質(zhì)量濃度。

TYL-T1活菌：接種TYL-T1菌株到100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，35 ℃、180 r/min條件恒溫培養(yǎng)24 h。TYL-T1胞內(nèi)成分：同1.2.1小節(jié)，取一定體積菌液經(jīng)離心取菌體，加入等量的PBS緩沖液重懸提取胞內(nèi)成分。TYL-T1胞外成分：接種TYL-T1菌株到100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，35 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h后，取菌液離心(8 000 r/min，10 min)，取上清液過0.22 μm針筒式微孔濾膜。TYL-T1滅活菌體：接種TYL-T1菌株到100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，35 ℃、180 r/min條件培養(yǎng)24 h后使用高壓滅菌鍋滅活。

1.2.3 TYL-T1胞內(nèi)粗酶液的比活力測(cè)定

在含25 mg/L泰樂菌素的PBS緩沖液中，加入酶蛋白含量為2.0 mg的TYL-T1胞內(nèi)粗酶液，降解體系終體積為20 mL(本文中PBS緩沖液降解體系最終體積均控制為20 mL)，35 ℃，反應(yīng)2 h后，加入8 mL濃度為4 mol/L的三氯乙酸終止反應(yīng)(本文中胞內(nèi)粗酶液對(duì)泰樂菌素的降解實(shí)驗(yàn)均使用三氯乙酸終止反應(yīng))，取樣測(cè)定溶液中泰樂菌素的殘留質(zhì)量濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)及1個(gè)不添加TYL-T1胞內(nèi)粗酶液的處理作為空白對(duì)照。1 h內(nèi)降解1 μmol泰樂菌素所需的酶量定義為一個(gè)活力單位(U)。胞內(nèi)粗酶液的比活力(U/mg)定義為胞內(nèi)粗酶液的酶活力與酶蛋白濃度的比值。

1.2.4 TYL-T1胞內(nèi)粗酶液降解泰樂菌素過程中活性變化

在pH 7.5，泰樂菌素初始質(zhì)量濃度為25 mg/L的PBS降解體系中，加入酶蛋白含量為2 mg的TYL-T1胞內(nèi)粗酶液，調(diào)節(jié)終體積為20 mL。取樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)定為0、1、2、4、6、8、10和12 h，測(cè)定泰樂菌素殘留質(zhì)量濃度。由于泰樂菌素降解過程較為復(fù)雜，主要反應(yīng)依次為脫6-脫氧-D-阿洛糖、內(nèi)酯環(huán)的開環(huán)和脫碳霉糖等反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果視為脫6-脫氧-D-阿洛糖的酶活力。

1.2.5 不同因素對(duì)泰樂菌素降解影響

(1)重金屬離子對(duì)泰樂菌素酶促降解的影響。在含25 mg/L泰樂菌素的PBS降解體系中，加入1 mmol/L金屬離子(Co2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Ca2+、Cu2+和Mn2+)，加入酶蛋白含量為2.0 mg的TYL-T1胞內(nèi)粗酶液，35 ℃條件下反應(yīng)6 h后，測(cè)定泰樂菌素的殘留質(zhì)量濃度。(2)初始pH值對(duì)泰樂菌素酶促降解的影響。在含有25 mg/L泰樂菌素，pH值為4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5及8.0的PBS降解體系中，加入酶蛋白含量為2.0 mg的TYL-T1胞內(nèi)粗酶液，35 ℃條件下反應(yīng)6 h后，測(cè)定泰樂菌素的殘留質(zhì)量濃度。(3)胞內(nèi)粗酶液投加量對(duì)泰樂菌素酶促降解的影響。在含有25 mg/L泰樂菌素的PBS降解體系中，分別投加酶蛋白含量為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mg的TYL-T1胞內(nèi)粗酶液，35 ℃條件下反應(yīng)6 h后，測(cè)定泰樂菌素的殘留質(zhì)量濃度。(4)反應(yīng)溫度對(duì)泰樂菌素酶促降解的影響。在含有25 mg/L泰樂菌素的PBS降解體系中，加入酶蛋白含量為2.0 mg的TYL-T1胞內(nèi)粗酶液，分別在溫度為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃的條件下反應(yīng)6 h后，測(cè)定泰樂菌素的殘留質(zhì)量濃度。

1.2.6 泰樂菌素酶促降解動(dòng)力學(xué)分析

向泰樂菌素(pH 7.0)初始質(zhì)量濃度分別為25、35、45、55和75 mg/L的PBS緩沖液體系中，分別加入酶蛋白含量為2.5 mg的TYL-T1胞內(nèi)粗酶液，在45 ℃下反應(yīng)6 h，分別在0、1、2、3、4、5和6 h測(cè)定泰樂菌素濃度。采用一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程對(duì)泰樂菌素酶促降解過程進(jìn)行擬合，該反應(yīng)計(jì)算方程式如下：

Ct=C0×e-kt

(1)

式中：Ct為t時(shí)刻的泰樂菌素質(zhì)量濃度，mg/L；C0為泰樂菌素的初始質(zhì)量濃度，mg/L；k為速率常數(shù)，h-1；t為反應(yīng)時(shí)間，h。

根據(jù)該模型公式可以計(jì)算出半衰期，公式如下：

t1/2=-ln2/k

(2)

Michaelis-Menten方程被用于研究泰樂菌素降解酶催化反應(yīng)的模型，如下所示：

V=VmaxC/(Km+C)

(3)

1/V=Km/Vmax×1/C+1/Vmax

(4)

式中：V是反應(yīng)速率，mg/(L·h)；Km是米氏常數(shù)，mg/(L·h)；Vmax是最大反應(yīng)速率，mg/(L·h)；C是底物質(zhì)量濃度，mg/L。

1.2.7 泰樂菌素生物降解產(chǎn)物毒性

以大腸桿菌和枯草芽孢桿菌作為供試菌株，降解產(chǎn)物毒性探究分為4個(gè)處理步驟：(1)陰性對(duì)照NC。泰樂菌素初始質(zhì)量濃度為200 mg/L的PBS緩沖液。(2)處理T1。泰樂菌素生物降解產(chǎn)物，向泰樂菌素初始質(zhì)量濃度為200 mg/L的PBS緩沖液中加入酶蛋白含量為2.5 mg的TYL-T1胞內(nèi)粗酶液，24 h后離心，上清液過0.22 μm濾膜即為泰樂菌素降解產(chǎn)物。(3)處理T2。泰樂菌素自然水解產(chǎn)物，含有200 mg/L泰樂菌素的PBS緩沖液，經(jīng)過24 h的自然降解后即為泰樂菌素自然水解產(chǎn)物。(4)陽性對(duì)照PC。僅PBS緩沖液。

培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在10 mL試管中進(jìn)行，先向試管中加入一定量LB培養(yǎng)液(分別為4.0 mL和2.5 mL)，分別將上述實(shí)驗(yàn)制備的不同處理產(chǎn)物接入試管，接入體積分?jǐn)?shù)分別為20%和50%，每個(gè)試管終體積為5 mL。再分別接入體積分?jǐn)?shù)為10%的大腸桿菌或枯草芽孢桿菌的菌懸液到試管中，培養(yǎng)72 h，每隔24 h取樣測(cè)定菌液的OD600值。

1.2.8 泰樂菌素質(zhì)量濃度的測(cè)定

使用高效液相色譜測(cè)定泰樂菌素的質(zhì)量濃度，儀器為Agilent1260型液相色譜儀(美國Agilent公司)；色譜柱為XTERRA RP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(美國Waters公司)。使用0.1%甲酸水溶液(A相)和純乙腈(B相)作為流動(dòng)相，色譜柱溫保持為35 ℃，波長設(shè)定為278 nm，流速為1 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL。泰樂菌素的降解率計(jì)算公式如下：

降解率=(實(shí)驗(yàn)樣品初始量-實(shí)驗(yàn)樣品殘留量)/實(shí)驗(yàn)樣品初始量×100%。

2 結(jié)果分析

2.1 降解菌不同組分對(duì)泰樂菌素的降解

在相同條件下，平行比較源自TYL-T1菌株的滅活菌體IB、胞外成分EC、胞內(nèi)成分IC和活菌處理LB對(duì)泰樂菌素的降解效果，結(jié)果如圖1所示，在24 h時(shí)，活菌處理LB對(duì)泰樂菌素的降解達(dá)到94.79%，遠(yuǎn)高于其他組。胞內(nèi)成分IC對(duì)泰樂菌素的降解效果明顯高于胞外成分EC對(duì)泰樂菌素的降解，降解率分別為67.60%和28.56%；滅活菌體IB對(duì)泰樂菌素呈現(xiàn)出一定的吸附作用，泰樂菌素的去除率僅為4.29%；因此，推測(cè)TYL-T1菌株胞內(nèi)粗酶液是降解泰樂菌素主要的活性物質(zhì)，添加酶蛋白為2.0 mg的TYL-T1胞內(nèi)粗酶液降解泰樂菌素時(shí)，胞內(nèi)粗酶液的比活力為0.032 U/mg。

IB：TYL-T1滅活菌體；EC：TYL-T1胞外成分；IC：TYL-T1胞內(nèi)成分；LB：TYL-T1活菌。圖1 降解菌不同組分對(duì)泰樂菌素的降解Figure 1 Degradation of tylosin by different components of TYL-T1

2.2 TYL-T1胞內(nèi)粗酶液降解泰樂菌素過程中活力變化

從圖2可知，當(dāng)降解體系中泰樂菌素的初始質(zhì)量濃度為25 mg/L，TYL-T1胞內(nèi)粗酶液投加量為2.0 mg時(shí)，TYL-T1胞內(nèi)粗酶液對(duì)泰樂菌素的降解隨著反應(yīng)的進(jìn)行逐漸增大，降解1 h時(shí)酶活力為最大值0.074 μmol/h，之后隨著反應(yīng)的進(jìn)行胞內(nèi)粗酶液的降解活性逐漸降低。TYL-T1胞內(nèi)粗酶液在12 h內(nèi)有效降解了99%的泰樂菌素，此時(shí)酶的活力為0.041 μmol/h，這表明TYL-T1胞內(nèi)粗酶液在降解泰樂菌素時(shí)，酶活力持續(xù)時(shí)間應(yīng)大于12 h，這一結(jié)果體現(xiàn)了TYL-T1胞內(nèi)粗酶液對(duì)泰樂菌素的降解具有速率快、反應(yīng)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)。

圖2 TYL-T1胞內(nèi)粗酶液對(duì)泰樂菌素的降解及酶活力變化Figure 2 The changes of degradation rate and enzyme activity during the tylosin degradation by TYL-T1 intracellular crude enzyme solution

2.3 不同因素對(duì)泰樂菌素酶促降解影響

2.3.1 金屬離子和pH對(duì)泰樂菌素酶促降解的影響

由圖3(a)可得，當(dāng)添加的重金屬離子為Mg2+、Cu2+、Fe3+時(shí)，對(duì)泰樂菌素的酶促降解并無明顯的影響。當(dāng)添加的重金屬離子為Co2+、Fe2+、Mn2+時(shí)，對(duì)泰樂菌素的降解有明顯促進(jìn)作用，降解率分別提高了12.42%、20.20%和15.20%。當(dāng)添加金屬離子為Zn2+和Ca2+時(shí)，對(duì)泰樂菌素的降解產(chǎn)生嚴(yán)重抑制作用，例如，添加Zn2+后泰樂菌素降解率僅為11.07%，而添加Ca2+后完全抑制了泰樂菌素降解。

由圖3(b)所示，pH值在6.0～8.0范圍內(nèi)，TYL-T1胞內(nèi)粗酶液對(duì)泰樂菌素都有很好的降解作用，其中降解最優(yōu)的pH值為7.0，此時(shí)泰樂菌素的降解率為60.60%，結(jié)果表明在pH值為4.0和5.0的條件下泰樂菌素降解受到嚴(yán)重的抑制，胞內(nèi)粗酶液對(duì)泰樂菌素不產(chǎn)生降解作用，說明pH值過低會(huì)對(duì)TYL-T1胞內(nèi)粗酶液的活性產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制作用。

圖3 金屬離子和pH值對(duì)泰樂菌素酶促降解的影響Figure 3 The effect of metal ion and pH on the enzymatic degradation of tylosin

2.3.2 TYL-T1胞內(nèi)粗酶液投加量和溫度對(duì)泰樂菌素酶促降解的影響

由圖4(a)可知，在酶蛋白投加量為0.5～3.0 mg范圍內(nèi)，泰樂菌素的酶促降解效率與胞內(nèi)粗酶液投加量成正比，當(dāng)酶蛋白投加量為2.5 mg時(shí)，泰樂菌素降解率是70.71%，當(dāng)酶蛋白投加量增加到3.0 mg時(shí)，泰樂菌素降解率為71.56%，沒有觀察到明顯促進(jìn)作用。在實(shí)際應(yīng)用過程中應(yīng)考慮到經(jīng)濟(jì)效益，所以適宜加酶量應(yīng)為2.5 mg。

溫度對(duì)泰樂菌素的酶促降解影響如圖4(b)所示，在溫度為20 ℃～40 ℃條件下，TYL-T1胞內(nèi)粗酶液對(duì)泰樂菌素的降解隨著溫度升高而增加，降解率分別為36.47%、39.59%、42.25%、59.03%和65.82%，而在45 ℃條件下，胞內(nèi)粗酶液對(duì)泰樂菌素達(dá)到最大降解94.33%；當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，TYL-T1胞內(nèi)粗酶液對(duì)泰樂菌素的降解率為91.49%。這證明TYL-T1胞內(nèi)粗酶液降解泰樂菌素的最適溫度為45 ℃。

圖4 胞內(nèi)粗酶液投加量和溫度對(duì)泰樂菌素酶促降解的影響Figure 4 The effect of intracellular crude enzyme solution and temperature on the enzymatic degradation of tylosin

2.4 TYL-T1胞內(nèi)粗酶對(duì)泰樂菌素的降解動(dòng)力學(xué)分析

由圖5(a)所示，不同質(zhì)量濃度泰樂菌素降解動(dòng)力學(xué)方程的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.9(0.945 5～0.990 9)，表明TYL-T1胞內(nèi)粗酶液對(duì)泰樂菌素的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)列于表1。當(dāng)泰樂菌素的質(zhì)量濃度為25 mg/L時(shí)，降解速率常數(shù)為0.714 9 h-1，半衰期為1.0 h，隨著泰樂菌素質(zhì)量濃度的增加，半衰期也隨之增加，表明環(huán)境中殘留泰樂菌素的污染是持久性的。

圖5 泰樂菌素酶促降解動(dòng)力學(xué)特性Figure 5 Kinetics of enzymatic degradation of tylosin

采用Lineweaver-Burk作圖法以1/V對(duì)1/C作圖，結(jié)果如圖5(b)所示，反應(yīng)速率的倒數(shù)(1/V)與泰樂菌素質(zhì)量濃度的倒數(shù)(1/C)的關(guān)系圖顯示出具有良好的回歸直線?；貧w系數(shù)(R2)為0.991 1，表明使用Michaelis-Menten方程很好地描述了TYL-T1胞內(nèi)粗酶液對(duì)泰樂菌素的降解作用。線性方程可以從截距和斜率獲得Km和Vmax的值。通過擬合得到動(dòng)力學(xué)方程1/V=0.044 29+4.847 43×1/C，由該直線方程的斜率及截距計(jì)算得到泰樂菌素的酶促降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax=22.58 mg/(L·h)，Km=109.45 mg/L。

2.5 泰樂菌素降解產(chǎn)物毒性探究

2.5.1 泰樂菌素降解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌生長和影響

泰樂菌素對(duì)大腸桿菌生長有一定抑制作用，當(dāng)培養(yǎng)體系中泰樂菌素質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)(NC)，大腸桿菌最大生長OD600值為2.08。結(jié)果如圖6，泰樂菌素經(jīng)過TYL-T1胞內(nèi)粗酶液(T1)分解后體系中的毒性物質(zhì)含量大大降低，在24～72 h的生長OD600值均高于泰樂菌素自然水解的處理組(T2)，處理T2與NC相比生長不具備明顯優(yōu)勢(shì)，證明自然水解對(duì)泰樂菌素的毒性并沒有明顯降低。不同的處理液添加體積同樣對(duì)結(jié)果影響不大(圖7)，且基本呈現(xiàn)一致的趨勢(shì)。經(jīng)過TYL-T1胞內(nèi)粗酶液降解后，整個(gè)體系內(nèi)混合物的毒性明顯降低，表明TYL-T1胞內(nèi)粗酶液對(duì)泰樂菌素有明顯的解毒作用。

NC：添加200 mg/L泰樂菌素；T1：添加泰樂菌素生物降解產(chǎn)物；T2：添加泰樂菌素自然水解產(chǎn)物；PC：添加PBS緩沖液。圖6 不同處理對(duì)大腸桿菌生長的影響Figure 6 The effect of different treatments on the growth of E. coli

2.5.2 泰樂菌素降解產(chǎn)物對(duì)枯草芽孢桿菌生長影響

以枯草芽孢桿菌作為供試指示菌株時(shí)，結(jié)果如圖7，在無添加泰樂菌素的培養(yǎng)液中(PC)，枯草芽孢桿菌的生長良好；而在含有200 mg/L泰樂菌素的培養(yǎng)體系中(NC)，供試菌株的生長受到明顯抑制。這表明泰樂菌素對(duì)枯草芽孢菌株的毒性較強(qiáng)，抑制了菌株的生長。枯草芽孢桿菌在處理T1中的生長OD600值高于T2處理組，處理T2中細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)量與陰性對(duì)照NC沒有太大的差異。這表明經(jīng)過72 h的水解作用，泰樂菌素及其水解產(chǎn)物的毒性并沒有得到明顯的降低；相比T1處理組中泰樂菌素的毒性得到有效降低，T1處理組生長趨勢(shì)與PC相比并無明顯差異，證明TYL-T1胞內(nèi)粗酶液能加速泰樂菌素及中間代謝產(chǎn)物毒性成分的分解，從而降低其對(duì)環(huán)境微生物的不利影響。同時(shí)在一定情況下，向體系中接種不同比重的處理液，對(duì)實(shí)驗(yàn)最終OD600值并沒有太大影響，表明通過TYL-T1胞內(nèi)粗酶液的處理，泰樂菌素降解產(chǎn)物的毒性明顯降低，高濃度的降解產(chǎn)物并未對(duì)枯草芽孢桿菌的生長產(chǎn)生明顯影響。

NC：添加200 mg/L泰樂菌素；T1：添加泰樂菌素生物降解產(chǎn)物；T2：添加泰樂菌素自然水解產(chǎn)物；PC：添加PBS緩沖液。圖7 不同處理對(duì)枯草芽孢桿菌生長的影響Figure 7 The effect of different treatments on the growth of Bacillus subtilis

3 討論

微生物降解抗生素的方式主要是通過微生物體內(nèi)的降解酶催化改變抗生素的分子結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)[27-29]。酶是復(fù)雜的生物大分子，可作為污染物降解途徑中涉及的許多生化反應(yīng)的催化劑[30]；與使用微生物去除污染物的特性相比較，利用酶進(jìn)行生物修復(fù)可以克服微生物修復(fù)過程中的營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣等條件的限制[31]。因此，酶促降解泰樂菌素的研究是一個(gè)可行的突破點(diǎn)。

本文研究結(jié)果表明TYL-T1胞內(nèi)粗酶液能夠高效催化泰樂菌素的降解，并且發(fā)現(xiàn)金屬離子Co2+、Fe2+和Mn2+能夠促進(jìn)泰樂菌素的降解，降解率分別提高12.42%、20.20%和15.20%。劉淮德等[32]報(bào)道Ca2+和Zn2+能夠促進(jìn)巖藻聚糖硫酸酯降解酶的活性，而本研究發(fā)現(xiàn)金屬離子Ca2+和Zn2+抑制了胞內(nèi)粗酶液活性，推測(cè)Ca2+和Zn2+可能與酶的活性中心結(jié)合，抑制了酶對(duì)泰樂菌素的降解[33]。這與Rao等[34]研究地衣芽孢桿菌降解黃曲霉毒素B1時(shí)發(fā)現(xiàn)Zn2+會(huì)抑制酶活性的結(jié)果一致。在TYL-T1胞內(nèi)粗酶液中添加Ca2+后沒有檢測(cè)到泰樂菌素的降解，說明Ca2+導(dǎo)致酶徹底失活。有研究表明Zn2+和Cd2+等重金屬離子和一些抗生素對(duì)土壤微生物及部分土壤酶活性呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系，同時(shí)對(duì)土壤生物活性產(chǎn)生抑制作用[35]。本研究中，添加的大部分重金屬離子對(duì)TYL-T1胞內(nèi)粗酶液的降解活性并無消極影響，反而具備一定的促進(jìn)作用，表明TYL-T1胞內(nèi)粗酶液對(duì)重金屬與抗生素的復(fù)合污染具有良好的實(shí)際應(yīng)用潛力。

溫度和pH值變化對(duì)TYL-T1胞內(nèi)粗酶液的降解活性有較大影響。張新沙等[36]發(fā)現(xiàn)無丙二酸檸檬酸桿菌胞內(nèi)酶降解泰樂菌素最適pH值為5.5；本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH 6.0～8.0時(shí)，TYL-T1胞內(nèi)粗酶液有較好的降解性能，當(dāng)pH值為7.0時(shí)泰樂菌素降解率達(dá)到最高，當(dāng)pH 4.0～5.0時(shí)，泰樂菌素降解受到嚴(yán)重的抑制。推測(cè)底物和輔酶的解離程度容易受到pH值的影響，導(dǎo)致酶催化底物降解的過程受到負(fù)面影響[37-39]。在最適溫度條件下，酶促降解抗生素的速度達(dá)到最高，溫度低于酶的最適溫度會(huì)削弱酶促反應(yīng)速度，而溫度高于酶的最適溫度也會(huì)導(dǎo)致酶活性降低甚至失活[40]。TYL-T1胞內(nèi)粗酶液具有較好的熱穩(wěn)定性，隨著反應(yīng)溫度升高，泰樂菌素的降解率逐漸升高，當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)達(dá)到最優(yōu)降解效果。當(dāng)胞內(nèi)酶投加量為2.5 mg時(shí)，繼續(xù)提高酶蛋白投加量對(duì)泰樂菌素的降解并無明顯促進(jìn)作用，推測(cè)底物分子與降解酶分子之間的結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài)。模擬后發(fā)現(xiàn)TYL-T1胞內(nèi)粗酶液降解泰樂菌素的過程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)模型，當(dāng)增加泰樂菌素的質(zhì)量濃度，降解的半衰期也隨之增加，表明泰樂菌素對(duì)環(huán)境的污染是持久性的。

抗生素降解過程中產(chǎn)物毒性會(huì)發(fā)生變化[41]，經(jīng)過生物降解后，產(chǎn)物的毒性往往低于母體抗生素，但有的降解產(chǎn)物毒性卻高于母體抗生素[42]。本研究發(fā)現(xiàn)泰樂菌素經(jīng)過TYL-T1胞內(nèi)粗酶液降解后，產(chǎn)物毒性明顯低于泰樂菌素以及泰樂菌素的自然水解產(chǎn)物，說明TYL-T1胞內(nèi)粗酶液在實(shí)際應(yīng)用過程中能夠達(dá)到對(duì)泰樂菌素的無害化處理要求。由于TYL-T1胞內(nèi)粗酶液對(duì)泰樂菌素降解過程包含多個(gè)步驟，后續(xù)需要深入研究泰樂菌素降解的每一步反應(yīng)。