董澤樟， 薛舒心， 曹井國

(天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院， 天津300457)

水體中氮、磷污染的加劇容易引起藻類暴發(fā)，使水源地水質(zhì)惡化。過量的藻類會(huì)影響水廠傳統(tǒng)凈水工藝，導(dǎo)致消毒副產(chǎn)物增加，同時(shí)有害藻類產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物(如藻毒素)會(huì)釋放到水體中，嚴(yán)重影響水質(zhì)安全。針對(duì)原水藻類增多，研發(fā)新型除藻技術(shù)十分必要。

金屬有機(jī)骨架(metal organic framework，MOF)是由有機(jī)配體和無機(jī)金屬離子通過配位鍵自組裝形成的具有分子內(nèi)孔隙的有機(jī)-無機(jī)雜化材料，具有高比表面積、高孔隙率和高密度的活性位等優(yōu)點(diǎn)，在抑菌、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力[1]。殼聚糖是由甲殼素脫乙酰后得到的產(chǎn)物，是一種天然無毒的高分子化合物，分子鏈上存在著大量的氨基和羥基[2]，通過化學(xué)改性[3]或負(fù)載活性物質(zhì)[4]，在除藻領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

本文選用殼聚糖纖維和鋅基MOF為原材料，通過吸附的方法，制備得到CS-MOF纖維，研究其對(duì)銅綠微囊藻生長、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、光合系統(tǒng)、抗氧化系統(tǒng)以及藻毒素的影響，進(jìn)而揭示CS-MOF纖維對(duì)銅綠微囊藻的抑制效果與機(jī)理，以期為凈水廠除藻問題提供新的解決思路。

1 材料與方法

1.1 材料

銅綠微囊藻(FACHB-905)，購于中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫。培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，濕度60%，光照強(qiáng)度2 400 lx，光暗時(shí)間比12 h∶12 h，每天搖動(dòng)3～4次。

殼聚糖纖維購自中盛生物工程有限公司，鋅基MOF材料參照文獻(xiàn)[5]方法制備。取2.5 g MOF加入1 L乙醇溶液，超聲溶解30 min后，投加50 g殼聚糖纖維，室溫下攪拌5 min，隨后靜置12 h，接著繼續(xù)攪拌5 min，取出后自然晾干得到CS-MOF纖維。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理組：分別將0.2、0.4和0.6 g CS-MOF纖維加入到1 000 mL銅綠微囊藻液中，空白組不添加其他物質(zhì)，每組重復(fù)3次。將初始藻液OD680值調(diào)定為1，藻細(xì)胞密度約為8×106mL-1。實(shí)驗(yàn)期間，每72 h測定一次各組藻液的OD680值。

1.3 細(xì)胞結(jié)構(gòu)

參照趙紅艷等[6]的方法，拍攝掃描電鏡圖；參照Heath等[7]的方法，采用硫代巴比妥酸法(TBA)測定丙二醛(MDA)的含量。

1.4 光合系統(tǒng)

參照Wang等[8]的方法，采用95%乙醇提取測定藻細(xì)胞中葉綠素a和類胡蘿卜素含量；參照Padgett等[9]的方法，采用低溫凍融法提取測定藻膽蛋白含量。

1.5 抗氧化酶活性

超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性按照試劑盒說明進(jìn)行測定(購自北京索萊寶科技有限公司)。

1.6 藻毒素測定

參照國標(biāo)GTB 20466—2006[10]和Zheng等[11]方法，采用高效液相色譜測定細(xì)胞內(nèi)外藻毒素含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理方法參見文獻(xiàn)[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)銅綠微囊藻生長的影響

銅綠微囊藻的細(xì)胞密度與680 nm處的吸光度(OD680)呈正相關(guān)[13]，本文測定藻液的OD680作為生物量參數(shù)，反映藻類的生長情況。CS-MOF纖維對(duì)銅綠微囊藻的生長影響如圖1所示。

圖1 CS-MOF纖維對(duì)銅綠微囊藻生長的影響Figure 1 Effect of CS-MOF fiber on the growth of Microcystis aeruginosa

由圖1可知：試驗(yàn)初始各組藻液的OD680值為1.00左右，至第12天時(shí)，空白組的藻液OD680值為1.95；CS-MOF纖維投加量為0.2、0.4和0.6 g/L的處理組中，藻液OD680值分別為0.45、0.39和0.28，抑制率分別為76.9%、80.0%和85.6%。銅綠微囊藻的生長受到明顯的抑制，其抑制效果與CS-MOF纖維的投加量和處理時(shí)間有關(guān)。

2.2 對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

在試驗(yàn)進(jìn)行到第12天時(shí)，拍攝處理組與空白組藻細(xì)胞的掃描電鏡圖，結(jié)果如圖2所示。

(a)0 g/L；(b)0.2 g/L；(c)0.4 g/L；(d)0.6 g/L。圖2 不同投加量CS-MOF纖維處理后的銅綠微囊藻SEM圖像Figure 2 SEM images of Microcystis aeruginosa treated by CS-MOF fiber with different dosages

從圖2(a)可知，試驗(yàn)至第12天時(shí)，空白組的藻細(xì)胞表面光滑呈球狀，且獨(dú)立分布，生長狀況良好。在圖2(b)(投加0.2 g/L的處理組)中，藻細(xì)胞之間出現(xiàn)了互相粘連的情況，細(xì)胞壁出現(xiàn)明顯褶皺和破裂；此外，圖中出現(xiàn)許多條狀物，這是由于細(xì)胞破裂胞內(nèi)的類囊體大量釋放所形成。從圖2(c)和(d)可知：在CS-MOF纖維投加量為0.4 g/L和0.6 g/L的處理組中，已經(jīng)無法觀察到正常生長的藻細(xì)胞，其形態(tài)均發(fā)生顯著變化，伴隨著藻細(xì)胞的裂解，胞內(nèi)的類囊體大量釋放；在0.6 g/L的處理組中，由于損傷作用更強(qiáng)，類囊體出現(xiàn)斷裂，CS-MOF纖維對(duì)銅綠微囊藻造成損傷，導(dǎo)致細(xì)胞破裂死亡。

由圖3可知，隨著CS-MOF纖維投加量的增加與處理時(shí)間的延長，處理組中MDA含量顯著增高，而空白組中的MDA含量保持相對(duì)穩(wěn)定。試驗(yàn)至第12天時(shí)，空白組中MDA含量為0.045 5 nmol/L，3個(gè)處理組中，MDA含量分別為0.109、0.124和0.135 nmol/L，分別是對(duì)照組的2.40、2.73和2.97倍。結(jié)果表明，藻細(xì)胞受到了嚴(yán)重的氧化損傷作用，細(xì)胞膜出現(xiàn)裂解。

圖3 CS-MOF纖維對(duì)銅綠微囊藻丙二醛含量的影響Figure 3 Effect of CS-MOF fiber on MDA content of Microcystis aeruginosa

2.3 對(duì)銅綠微囊藻光合系統(tǒng)的影響

由圖4可知，當(dāng)試驗(yàn)進(jìn)行到第12天時(shí)，投加0.2、0.4和0.6 g CS-MOF纖維的處理組，葉綠素a含量相較對(duì)照組分別下降了80.7%、85.4%和87.6%，類胡蘿卜素分別降低了84.8%、88.0%和88.8%。CS-MOF纖維能夠有效抑制銅綠微囊藻的葉綠素a和類胡蘿卜素，破壞光合作用，導(dǎo)致能量不能被有效地捕獲吸收，阻礙藻細(xì)胞生長。此外，類胡蘿卜素具有重要的光損傷防護(hù)功能，其含量降低會(huì)造成葉綠素上多余的能量轉(zhuǎn)移至氧分子產(chǎn)生單氧原子(O·)[14]，形成更多的活性氧(ROS)，加劇氧化損傷作用。

(a)葉綠素a；(b)類胡蘿卜素。圖4 CS-MOF纖維對(duì)銅綠微囊藻光合作用的影響Figure 4 Effect of CS-MOF fiber on photosynthesis of Microcystis aeruginosa

由圖5可知，與空白組相比，第12天時(shí)，投加0.2、0.4和0.6 g/L CS-MOF纖維的處理組，對(duì)藻藍(lán)蛋白抑制率分別為97.2%、99.7%和99.7%，對(duì)別藻藍(lán)蛋白的抑制率分別為98.6%、98.9%和99.3%，對(duì)藻紅蛋白的抑制率分別為94.4%、96.8%和97.0%。

(a)藻藍(lán)蛋白；(b)別藻藍(lán)蛋白；(c)藻紅蛋白。圖5 CS-MOF纖維對(duì)銅綠微囊藻藻膽蛋白的影響Figure 5 Effect of CS-MOF fiber on phycocyanin of Microcystis aeruginosa

從上述結(jié)果可知，CS-MOF纖維可以顯著抑制并破壞藻細(xì)胞的光合系統(tǒng)，阻礙能量的吸收與傳遞。藻膽蛋白的變化趨勢與葉綠素a、類胡蘿卜素的變化趨勢大致相同，但CS-MOF纖維對(duì)藻膽蛋白的抑制率顯著高于葉綠素a和類胡蘿卜素的抑制率。李建宏等[15]、周長芳等[16]在對(duì)重金屬元素抑藻研究過程中發(fā)現(xiàn)，藻膽蛋白是重金屬元素攻擊的重要靶點(diǎn)之一。此外，Wu等[17]在化感物質(zhì)抑藻過程中也發(fā)現(xiàn)，葉綠素比藻膽蛋白有更高的耐受性。研究表明藻膽蛋白可能是CS-MOF纖維對(duì)銅綠微囊藻抑制作用的一個(gè)敏感作用位點(diǎn)。

2.4 對(duì)銅綠微囊藻抗氧化酶活性的影響

在試驗(yàn)過程中SOD活性呈下降趨勢，至第12天時(shí)空白組中SOD活性為0.007 37 U/104cell，而在投加0.2、0.4和0.6 g/L CS-MOF纖維的處理組中，SOD活性分別為0.002 29、0.001 56和0.001 34 U/104cell，活性分別降低了68.9%、78.8%和81.8%，見圖6(a)。由圖6(b)可知，試驗(yàn)前期CAT活性略有增高，這可能是藻細(xì)胞為了對(duì)抗氧化損傷而作出的應(yīng)激反應(yīng)，但總體來看，CAT活性在正常水平內(nèi)浮動(dòng)，并無明顯的趨勢變化。

(a)SOD；(b)CAT。圖6 CS-MOF纖維對(duì)銅綠微囊藻酶活性的影響Figure 6 Effect of CS-MOF fiber on the content of enzymatic activity in Microcystis aeruginosa

以往的研究發(fā)現(xiàn)，外源物質(zhì)可能會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧，引起氧化應(yīng)激，而藻細(xì)胞自身的抗氧化系統(tǒng)也會(huì)進(jìn)行相關(guān)調(diào)整來應(yīng)對(duì)脅迫。其中SOD起著將超氧自由基轉(zhuǎn)化成H2O2的重要作用，而CAT主要負(fù)責(zé)將H2O2進(jìn)一步轉(zhuǎn)換成O2，通過協(xié)同作用來減輕ROS的損傷作用[18]。研究結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)期間處理組中SOD活性持續(xù)下降，導(dǎo)致將超氧自由基轉(zhuǎn)化成H2O2的能力不足，進(jìn)而未能激發(fā)CAT活性，這也說明了CAT活性為何沒有明顯變化；而SOD活性長時(shí)間低于正常細(xì)胞水平，表明細(xì)胞內(nèi)過量的ROS不能被有效清除，導(dǎo)致藻細(xì)胞受到氧化損傷作用，先前對(duì)MDA含量的測定結(jié)果很好地證明了這一觀點(diǎn)。綜上所述，CS-MOF纖維能夠有效地破壞藻細(xì)胞的抗氧化酶系統(tǒng)，通過抑制SOD活性抑制藻細(xì)胞生長，而對(duì)CAT活性并無明顯影響。

2.5 對(duì)銅綠微囊藻藻毒素的影響

由圖7可知，在添加CS-MOF纖維的處理組中，細(xì)胞內(nèi)藻毒素下降明顯。至第12天時(shí)，CS-MOF纖維投加量為0.4 g/L和0.6 g/L的處理組中，細(xì)胞內(nèi)藻毒素的含量已經(jīng)低于檢測下限，抑制率幾乎達(dá)到100%；而在0.2 g/L的處理組中，抑制率也達(dá)到97%。

圖7 CS-MOF纖維對(duì)銅綠微囊藻中藻毒素的影響Figure 7 Effect of CS-MOF fiber on microcystins in Microcystis aeruginosa

從胞外藻毒素變化趨勢可知：第3天時(shí)，處理組胞外藻毒素含量急劇增高，這是因?yàn)樵寮?xì)胞破裂，導(dǎo)致胞內(nèi)藻毒素釋放。6～12 d時(shí)，處理組胞外藻毒素的含量逐漸趨于穩(wěn)定并出現(xiàn)下降，在0.6 g/L的處理組中，藻毒素下降趨勢明顯。連麗麗等[19]在磁性吸附劑上成功修飾了功能化殼聚糖分子，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吸附劑對(duì)MC-LR具有較好的吸附能力。此外，通過溶劑熱法制備的金屬有機(jī)框架材料MIL-101(Fe)對(duì)微囊藻毒素也表現(xiàn)出良好的吸附性能[20]。

試驗(yàn)期間，處理組的總藻毒素含量呈下降趨勢，至第12天時(shí)，相較空白組，3個(gè)處理組總藻毒素的含量分別降低了81.1%、85.4%和90.8%，細(xì)胞數(shù)量的減少與CS-MOF纖維的吸附作用是主要原因。關(guān)于如何提高CS-MOF纖維對(duì)藻毒素的吸附效果，仍有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

研究表明，CS-MOF纖維能夠有效抑制銅綠微囊藻的生長。當(dāng)CS-MOF纖維投加量為0.6 g/L時(shí)，經(jīng)12 d處理，對(duì)銅綠微囊藻的生長抑制率可達(dá)85.6%。CS-MOF纖維對(duì)藻細(xì)胞造成脅迫損傷，使其結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生明顯改變。CS-MOF纖維對(duì)銅綠微囊藻的光合系統(tǒng)具有顯著的抑制破壞作用，其中藻膽蛋白是抑制作用的敏感作用位點(diǎn)。CS-MOF纖維可以引起藻細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)失衡，抑制銅綠微囊藻的SOD活性，而對(duì)CAT活性并無明顯影響。