李 棟， 項 坤， 常 苗， 鐘佳伶， 何佳萌， 茆燦泉

(1. 西南交通大學生命科學與工程學院， 成都610031； 2. 四川省醫(yī)學科學院/四川省人民醫(yī)院， 成都610072)

病原微生物耐藥性是臨床治療面臨的巨大挑戰(zhàn)，多藥耐藥微生物(Multidrug resistant microbes，MDR)增加感染者的發(fā)病率和死亡率，并對包括ICU病房、接受手術、移植或癌癥治療在內各種人群的臨床療效產生不良影響[1]。全世界每年約有70萬人死于MDR感染，如果不努力應對或開發(fā)新的抗生素，到2050年這一數字將達到1 000萬人[2]。其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)具有很強的毒性和抗生素耐藥性，可傳播和感染動物和人類，造成巨大的經濟負擔[3]，對人類健康造成了嚴重威脅[4]。因此，迫切需要開發(fā)替代藥物或新抗生素來應對微生物感染的挑戰(zhàn)，尤其是由耐藥菌引起的感染。藥用植物是創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要資源寶庫，含有多種活性成分的各種藥用植物及組方具有毒副作用相對較小、不易產生耐藥性等多種優(yōu)勢[5]。研究以MRSA為主要研究對象，結合本實驗室近5年開展的大量植物藥抗菌篩選研究成果的積累，對科學設計的組方MZL-1(黃芩、冰片、大黃等多種植物合理配比)進行抗MRSA的藥效作用及分子機制研究，旨在為抗MRSA等耐藥病原菌以及微生物感染提供一種潛在有效的植物藥組方制品。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器及材料

電導率儀DDSJ-318(上海雷磁)；掃描電子顯微鏡Inspect(美國FEI)；流式細胞儀BD Accuri C6 Plus(美國BD公司)；96T堿性磷酸酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Annexin V-FITC / PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；MZL-1試制品(黃芩、冰片、大黃等植物藥材組方的75%醇提物)。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(ATCC 25923)為西南交通大學生命科學與工程學院微生物實驗室保藏；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus)臨床株(No.230071)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)獲自四川省人民醫(yī)院和四川省醫(yī)學科學院。植物藥材購自成都市荷花池藥材市場，并經生藥學專家鑒定確認。

1.2 方法

1.2.1 MRSA抑菌率測定

取500 μL MZL-1藥液加入10.0 μL MRSA菌懸液，處理至4個作用時間點(2、5、10、20 min)時，分別加入500 μL PBS，充分混勻，各取50.0 μL混合液平板涂布，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h后進行菌落計數。以無菌生理鹽水替代MZL-1作為對照組，實驗重復3次。按照x=(a-b)/a×100%計算抑制率，其中，x為抑菌率，a為對照組菌落數，b為實驗組菌落數。若抑菌率處于50%～90%，則產品有抑菌作用；若抑菌率≥90%，產品有較強的抑菌作用。

1.2.2 多種微生物的MIC測定

采用試管稀釋法測定MZL-1對多種微生物的最小抑菌濃度(Minimal inhibit concentration，MIC)，細菌和真菌分別使用LB和SDA培養(yǎng)基。用液體培養(yǎng)基按2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%和15%的不同梯度稀釋MZL-1至總體積5.0 mL，未加藥組作為對照組。每組接入50.0 μL對數生長期的菌懸液，混勻，在37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)6 h(真菌培養(yǎng)于30 ℃，180 r/min，12 h)。每管取出50.0 μL進行平板涂布，37 ℃培養(yǎng)12 h(真菌30 ℃培養(yǎng)48 h)，菌落計數，實驗重復3次。以出現單菌落數最少的最大含量為組方的MIC。

1.2.3 相對電導率及堿性磷酸酶活性測定

將對數生長期的MRSA菌懸液(1.0×107CFU/mL)以8 000 r/min離心5 min，然后用5%的葡萄糖洗滌菌體沉淀，直到其電能接近5%葡萄糖，作為等滲菌液。將1×MIC和2×MIC含量的MZL-1添加到5%的葡萄糖中，測量電導率記為L1。將1×MIC和2×MIC含量的MZL-1加入等滲菌液中，完全混合后，37 ℃孵育。在0、1、3、5、7、9 h時測量混合液電導率記為L2。在沸水中處理5%葡萄糖細菌混合液的電導率作為對照，記為L0。MZL-1的相對電導率表示為L=100%×(L2-L1)/L0。

對菌液堿性磷酸酶測定，將對數期生長的MRSA菌懸液(1.0×107CFU/mL)用1×MIC和2×MIC含量的MZL-1處理，無菌水作對照。將混合物分別在37 ℃下孵育，在0、1、2、3、5、7 h時取出，8 000 r/min離心5 min，使用堿性磷酸酶試劑盒測定上清液中的堿性磷酸酶含量。每組做3個平行試驗。

1.2.4 SEM掃描電鏡觀察

將對數期生長的MRSA菌懸液在37 ℃、200 r/min條件下用 MZL-1(1/2×MIC, 1×MIC)處理6 h，未加藥的菌液作為對照。離心收集沉淀，用PBS洗滌2次，用40 g/L的蔗糖溶液洗滌一次，時間均為5 min，用系列梯度酒精脫水，30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，每梯度10 min。加入100%酒精重懸后，吸取少量懸液滴加在玻片上，將玻片輕輕粘在導電膠上，臨界點干燥，真空噴鍍。最后，在掃描電子顯微鏡下觀察細菌顯微形態(tài)結構。

1.2.5 凋亡周期的流式細胞術測定

將對數期生長的MRSA細胞用PBS洗滌3次，將菌液的OD600調節(jié)至1.0。菌液稀釋100倍后在37 ℃、200 r/min下用 MZL-1(1/2×MIC, 1×MIC)處理6 h，未加藥的菌液作為對照。按照Annexin V-FITC / PI細胞凋亡檢測試劑盒操作步驟進行染色。通過流式細胞儀對染色細胞進行分析，每個樣本收集10 000個細胞。最后使用FlowJo V10.0.7分析結果。

1.2.6 網絡藥理學分析

(1)有效化學成分篩選。從中藥系統藥理數據庫及分析平臺(TCMSP，https:∥tcmspw.com/tcmsp.php)或文獻中篩選黃芩、冰片、大黃等MZL-1主要藥材的化學成分，篩選藥物相似度(DL)≥0.18的候選化合物。

(2)潛在基因作用靶點的確定。從TCMSP數據庫獲得MZL-1中所有化合物的基因靶點，然后篩選出144種候選化合物所對應的基因靶點，即為MZL-1的潛在基因作用靶點。

(3)與微生物感染相關的差異基因篩選。從GEO數據庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中搜索“Microbial infection”關鍵詞，重點關注“Genome-wide”“bacterial”“fungal”和“infection”，尋找微生物感染患者的差異基因樣本。篩選樣本中P<0.05且|log2(fold change)| >0.5的基因被認為是和微生物感染顯著差異表達相關基因。

(4)PPI網絡構建與分析。將MZL-1的潛在基因作用靶點與微生物感染相關差異基因取交集得到的23個基因于STRING(https:∥www.string-db.org/, Version: 11.0)網站上進行蛋白互作分析，物種設為智人，蛋白質之間相互作用基于已有數據，互作得分設為最高置信度0.400，下載TSV文件導入Cytoscape軟件構建蛋白質相互作用網絡(Protein-Protein Interaction network,PPI)并進行拓撲結構分析。

(5)生物信息學分析。用Bioconductor中“DOSE”“clusterProfiler”和“enrichplot”3個安裝包，并使用R語言編程，進行Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析，選擇前20個富集的通路以氣泡圖來呈現。使用Cytoscape構建KEGG通路與基因調控網絡。

2 結果與分析

2.1 MZL-1對MRSA及多種微生物的廣譜抑菌作用

MRSA抑菌性能結果顯示，MZL-1處理組2、5、10、20 min均未有菌落產生，而對照組則有生長正常的菌落，且在2 min時即完全抑制，5～20 min均表現出100%的抑菌效果[圖1(a)]。MZL-1對金黃色葡萄球菌標準株的MIC為10.0%，對MRSA的MIC為7.5%，揭示MZL-1的抑菌作用不受細菌耐藥性的影響，甚至對耐藥株還有更強的抑制作用。另外，對白色念珠菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌和藤黃微球菌的MIC顯示，組方MZL-1同樣表現出強的抑制作用[圖1(b)]。

(a)MZL-1對MRSA的抑菌性能；(b)不同菌株MIC值。圖1 MZL-1對MRSA的抑菌性能和多種微生物的MIC測定Figure 1 The antimicrobial activities of MZL-1 against MRSA and the determination of MIC for various microorganisms

2.2 MZL-1處理對MRSA細胞完整性的影響

相較對照組，MZL-1處理組的相對電導率顯著升高，并且呈現含量依賴性[圖2(a)]。與相對電導率結果相似，加藥組的堿性磷酸酶活性顯著高于對照組，同樣表現出加藥初始就高表達的特點[圖2(b)]。隨著時間變化，堿性磷酸酶的活性也呈小幅變化，同時也表現出含量依賴性。

掃描電鏡觀察不同濃度MZL-1處理后的MRSA菌體，與空白組相比，加藥組MRSA細胞數明顯減少，細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，部分細胞凹陷破裂，細胞大小不一，細胞表面不再光滑且彼此黏附，細胞間出現很多可能是細胞碎片的雜質，隨著含量增高，黏附現象加劇[圖2(c)]。

(a)相對電導率；(b)堿性磷酸酶活性；(c)掃描電鏡觀察細胞形態(tài)。圖2 MZL-1對MRSA細胞完整性的影響Figure 2 The effects of MZL-1 on the integrity of MRSA cells

2.3 MZL-1對MRSA的促凋亡作用

細胞凋亡是一種生理性的程序性細胞死亡，受到基因的嚴格控制。圖3所示，隨著MZL-1處理含量的增加，MRSA活細胞率(Q4)從98%降到4.35%。相反，經MZL-1處理6 h后，凋亡的細胞比率(Q3+Q2)從1.94%增加到95.6%，特別注意的是，早期凋亡的細胞數呈現一個很大的占比，這也印證了相對電導率和堿性磷酸酶的結果，即在體外試驗中MZL-1對MRSA的抑制作用是高效的。

Q4為活細胞；Q3為早期凋亡細胞；Q2為晚期凋亡細胞；Q1為壞死細胞。圖3 不同含量MZL-1處理對MRSA細胞凋亡的影響Figure 3 The effects of different contents of MZL-1 on MRSA apoptosis

2.4 網絡藥理學分析

2.4.1 MZL-1中活性成分的篩選與抗微生物感染差異基因表達分析

從TCMSP數據庫和文獻中共獲得146種符合條件的化合物。其中，黃芩72種，大黃63種，冰片5種，其他6種，去除冗余，共計144種。144種化合物對應916個潛在基因作用靶點，黃芩649個，大黃187個，冰片6個，其他74個。從GEO數據庫找到GSE65088這一系列的微生物感染差異基因表達樣本，分析正常樣本和感染后樣本共得到1 100個差異基因，選取前20個顯著上調和前20個顯著下調的基因繪制熱圖(圖4)。其中C為正常樣本，計21例；T為不同微生物感染樣本，計36例，依次為6例煙曲霉菌、10例白色念珠菌、10例大腸桿菌、10例金黃色葡萄球菌。正常樣本和感染樣本的差異主要涉及HERC5、ISG15、CXCL10、CCL8、TNF、LOC730249、IRG1、IL6、RSAD2和IFI44L等基因。

(a)21個正常樣本；(b)煙曲霉菌；(c)白色念珠菌；(d)大腸桿菌；(e)金黃色葡萄球菌。紅色表示上調，綠色表示下調；顏色越鮮明表示差異越顯著。圖4 微生物感染差異基因熱圖Figure 4 Heat map of differential genes in various microbial infections

將916個潛在基因作用靶點與微生物感染的差異基因取交集得到29個化合物和23個靶基因。根據相關性排序，芹菜素(MOL000008)、黃芩素(MOL002714)、漢黃芩素(MOL000173)、大黃素(MOL000472)這些化合物能結合的靶點都在5個及以上，推測上述化合物可能是MZL-1抗微生物感染的關鍵成分。RXRA、RELA、CDKN1A這3個基因所涉及的化合物超過5個，推測上述基因可能是MZL-1抗微生物感染的關鍵靶點(圖5)。

中間矩形代表靶基因；周圍橢圓代表化合物。紅色矩形代表核心靶基因；綠色橢圓代表核心化合物。圖5 化合物與靶基因關系網絡Figure 5 Compound and target gene relationship network

2.4.2 PPI網絡分析

將PPI數據導入Cytoscape軟件分析，共得到22個節(jié)點，119條邊。以節(jié)點大小對應Degree值大小，邊的粗細反映節(jié)點之間相互作用強度“Combinedscore”(圖6)。其中IL6、FOS、JUN、MMP9、VEGFA、STAT3和RELA等靶點排名靠前，推測可能為MZL-1的重要作用靶點。

圖6 MZL-1與候選靶點的PPI網絡Figure 6 PPI network of MZL-1 and candidate targets

2.4.3 GO和KEGG富集分析

對23個靶基因進行包括生物過程(BP，biological process)、細胞成分(CC，cellular component)和分子功能(MF，molecular function)的GO分析。結果顯示，共有873個GO功能被顯著富集。其中生物過程中833個，分子功能中34個，細胞成分中6個。生物學過程主要與脂多糖反應、細菌起源分子的反應、DNA結合轉錄因子活性的調節(jié)等相關[圖7(a)]；分子功能主要集中在與細胞因子受體、細胞因子活性以及受體配體活性等有關方面[圖7(b)]；細胞組分主要涉及轉錄因子復合體、RNA聚合酶II轉錄因子復合物以及核轉錄因子復合體等[圖7(c)]。

KEGG富集分析共有94條通路，前20條分別為卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染、Th17細胞分化、TNF信號通路、IL-17信號通路、美國錐蟲病、類風濕關節(jié)炎、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、乙型肝炎、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、麻疹、癌癥中PD-L1表達和PD-1檢查點途徑、人巨細胞病毒感染、甲型流感、HIF-1信號通路、炎性腸病(IBD)、耶爾森氏菌感染、松弛素信號通路、破骨細胞分化、利什曼病、人T細胞白血病病毒1感染[圖7(d)]?？梢姾芏嗤放c微生物感染、炎癥有關。

(a)GO生物過程；(b)GO分子功能；(c)GO細胞組分；(d)KEGG富集分析。圖7 GO和KEGG富集分析Figure 7 GO and KEGG enrichment analysis

2.4.4 KEGG網絡分析

根據顯著富集通路和調控這些通路的基因之間的相關性，構建基因通路網絡(圖8)。方格代表目標基因，V形圖代表網絡中的通路，圖形面積越大代表相關性越強。從圖 8可以看出，RELA是核心靶基因，FOS、JUN、NFKBIA、IL6、IL1B等基因也很重要，它們可能是MZL-1抗微生物感染的關鍵靶基因。

圖8 KEGG基因通路網絡Figure 8 KEGG gene pathway network

3 討論與結論

為尋找抗微生物耐藥的新方法，以MRSA為研究對象，在課題組前期植物藥抗菌篩選研究的基礎上，選取黃芩、冰片、大黃等多種植物藥合理配比并組方為MZL-1。黃芩含有豐富的黃酮成分，具有廣譜抑菌、抗炎能力[6]，有研究表明，黃芩中的黃芩苷可以抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，協同藥物更容易殺傷細菌[7]；冰片用于治療傷口愈合、治療燒傷、喉嚨痛和皮膚感染[8]，還可通過抑制氧化損傷、細胞凋亡和炎癥反應對全腦缺血再灌注損傷模型具有顯著保護作用[9]；大黃素是中藥大黃的重要單體，能抑菌、抗炎、調節(jié)免疫、抗氧化、保護肝腎、利尿、治療胰腺炎、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、降低血液黏度、抗腫瘤等，具有較好的臨床應用價值[10-11]。抑菌性能評估結果表明：MZL-1對MRSA具有強的抑制作用，抑制效果甚至強于金黃色葡萄球菌標準株，這個結果非常有意義，揭示MZL-1組方具有不受抗生素耐藥性影響的優(yōu)勢。深入研究發(fā)現，MZL-1對白念珠菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、藤黃微球菌等多種微生物均有強抑制作用，這為MZL-1抗MRSA及廣譜抗菌產品的研發(fā)帶來了很大希望。

細菌細胞膜是離子和物質轉運的重要滲透屏障[12]，它被破壞會導致胞內電解質泄漏[13]。堿性磷酸酶存在于細胞壁和細胞膜內，當細胞壁被破壞時，堿性磷酸酶將從細胞中泄漏出來[14]，菌液中電解質含量和堿性磷酸酶活性可以很好地表征細胞膜和細胞壁的完整程度。菌液相對電導率、堿性磷酸酶活性的結果證明MZL-1對MRSA菌體細胞膜與細胞壁的破壞和胞內內容物溢出，掃描電鏡的結果又從形態(tài)學上證實了大量菌體的死亡和破裂，并且均表現出含量依賴性。流式細胞儀發(fā)現，經MZL-1處理后活細胞大量減少，凋亡細胞增加，且大多出現在早期凋亡階段，這也進一步印證電導率、堿性磷酸酶以及掃描電鏡的結果，即MZL-1對MRSA抑制作用快速且有效。

最后，結合網絡藥理學技術方法，對MZL-1的可能分子抗菌機制進行研究。芹菜素、漢黃芩素、黃芩素和大黃素能結合的微生物感染相關靶點較多，且它們均具有抗菌、抗炎和抗氧化的作用[15-16],可能是MZL-1的代表性化合物。將候選靶點進行PPI網絡構建與分析，發(fā)現IL6、FOS、JUN、MMP9、VEGFA、STAT3、RELA等靶點排名靠前。芹菜素、黃芩素均可以抑制IL6的轉錄[17-18]，漢黃芩素在骨關節(jié)炎治療中可以抑制IL6、MMP9等多種基因的表達[19]，MZL-1含有的多種黃酮類、蒽醌/蒽酮類、有機酸、萜類化合物很可能作用于上述靶點。GO富集分析顯示靶基因主要參與細胞對小分子反應，細胞因子及轉錄因子等過程。KEGG富集分析發(fā)現所涉及的通路大多與炎癥因子響應、細胞凋亡、細菌和病毒感染及免疫功能有關。KEGG網絡分析最終確定RELA、FOS、JUN、NFKBIA、IL6、IL1B等關鍵基因。RELA基因屬于NF-κB家族，NF-κB是一種轉錄因子，是一系列信號轉導事件的終點，由許多生物過程(如炎癥、免疫、分化、細胞生長、腫瘤發(fā)生和凋亡)相關的大量刺激啟動[20-21]。FOS基因家族編碼蛋白可與JUN家族編碼蛋白形成二聚體AP-1，AP-1作為一種轉錄因子參與細胞凋亡、炎癥響應等生物過程[22-23]。NFKBIA基因編碼NF-Kappa-B抑制劑家族的一個成員，其所編碼蛋白可以與REL產生二聚體從而調控炎癥反應[24]。IL6和IL1B編碼的細胞因子都是重要的炎癥反應調節(jié)因子，并廣泛參與到細胞增殖、分化和凋亡等各種細胞活動中[25-26]。MZL-1具有多成分多靶點的優(yōu)勢，可以調節(jié)和響應多個靶點和通路，這也可能是MZL-1對包括MRSA在內的多種微生物有較強抑制效果的原因。

MZL-1不受MRSA耐藥性影響，可以破壞其細胞完整性而起到抑制作用，同時MZL-1對多種微生物均有很強的抑制效果，研究為目前微生物耐藥性的解決提供了一條新的思路。本工作還存在很多不足，植物藥材的質量控制以及抑菌和抗耐藥機制還需要從基因、蛋白方面的實驗進行深入研究。