朱暄 張世彬 陳慶國(guó) 朱敏 鄭俊俊 朱元昭 黃經(jīng)緯 洪道俊

MELAS患者肌細(xì)胞線粒體自噬異常的研究

朱暄 張世彬 陳慶國(guó) 朱敏 鄭俊俊 朱元昭 黃經(jīng)緯 洪道俊

目的 探討線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作綜合征(mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke like-episodes，MELAS)患者肌細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬異常的改變。方法 納入2013-01-2014-06在作者醫(yī)院就診的7例MELAS患者，所有患者均行骨骼肌活檢和線粒體DNA擴(kuò)增后限制性內(nèi)切酶基因檢測(cè)。對(duì)患者的肌肉標(biāo)本進(jìn)行LC3、Beclin1、Bcl-2、Bax蛋白的免疫組化和免疫印跡檢測(cè)。結(jié)果 患者肱二頭肌活檢顯示肌肉中出現(xiàn)數(shù)量不等的破碎肌纖維，表現(xiàn)為破碎紅肌纖維和破碎藍(lán)纖維，以及肌間小血管管壁深染。免疫組化染色顯示LC3、Bcl-2、Bax蛋白在破碎肌纖維中呈陽(yáng)性表達(dá)，而Beclin1呈陰性表達(dá)。肌肉活檢組織免疫印跡檢測(cè)顯示LC3-Ⅰ表達(dá)升高，而LC3-Ⅱ表達(dá)下降；Beclin1表達(dá)無(wú)改變；Bcl-2和Bax表達(dá)升高；LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Bcl-2/Bax比值下降。結(jié)論 MELAS病變肌纖維的線粒體存在自噬障礙，造成大量功能和形態(tài)異常的線粒體不能被及時(shí)清除而堆積在細(xì)胞中，進(jìn)而可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

MELAS；線粒體自噬；LC3；凋亡

線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作綜合征(mitochondrial encephalomyopathy，lactic acidosis and stroke like-episodes，MELAS)是最常見的線粒體腦肌病綜合征之一，該病主要臨床特點(diǎn)為高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作[1-2]。目前MELAS的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，主要的病因假說(shuō)為線粒體基因突變后導(dǎo)致線粒體功能障礙，引起細(xì)胞能量代謝障礙，影響到骨骼肌、血管平滑肌、神經(jīng)細(xì)胞等主要靶細(xì)胞功能[3-4]。

自噬是一種選擇性的程序化降解各種細(xì)胞底物的生命過(guò)程[5]。線粒體自噬主要是指在外界因素的刺激下，損傷的線粒體被包裹進(jìn)自噬體并被溶酶體融合，從而降解損傷的線粒體，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[6]。目前大量研究表明線粒體自噬與神經(jīng)系統(tǒng)變性病相關(guān)，特別是和帕金森病的發(fā)病密切相關(guān)[7]。然而，目前關(guān)于MELAS患者骨骼肌細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬的研究相對(duì)缺乏。本研究觀察了7例MELAS患者肌細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)因子的表達(dá)情況。

表 1 MELAS患者主要臨床特點(diǎn)

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2013-01-2014-06在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)科確診為MELAS患者7例，其中男4例，女3例，平均發(fā)病年齡(25.9±11.7)歲。其主要臨床特點(diǎn)見表1。3例患者肌酸磷酸激酶升高，最高達(dá)5233U/L(正常參考值5～171 U/L)。7例患者頭顱MRI均出現(xiàn)腦皮質(zhì)區(qū)異常信號(hào)影，主要累及大腦半球的顳、頂、枕葉，受累病灶不符合血管支配特點(diǎn)。3例患者行磁共振波譜分析，2例患者發(fā)現(xiàn)乳酸雙峰。經(jīng)限制性內(nèi)切酶法檢測(cè)患者肌肉線粒體DNA，均發(fā)現(xiàn)致病突變。

1.2 方法

1.2.1 肌肉病理染色：經(jīng)患者知情同意及南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，對(duì)7例患者進(jìn)行肌肉活體組織檢查，均取自左側(cè)肱二頭肌。肌肉標(biāo)本經(jīng)異戊烷預(yù)冷后，液氮中冷凍固定，對(duì)冷凍切片常規(guī)進(jìn)行組織學(xué)和酶組織化學(xué)染色：蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)、改良Gommri染色(modified gomori trichrome, MGT)、油紅O染色、PAS染色(periodic acid-schiff，PAS)、還原型輔酶I四唑藍(lán)還原酶染色、琥珀酸脫氫酶染色(succinate dehydrogenase，SDH)、細(xì)胞色素C染色、非特異脂酶染色。免疫組織化學(xué)染色采用En-Vision二步法，第一抗體分別為兔LC3單克隆抗體(1∶100，Cell Signaling公司，#12741)、兔Beclin1多克隆抗體(1∶200，Abcam公司，ab55878)、鼠Bcl-2單克隆抗體(北京中杉試劑)、鼠Bax單克隆抗體(北京中杉試劑)。同時(shí)選取同期2例擬診神經(jīng)肌肉病而肌肉活檢正常的患者作為正常對(duì)照。

1.2.2 Western blot檢測(cè)：MELAS患者肌肉活檢組織，勻漿后制取蛋白免疫印跡檢測(cè)標(biāo)本。測(cè)采用Bio-Rad電泳系統(tǒng)，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12%。每個(gè)泳道總蛋白上樣量為50 g，電壓為40 V，30 min；60 V，1～2 h。電泳完畢，將凝膠用200 mA轉(zhuǎn)移2 h至PVDF膜上，一抗分別為L(zhǎng)C3 (1∶1000)、Beclin1 (1∶1000)、Bcl-2 (1∶100)、Bax (1∶100)，4℃孵育過(guò)夜。ECL試劑盒熒光顯影。上述檢測(cè)重復(fù)進(jìn)行3次。由于肌肉標(biāo)本數(shù)量限制，本組3例A3243G突變(患者2、6、7)和1例G13513A突變(患者4)的肌肉標(biāo)本用于蛋白檢測(cè)，1例正常肌肉標(biāo)本作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 病理結(jié)果 7例患者肌肉活檢HE染色顯示肌肉組織出現(xiàn)不等數(shù)量的破碎樣肌纖維，其內(nèi)出現(xiàn)嗜堿性顆粒沉積；MGT染色顯示破碎樣肌纖維表現(xiàn)為典型的或不典型的破碎紅肌纖維(ragged red fiber，RRF)；SDH染色顯示破碎樣肌纖維顯著深染，呈破碎藍(lán)纖維(ragged blue fiber，RBF)；4例患者出現(xiàn)肌間小血管管壁深染(stained succinate dehydrogenase vessels，SSV)；細(xì)胞色素C染色顯示存在RBF的患者出現(xiàn)肌纖維膜下深染及陰性肌纖維。具體結(jié)果見圖1。

免疫組化染色結(jié)果顯示，LC3蛋白、Bcl-2蛋白和Bax在A3243G突變患者和G13513A突變患者的RRF或個(gè)別萎縮肌纖維中呈陽(yáng)性表達(dá)，而正常對(duì)照肌纖維內(nèi)未見陽(yáng)性表達(dá)。Beclin1蛋白在MELAS患者的肌纖維和正常對(duì)照肌纖維中均未見明顯陽(yáng)性表達(dá)。具體結(jié)果見圖2。

2.2 蛋白表達(dá)改變 3例A3243G患者和1例G13513A突變患者肌纖維內(nèi)LC3-Ⅰ表達(dá)水平較對(duì)照升高，而LC3-Ⅱ表達(dá)水平與對(duì)照組比較未明顯升高，半定量分析顯示LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值并未升高逆轉(zhuǎn)。MELAS患者Beclin1蛋白水平與對(duì)照比較無(wú)明顯改變。Bcl-2蛋白和Bax蛋白在A3243G突變和G13513A突變患者肌纖維內(nèi)均較對(duì)照升高，半定量分析顯示MELAS患者肌細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax<1。結(jié)果見圖3。

圖1 MELAS患者(例2)肱二頭肌活檢結(jié)果顯示肌肉組織中出現(xiàn)破碎樣肌纖維，其內(nèi)出現(xiàn)嗜堿性顆粒沉積(HE染色，A)；破碎樣肌纖維表現(xiàn)為典型的破碎紅肌纖維(改良Gomri染色，B)；破碎樣肌纖維顯著深染(琥珀酸脫氫酶染色，C)；例6患者肱二頭肌活檢顯示肌間小血管管壁深染(琥珀酸脫氫酶染色，D)

圖2 MELAS患者肱二頭肌活檢免疫組化染色顯示LC3蛋白、Bcl-2蛋白及Bax在A3243G和G13513A突變者的破碎肌纖維中呈陽(yáng)性表達(dá)，而正常對(duì)照未見明顯陽(yáng)性表達(dá)；Beclin1蛋白在A3243G、G13513A患者和正常對(duì)照中均未見明顯陽(yáng)性表達(dá)

3 討論

MELAS綜合征患者臨床表型具有很大的異質(zhì)性，主要以腦卒中樣發(fā)作、癲癇、肌無(wú)力、智力障礙、頭痛等常見，還可出現(xiàn)精神異常、發(fā)育遲緩、耳聾、視力下降、糖尿病等[8-9]。本組7例患者均為先證者，盡管患者之間臨床表現(xiàn)存在一定差異，但均表現(xiàn)為突出的神經(jīng)系統(tǒng)受累癥狀。然而在本組部分家系患者僅表現(xiàn)為糖尿病、聽力下降、身材矮小、心臟病變、肌無(wú)力等孤立癥狀，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似[2]。因而在詢問(wèn)MELAS患者的家族史時(shí)，需要對(duì)任何一種異常體征和癥狀具有警惕性。

1：對(duì)照組；2～4：A3243G突變患者；5：G13513A突變患者

圖3 MELAS患者免疫印跡檢測(cè)肌肉蛋白表達(dá)水平

影像學(xué)檢查可為MELAS診斷提供重要線索。文獻(xiàn)報(bào)道，急性期患者行頭顱MRI檢查時(shí)，顳、頂、枕葉多可見廣泛高信號(hào)，易與腦梗死混淆[10]。本組7例患者頭MRI檢查結(jié)果亦主要表現(xiàn)為顳、頂、枕葉異常信號(hào)，且有2例患者出現(xiàn)小腦病變，該7例患者顱內(nèi)病灶均以皮層和皮層下白質(zhì)受累為主，不符合血管分布。部分MELAS患者行磁共振波譜分析可見病灶區(qū)乳酸水平增高而出現(xiàn)典型的乳酸峰，乳酸峰以在1.33 ppm附近出現(xiàn)雙乳酸峰，回波時(shí)間設(shè)定為144 ms時(shí)雙乳酸峰倒置為其特征[11]。該組3例患者行磁共振波譜分析，其中2例患者發(fā)現(xiàn)乳酸雙峰，故波譜分析是診斷MELAS的重要手段。

目前已報(bào)道有30多個(gè)mtDNA突變可導(dǎo)致MELAS，其中A3243G點(diǎn)突變約占80%[12]。本組7例患者中檢測(cè)到A3243G點(diǎn)突變6例。G13513A突變所致的MELAS近年逐漸受到重視，是國(guó)內(nèi)第二常見的MELAS突變位點(diǎn)[13]。G13513A突變主要可引起MELAS、Leigh及MELAS-Leigh疊加綜合征，據(jù)報(bào)道這些臨床表型與年齡有一定關(guān)系[14]。mtDNAG13513A突變引起的MELAS綜合征多見于成年人，其所致的Leigh綜合征多見于嬰幼兒，而MELAS-Leigh疊加綜合征非常罕見。本組病例發(fā)現(xiàn)1例G13513A突變，該例患者36歲起病，主要表現(xiàn)為MELAS綜合征癥狀，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符。

線粒體自噬是細(xì)胞控制線粒體數(shù)量以及清除受損線粒體的唯一途徑，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的線粒體功能發(fā)生障礙時(shí)，細(xì)胞將啟動(dòng)線粒體自噬過(guò)程，選擇性清除功能受損的線粒體[6]。MELAS的肌肉病理研究表明RRF、RBF、SSV中存在大量代償性增生并聚集的異常線粒體[2]，提示在MELAS的肌細(xì)胞中存在自噬不足。本研究發(fā)現(xiàn)，這些線粒體異常聚集的肌細(xì)胞內(nèi)存在LC3陽(yáng)性表達(dá)，但自噬調(diào)控蛋白Beclin1表達(dá)陰性，免疫印跡進(jìn)一步證實(shí)了Beclin1蛋白表達(dá)未升高，LC3表達(dá)升高以LC3-Ⅰ為主，而自噬活性蛋白LC3-Ⅱ并未升高，因而從分子水平上證實(shí)肌細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬水平低下。LC3是細(xì)胞自噬通路過(guò)程的膜識(shí)別分子，LC3-Ⅱ特異性地結(jié)合到新合成的自噬體上，因此LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值代表細(xì)胞自噬水平[15]。Beclin1通過(guò)與磷脂酰肌醇3-激酶形成復(fù)合體誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白定位于自噬體膜，進(jìn)而調(diào)節(jié)自噬活性，其表達(dá)強(qiáng)度與自噬的活性密切相關(guān)[16]，通過(guò)檢測(cè)Beclin1表達(dá)，可對(duì)自噬的活性進(jìn)行監(jiān)測(cè)和判斷。根據(jù)本研究結(jié)果推測(cè)MELAS病變肌纖維內(nèi)線粒體的自噬過(guò)程可能被啟動(dòng)(LC3-Ⅰ顯著升高)，但在隨后的自噬調(diào)控過(guò)程中出現(xiàn)異常，導(dǎo)致線粒體自噬障礙(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ下降和Beclin1陰性)。

Bcl-2是一種細(xì)胞抑制凋亡蛋白，而Bax是一種促凋亡蛋白，這兩種蛋白主要分布在線粒體[17]。本研究結(jié)果顯示MELAS破碎肌纖維中出現(xiàn)Bcl-2和Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)，免疫印跡進(jìn)一步證實(shí)此兩種蛋白表達(dá)上調(diào)，且Bcl-2/Bax比值小于1，提示這些線粒體自噬障礙的破碎肌纖維通過(guò)凋亡途徑死亡。這與既往文獻(xiàn)報(bào)道MELAS患者的骨骼肌內(nèi)存在細(xì)胞凋亡過(guò)程的異常過(guò)度激活相一致[18]。此外Bcl-2能夠通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性來(lái)調(diào)節(jié)線粒體自噬，其與Beclin1有相似的結(jié)構(gòu)域，Bcl-2通過(guò)該域與Beclin1作用從而抑制自噬[19]，提示MELAS病變肌纖維內(nèi)線粒體自噬異常和細(xì)胞凋亡之間存在相互作用。

目前L-精氨酸已經(jīng)在MELAS患者的急性期治療中發(fā)揮重要作用[20]，此外多種氧化呼吸鏈調(diào)節(jié)物組成的“雞尾酒療法”也在臨床得到推廣，但MELAS患者的總體預(yù)后尚不理想[21]。MELAS病變肌纖維的線粒體存在自噬障礙，造成大量功能和形態(tài)異常的線粒體不能及時(shí)清除而堆積在細(xì)胞中，進(jìn)一步加重了細(xì)胞的功能障礙，造成細(xì)胞凋亡。如果能在線粒體自噬異常以及針對(duì)調(diào)節(jié)線粒體自噬藥物方面的研究取得進(jìn)展，或許對(duì)MELAS的治療帶來(lái)新的希望。

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(本文編輯：時(shí)秋寬)

The dysfunction of mitophagy in the myofibers of patients with MELAS

ZHUXuan,ZHANGShibin,CHENQingguo,ZHUMin,ZHENGJunjun,ZHUYuanzhao,HUANGJingwei,HONGDaojun*.

*DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China

HONG Daojun，Email：hongdaojun@hotmail.com

Objective To explore the dysfunction of mitochondrial autophagy in patients with mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke like-episodes (MELAS). Methods Seven patients with MELAS were collected in our clinical center from January 2013 to June 2014. All the patients underwent muscle biopsy. The mitochondrial DNA (A3243G and G13513A) was amplified by polymerase chain reaction (PCR). Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3), Beclin1, B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), and Bcl-2-associated X (Bax) proteins in muscle specimens were detected by immunohistochemistry and Western blot. Results Muscle biopsy showed that ragged red fibers, ragged blue fibers, and stained succinate dehydrogenase (SDH) vessels presented in affected myofibers. Immunohistochemical staining showed that the ragged fibers had strong immunopositivity to LC3, Bcl-2 and Bax, but negative to Beclin1. Western blot revealed increased level of LC3-Ⅰ; decreased level of LC3-Ⅱ; unchanged level of Beclin1; increased level of Bcl-2 and Bax; and decreased ratios of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and Bcl-2/Bax in the detected muscles. Conclusions Dysfunction of mitochondrial autophagy can be observed in myofibers of MELAS, which makes the affected myofibers transfer to apoptosis pathway.

MELAS; mitochondrial autophagy; LC3; apoptosis

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.05.004

江西省自然科學(xué)基金(20142BAB205027)江西省教育廳科技項(xiàng)目(GJJ13128)

330006南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)科(朱暄、朱敏、鄭俊俊、朱元昭、黃經(jīng)緯、洪道俊)；江西省玉山縣中醫(yī)院(張世彬)；江西省高安市人民醫(yī)院(陳慶國(guó))

洪道俊，Email：hongdaojun@hotmail.com

R746.9

A

1006-2963 (2015)05-0320-05

2015-04-03)