劉艷濤，洪煬，張旻,2，韓倩，曹曉丹，李莎，陸珂，李浩，傅志強，林矯矯,3

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日本血吸蟲基因的克隆、表達及其重組蛋白免疫保護效果分析

劉艷濤1，洪煬1，張旻1,2，韓倩1，曹曉丹1，李莎1，陸珂1，李浩1，傅志強1，林矯矯1,3

1 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海 200241 2 河南科技大學動物科技學院, 河南洛陽 471023 3 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009

劉艷濤, 洪煬, 張旻, 等. 日本血吸蟲SjOST48基因的克隆、表達及其重組蛋白免疫保護效果分析. 生物工程學報, 2015, 31(4): 501–511.Liu YT, Hong Y, Zhang M, et al. Cloning, expression of gene SjOST48 from Schistosoma japonicum and evaluation of the immunoprotective efficacy of rSjOST48 in mice. Chin J Biotech, 2015, 31(4): 501–511.

為了鑒定日本血吸蟲43基因并評估其重組蛋白作為新的血吸蟲病候選疫苗抗原的潛力，利用PCR技術(shù)擴增日本血吸蟲基因，應用熒光實時定量PCR分析該基因在日本血吸蟲不同發(fā)育階段蟲體的轉(zhuǎn)錄水平，以pET-28a(+) 為載體構(gòu)建重組表達質(zhì)粒并誘導其在大腸桿菌中表達。將純化的重組蛋白免疫BALB/c小鼠制備免疫血清，利用Western blotting檢測重組蛋白的免疫原性，應用間接免疫熒光技術(shù)對進行蛋白組織定位，利用間接ELISA方法檢測小鼠血清中特異性抗體水平。將重組抗原免疫小鼠，評估其免疫保護效果。PCR擴增得到1 248 bp不含信號肽的cDNA序列，同源性分析結(jié)果顯示，該基因為日本血吸蟲寡糖轉(zhuǎn)移酶OST48亞基，命名為。實時定量PCR分析顯示在檢測的童蟲和成蟲各個期別蟲體中均有轉(zhuǎn)錄，其中在28 d蟲體中的轉(zhuǎn)錄水平最高，在42 d雌蟲中的轉(zhuǎn)錄量顯著高于雄蟲。構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pET-28a(+)-SjOST48成功在大腸桿菌中表達，重組蛋白rSjOST48分子量約50 kDa。Western blotting分析表明rSjOST48能被小鼠免疫血清識別，具有良好的免疫原性，間接免疫熒光實驗表明SjOST48蛋白主要分布于蟲體體被，少量分布于實質(zhì)。ELISA檢測結(jié)果表明rSjOST48能誘導產(chǎn)生較高的特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體。動物免疫保護實驗結(jié)果表明SjOST48能誘導小鼠產(chǎn)生32.62% (<0.05) 的減蟲率及57.61% (<0.01) 的肝臟減卵率。本研究為深入探討日本血吸蟲基因的生物學功能及篩選新的血吸蟲疫苗候選分子奠定了基礎(chǔ)。

日本血吸蟲，基因，表膜蛋白，免疫保護效果

血吸蟲病(Schistosomiasis) 是一種分布廣泛、危害嚴重的人畜共患寄生蟲病，在全球76個國家和地區(qū)流行，受感染人數(shù)高達2億。截至2012年底，我國仍有45個血吸蟲病流行縣 (市、區(qū))，血吸蟲病人總數(shù)多達240 597例[1]。目前血吸蟲病防治仍以吡喹酮化療為主，但化療可能誘導抗藥性產(chǎn)生，具有潛在產(chǎn)生耐藥性的危險，且藥物治療無法控制重復感染，因此血吸蟲病新型疫苗及新藥相關(guān)研究已成為目前血吸蟲病防治研究的重大需求。

血吸蟲的體被表膜暴露于蟲體表面，是血吸蟲和宿主物質(zhì)交換的場所也是宿主免疫效應分子與蟲體直接接觸的界面，被認為與血吸蟲營養(yǎng)攝取、免疫逃避、免疫調(diào)節(jié)、排泄、滲透壓調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導等密切相關(guān)[2]，而分布于體被上的表膜蛋白是研發(fā)疫苗和藥物的理想靶標。目前研究發(fā)現(xiàn)Sj23、Sm-TSP-2和Sj29等表膜蛋白可作為抗血吸蟲病疫苗候選分子[3-4]，但其產(chǎn)生的免疫保護效果仍需提高，篩選誘導更高免疫保護效果的疫苗候選分子是血吸蟲病預防取得突破的基礎(chǔ)。

2006年Liu等[5]在通過蛋白組學分析日本血吸蟲與宿主互作研究和本實驗室Zhang等[6]在對日本血吸蟲體被蛋白進行蛋白組學分析時都鑒定到了SJCHGC01743蛋白。同源性分析結(jié)果顯示該蛋白與哺乳動物的寡糖轉(zhuǎn)移酶中的一個亞基DDOST/OST48高度同源，命名為SjOST48。DDOST/OST48是寡糖轉(zhuǎn)移酶 (OST) 復合體中的一個亞基[7]，屬于寡糖轉(zhuǎn)移酶48 kDa亞家族，它能夠跨過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜催化高甘露糖型寡糖 (Dolichol-P-GlcNac2Man9Glc3) 從多萜醇聯(lián)糖載運脂體轉(zhuǎn)運到新生肽鏈的糖基化識別位點 (Asn-X-Ser/Thr) 的天冬酰胺受體部位上[8]，參與新生蛋白質(zhì)N-連接糖基化修飾過程。N-連接糖基化普遍發(fā)生在細胞外環(huán)境的蛋白質(zhì)中，包括膜蛋白、分泌蛋白和體液中蛋白質(zhì)，而這些蛋白恰巧都是容易獲得并適合用作診斷和治療的分子，因此，許多臨床的生物標志物及治療的靶標常是糖蛋白[9]。本實驗室經(jīng)鑒定得到SjOST48，推測其參與了蛋白質(zhì)N-糖基化修飾作用，可能在血吸蟲發(fā)育、繁殖與蛋白運輸中發(fā)揮著重要作用[6]。本研究對SjOST48編碼基因進行克隆、表達，評估重組蛋白rSjOST48在小鼠中誘導的免疫保護效果，為深入研究該基因的生物學功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和酶

Trizol、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑購自Invitrogen公司；ExDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、pMD19-T載體、限制性內(nèi)切酶Ⅰ、Ⅰ購自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、B型質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責任公司；Ni-NTA HisBind Resin (Merck-Novagen) 購自中科新生命生物科技有限公司；硝酸纖維素膜 (Whatman) 購自經(jīng)科宏達生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的山羊抗小鼠IgG (H+L) 購自北京碧云天生物技術(shù)研究所；HRP標記的山羊抗小鼠IgG1、IgG2a購自AbD Serotech公司；DAB顯色試劑盒、可溶性單組分TMB購自天根生物科技有限公司。

1.1.2 菌種、質(zhì)粒、實驗動物和寄生蟲

大腸桿菌DH5α、BL21，表達質(zhì)粒pET-28a(+)，日本血吸蟲42 d成蟲cDNA均由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所動物血吸蟲病研究室保存；中國大陸株安徽品系的血吸蟲陽性釘螺由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供；雄性新西蘭白兔，體重2.5?3.0 kg，購自上海羅涇飛達實驗動物養(yǎng)殖場；6周齡雄性BALA/c小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 蟲體的收集

新西蘭白兔分別以腹部貼片法感染20 000、15 000、10 000、8 000、5 000、2 000條血吸蟲尾蚴，在感染后7、14、21、28、35和42 d后剖殺，以肝門靜脈灌注法收集蟲體，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA的提取

取液氮中凍存的7、14、21、28、35和42 d日本血吸蟲各200 mg，按Trizol試劑盒說明書分別進行總RNA的提取。

1.2.3 引物設(shè)計和含ORF cDNA片段的擴增

參照NCBI收錄的日本血吸蟲(gb|AY813753.1|) 核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0軟件分析并設(shè)計引物，分別在上、下游引物的5′端引入Ⅰ和Ⅰ限制性內(nèi)切酶位點。引物序列見表1，引物由上海華津生物技術(shù)有限公司合成。取1 μL 42 d成蟲cDNA模板進行PCR擴增，PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；然后94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.4 熒光實時定量PCR檢測在不同時期蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平

分別提取日本血吸蟲7、14、21、35、42 d及雌雄蟲體的總RNA，去除基因組DNA后按Prime ScriptTMRT reagent kit試劑盒操作說明反轉(zhuǎn)錄獲得日本血吸蟲各時期的cDNA。以日本血吸蟲基因為內(nèi)參，以不同期別的日本血吸蟲cDNA為模板，采用SYBR Premix ExTM進行熒光實時定量PCR。和Sj的實時定量PCR引物序列見表1，預期擴增基因片段長度分別為162 bp和213 bp。引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物使用濃度為10 pmol/μL。

1.2.5 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-SjOST48的構(gòu)建

以日本血吸蟲42 d成蟲cDNA作為模板，利用ExDNA聚合酶進行PCR擴增編碼SjOST48的cDNA序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)A型DNA快速純化試劑盒純化后，亞克隆到pMD19-T載體中并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，取陽性單克隆測序。將測序正確的重組質(zhì)粒pMD19-T-SjOST48和表達載體pET-28a(+)進行雙酶切后，用T4 DNA連接酶構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-28a(+)-SjOST48。

1.2.6 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達與表達產(chǎn)物的純化

將構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pET-28a(+)-SjOST48轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞中，經(jīng)PCR擴增、序列測定及酶切鑒定正確后，接種到含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至大腸桿菌對數(shù)生長期，加入 1 mmol/L異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 進行誘導表達。用8 mol/L尿素溶解重組蛋白，利用Ni-NTA HisBind Resin層析柱(Merk公司)在變性條件下分離純化重組蛋白，經(jīng)含不同梯度濃度尿素 (5、4、3、2、1、0 mol/L)的PBS逐步透析復性。

表1 PCR和qPCR引物

1.2.7 動物免疫與免疫血清制備

選擇6?8周齡 (SPF級) BALB/c小鼠30只，隨機分成3組，每組10只，分別為免疫組、佐劑對照組和空白對照組。免疫組每次每只注射100 μL含206佐劑和20 μg純化的SjOST48重組蛋白的乳化液；佐劑對照組每次每只注射100 μL 206佐劑和PBS的乳化液；空白對照組每次每只注射100 μL的PBS。免疫間隔時間為2周，共免疫3次。第3次免疫后2周，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚貼片攻擊感染40±1條日本血吸蟲尾蚴。分別在免疫前和每次免疫后第8天對每組小鼠進行眼靜脈采血，制備免疫血清。

1.2.8 重組蛋白的免疫原性分析

將10 μg重組蛋白rSjOST48進行SDS-PAGE后低溫電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上 (130 mA，1 h)，分別以重組蛋白免疫的BALB/c小鼠血清、免疫前健康BALB/c小鼠血清室溫孵育2 h，PBST 洗滌3次，羊抗鼠IgG-HRP室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，用二氨基聯(lián)苯胺 (DAB) 進行底物顯色。

1.2.9 SjOST48蛋白的蟲體組織定位分析

將日本血吸蟲35 d蟲體?20 ℃包埋固定，制成8 μm的冰凍切片備用。用丙酮將蟲體組織固定30 min，PBST洗滌3次，以重組蛋白免疫的小鼠血清室溫孵育2 h；洗滌3次，以免疫前小鼠血清作為陰性對照。Cy3標記的羊抗鼠IgG (H+L) 室溫孵育1 h，洗滌后用DAPI (10 μg/mL) 溶液室溫避光復染8 min，置熒光顯微鏡下觀察蛋白的分布情況。

1.2.10 ELISA 檢測免疫小鼠血清抗SjOST48特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體水平

以純化的重組蛋白rSjOST48為抗原，以1.2.7中制備的免疫血清為一抗，利用間接ELISA方法檢測3組小鼠免疫前后血清中抗SjOST48特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體效價變化。以包被緩沖液稀釋抗原濃度至10 μg/mL，包被96孔ELISA板，每孔100 μL，4 ℃過夜，用PBST洗滌3次后，每孔加入150 μL PBST-1.5%牛血清白蛋白(BSA) 進行封閉，37 ℃孵育2 h。PBST洗滌3次，被檢血清按1∶100稀釋后每孔加入100 μL，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌3次，羊抗小鼠IgG-HRP (北京碧云天生物技術(shù)研究所) 1∶1 000稀釋，羊抗小鼠IgG1-HRP和IgG2a-HRP (AbD Serotec，UK) 按1∶4 000稀釋后作二抗 (100 μL/孔)，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌3次，然后加入可溶性TMB底物100 μL，) 避光顯色5 min，加入2 mol/L H2SO4(50 μL/孔) 終止反應，用BioTek公司的酶標儀測定450 nm處的吸光值。

1.2.11 小鼠減蟲率和減卵率計算

末次免疫2周后，每只小鼠用腹部貼片法感染尾蚴40±1條。攻擊尾蚴6周后解剖小鼠，肝門靜脈沖洗法收集成蟲并記數(shù)，同時收集每只小鼠的肝臟。稱取肝組織0.5 g，剪碎后加 10 mL 5% NaOH，組織勻漿器勻漿，置56 ℃水浴消化15 min，混勻，吸取50 μL的懸液3份，鏡檢計數(shù)肝組織蟲卵。按以下公式計算減蟲率、肝臟減卵率 (EPG為平均每克肝組織中所負荷蟲卵數(shù))。

減蟲率=(1?免疫組平均蟲荷數(shù)/對照組平均蟲荷數(shù))×100%；

肝臟減卵率=(1?免疫組EPG/對照組EPG)×100%。

1.2.12 統(tǒng)計學分析

采用SPASS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析(Duncan法)。對有3個數(shù)值以上的樣本數(shù)據(jù)進行方差分析，求標準差；對兩組以上數(shù)據(jù)進行檢驗，分析各組數(shù)據(jù)之間的差異是否顯著。

2 結(jié)果

2.1基因的克隆及生物信息學分析

參照NCBI收錄的日本血吸蟲(gb|AY813753.1|) 核苷酸序列設(shè)計特異引物，以日本血吸蟲42 d成蟲cDNA為模板PCR擴增其ORF，得到大小為1 248 bp的特異片段 (圖1)，與預期目的片段大小相符，與參考序列相比存在5個核苷酸和3個氨基酸的差異。

生物信息學分析結(jié)果表明，的ORF含1 299個核苷酸，由433個氨基酸組成，相對分子量為48 696.6，理論等電點為5.14。該氨基酸序列的N端有一個跨膜區(qū)和一個信號肽，存在一個糖基化位點Asn51。利用NCBI的Blast 軟件對該基因編碼的氨基酸序列進行同源性搜索，結(jié)果顯示該基因編碼蛋白與日本血吸蟲DDOST/OST48蛋白具有高度同源性，氨基酸序列相似性高達98%。推測該蛋白為日本血吸蟲OST48蛋白，命名為SjOST48。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物

2.2在不同時期蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平分析

Real time PCR分析結(jié)果表明，在日本血吸蟲的7、14、21、28、35和42 d蟲體中均有轉(zhuǎn)錄，其中28 d蟲體轉(zhuǎn)錄量最高，其次是7 d、21 d、35 d，14 d蟲體轉(zhuǎn)錄量最低。28 d和42 d蟲體轉(zhuǎn)錄量與14 d蟲體轉(zhuǎn)錄量相比，差異極顯著 (<0.01)；42 d雌蟲的轉(zhuǎn)錄量顯著高于42 d雄蟲，差異極顯著 (<0.01) (圖2)。

2.3基因在大腸桿菌中的表達及重組蛋白純化

SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET-28a(+)- SjOST48在大腸桿菌BL21 (DE3)中成功表達，得到一重組蛋白rSjOST48，重組蛋白分子質(zhì)量約為50 kDa，與預期大小相符 (圖3)。在IPTG誘導后1?4 h表達量隨時間增長而增加，誘導 4 h后表達量達到最高并趨于穩(wěn)定。重組蛋白以包涵體形式存在，可溶解于8 mol/L尿素溶液中。經(jīng)過Ni-NTA His Bind Resin樹脂純化后，獲得了較純的重組蛋白，經(jīng)尿素梯度PBS逐步透析進行蛋白復性。

2.4 重組蛋白的抗原性分析

將重組蛋白進行SDS-PAGE，經(jīng)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，分別用重組蛋白免疫的BALB/c小鼠血清、健康BALB/c小鼠血清作為一抗進行Western blotting分析，結(jié)果顯示用重組蛋白免疫的BALB/c小鼠血清作為一抗時，50 kDa處有一明顯的識別條帶，而陰性對照組在50 kDa處未有條帶出現(xiàn)，表明重組蛋白具有良好的抗原性 (圖4)。

圖2 實時定量PCR分析SjOST48在不同期別(A) 及不同性別(B)蟲體中的轉(zhuǎn)錄水平差異

圖3 重組蛋白rSjOST48的表達分析

圖4 重組蛋白rSjOST48的免疫原性分析

2.5 rSjOST48蛋白在日本血吸蟲體內(nèi)的組織定位

在熒光顯微鏡下可以觀察到Cy3標記的山羊抗小鼠IgG二抗發(fā)出的紅色熒光以及DAPI復染核酸后發(fā)出的藍色熒光，實驗結(jié)果表明，以免疫前小鼠血清孵育后，未見紅色熒光 (圖5A)，以重組抗原免疫小鼠血清孵育后，在日本血吸蟲體被上出現(xiàn)紅色熒光，實質(zhì)部分也有少量紅色熒光分布 (圖5B)，表明SjOST48蛋白主要分布于體被，少量分布于實質(zhì)。

2.6 小鼠血清抗rSjOST48蛋白特異性抗體的檢測

用間接ELISA法檢測3組小鼠免疫前后血清抗rSjOST48特異性抗體IgG、IgG1和IgG2a效價變化，結(jié)果顯示重組蛋白第一次免疫小鼠后并沒有引起小鼠體內(nèi)特異性IgG抗體水平顯著升高，二免、三免后特異性抗體水平較206佐劑組極顯著升高 (<0.01)，在攻擊血吸蟲尾蚴6周后其抗體水平達到最大值，與206佐劑組相比差異極顯著 (<0.01)；而佐劑對照組和空白對照組在整個實驗過程中抗rSjOST48的特異性IgG抗體滴度均未出現(xiàn)明顯變化 (圖6)。同時，對抗rSjOST48蛋白特異性IgG1和IgG2a抗體滴度的測定結(jié)果表明，隨著3次免疫的進行，206佐劑對照組IgG1和IgG2a抗體滴度沒有明顯變化，但rSjOST48蛋白免疫組IgG1抗體滴度二免后略有升高，而IgG2a特異性抗體在一免、二免后都沒有明顯變化，三免后IgG1、IgG2a抗體滴度均顯著升高，與206佐劑組相比差異極顯著 (<0.01)，且隨著免疫次數(shù)的增加，IgG1/IgG2a比值逐漸增高，二免以后IgG1抗體滴度一直高于IgG2a (表2)。

圖5 SjOST48蛋白在35 d日本血吸蟲蟲體內(nèi)的定位分析(10×40)

圖6 小鼠血清抗rSjOST48特異性IgG抗體水平變化

2.7 動物免疫保護效果

動物免疫實驗結(jié)果表明，重組蛋白rSjOST48誘導產(chǎn)生了部分的免疫保護效果(表3)。和PBS組比較，重組融合蛋白rSjOST48分別誘導小鼠產(chǎn)生了32.62% (<0.05) 的減蟲率以及57.61% (<0.01) 的肝臟減卵率，而佐劑對照組獲得的減蟲率和減卵率分別為11.63%和1.51%，差異均不顯著。

3 討論

體被具有許多重要的生物功能，被認為是診斷、疫苗和藥物的潛在靶點，而其上的表膜蛋白是執(zhí)行這些功能的分子基礎(chǔ)。所以，通過對血吸蟲體被表膜蛋白的研究有可能發(fā)現(xiàn)新的疫苗和藥物靶標，這可為血吸蟲病防治提供新思路。實驗證明，多種膜蛋白能夠誘導宿主產(chǎn)生抗血吸蟲感染的保護性免疫反應。例如，屬于四跨膜蛋白家族的SmTSP-2能夠誘導57%的減蟲率和64%的肝臟減卵率[10]。定位于血吸蟲體被中的Sm29能夠誘導51%的減蟲率、60%的腸減卵率和50%的肝臟減卵率[11]。所以，鑒定并比較日本血吸蟲不同發(fā)育階段的體被表膜蛋白有助于進一步了解其免疫逃避機理以及發(fā)現(xiàn)新的疫苗候選分子和藥物靶標[12]。

表2 小鼠血清抗rSjOST48特異性抗體亞型IgG1及IgG2a分析

Data are expressed as. ** (<0.01) indicates statistically significant difference compared to the group of mice immunized with ISA 206.

表3 重組蛋白rSjOST48誘導小鼠產(chǎn)生的免疫保護效果

本研究對日本吸血蟲體被表膜蛋白SJCHGC01743進行了克隆、表達、純化以及生物信息學分析，結(jié)果表明SJCHGC01743和日本血吸蟲寡糖轉(zhuǎn)移酶OST48亞基的同源性最高，達到98%，命名為SjOST48。實時定量PCR結(jié)果顯示基因在檢測的童蟲和成蟲各個期別蟲體中均有轉(zhuǎn)錄，42 d雌蟲的轉(zhuǎn)入量顯著高于雄蟲，約為雄蟲的4.7倍，表明是一個雌蟲偏向基因，這與之前Fitzpatrick等[13]和Moertel等[14]的推測相吻合，是寡糖轉(zhuǎn)移酶復合體中起輔助催化作用的亞基[15]，提示雌雄蟲的蛋白質(zhì)糖基化作用可能存在差異。間接免疫熒光定位實驗結(jié)果表明，SjOST48蛋白主要分布在日本血吸蟲體被上，進一步驗證了Zhang等[6]等在日本血吸蟲體被蛋白組學研究中有關(guān)此蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。Western blotting結(jié)果顯示重組抗原rSjOST48可被重組蛋白免疫血清識別，表明rSjOST48具有較好的抗原性。以rSjOST48重組抗原進行小鼠免疫保護實驗，結(jié)果顯示免疫小鼠成蟲荷蟲量減少了32.62%，肝臟蟲卵數(shù)減少了57.61%，與空白對照組相比差異極顯著，表明SjOST48重組抗原在小鼠體內(nèi)誘導產(chǎn)生了部分免疫保護效果，具有作為日本血吸蟲疫苗候選分子的潛能。寡糖轉(zhuǎn)移酶是一個多亞基復合體，OST48作為其中的一個亞基，只用這一亞基的重組蛋白作為疫苗分子獲得的免疫保護效果可能有限，如果同時對OST復合體中其他亞基作為疫苗候選分子的潛力進行探討，研制多價疫苗或多表位重組抗原疫苗，有可能進一步提高候選疫苗的免疫保護效果。免疫應答分析表明，rSjOST48能誘導小鼠產(chǎn)生較高的特異性IgG抗體水平，且隨著免疫次數(shù)增加，特異性抗體水平顯著升高，而空白對照組和佐劑對照組特異性IgG抗體水平一直維持在較低水平，推測重組蛋白在小鼠體內(nèi)誘導的免疫保護效果可能和其誘導的較高的特異性抗體水平有關(guān)。同時，對抗rSjOST48蛋白的特異性IgG1和IgG2a抗體進行測定，結(jié)果顯示免疫組小鼠特異性IgG1和IgG2a抗體滴度呈上升趨勢，二免以后IgG1抗體滴度一直高于IgG2a，且IgG1/IgG2a比值逐漸增高。以往研究表明IgG2a主要激活Th1型輔助細胞，而IgG1主要促進Th0前體細胞向Th2細胞轉(zhuǎn)化[16]，在血吸蟲感染小鼠模型中，Th1型免疫應答誘導抗感染免疫保護力，而Th2型免疫應答則主要與免疫病理損害有關(guān)[17]，因此，推測rSjOST48可能誘發(fā)小鼠以Th2型為主、抗日本血吸蟲感染的Th1/Th2混合型免疫應答。綜上所述，基因值得作為潛在的日本血吸蟲疫苗候選分子深入研究。本文為深入開展SjOST48的生物學功能研究及抗血吸蟲疫苗候選分子篩選提供了基礎(chǔ)。

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(本文責編郝麗芳)

Cloning, expression of genefromand evaluation of the immunoprotective efficacy of rSjOST48 in mice

Yantao Liu1, Yang Hong1, Min Zhang1,2, Qian Han1, Xiaodan Cao1, Sha Li1, Ke Lu1, Hao Li1, Zhiqiang Fu1, and Jiaojiao Lin1,3

1,,,,200241,2,,471023,,Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and ZoonosesYangzhouJiangsuChina

To identifygene ofand evaluate the potential of the recombinant protein as a new vaccine candidate for schistosomiasis, polymerase chain reaction (PCR) technique was used toamplify the cDNA of the gene and real-time RT-PCR was used to analyze the transcription profiles ofat different development stages. Recombinant plasmid was successfully constructed and transformed into competentBL21 (DE3). Then the recombinant protein was expressed, purified and emulsified with ISA206 adjuvant to immunize BALB/c mice for three times. Theimmunogenicity was confirmed by Western blotting and tissue localization was detected by indirect immunofluorescent assay. The specific antibody level was detected by ELISA. The immunoprotection of rSjOST48 was evaluated by the reduction in worm and egg countsin mice. A cDNA with 1 248 nucleotides was isolated from 28-day-old schistosomes cDNAs by PCR. Sequence analysis revealed thatwas a 48-kDa subunit of the oligosaccharyltransferase complex () and named as. Real-time PCR analysis indicated that this gene was expressed in all investigated stages and had the highest expression level in 28 d worms, the level of gene transcription in female worms was significantly higher than that of male worms. Then recombinant plasmid pET28a(+)-SjOST48 was successfully constructed and expressed inBL21 (DE3). Western blotting analysis showed that rSjOST48 had good immunogenicity. Indirect immunofluorescent analysis revealed that SjOST48 was mainly distributed on the tegument of the worms. The result of ELISA indicated that the rSjOST48 vaccinated group could induce a significant increase in the level of specific IgG, IgG1 and IgG2a. An immunoprotection experiment showed that the vaccination of rSjOST48 in mice induced 32.62% (<0.05) reduction in the numbers of worms and 57.61% (<0.01) in eggs in liver, compared with that of the control group. This study provides the foundation for proceeding further research on the biologicalfunction of SjOST48 and screening new vaccine candidates for schistosomiasis.

,gene, tegument protein, immunoprotective effect

August 20, 2014; Accepted:October 29, 2014

Jiaojiao Lin. Tel: +86-21-34293440; E-mail: jjlin@shvri.ac.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 31172315, 81271871).

國家自然科學基金(Nos. 31172315, 81271871)資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-11-17

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140420.html