姜云水，李劍波，高孟，任皎，金素鳳，陳剛，吳潔，莊昉成，田厚文

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人乳頭瘤病毒16型L2E7融合蛋白的優(yōu)化表達、制備及其對腫瘤生長的抑制作用

姜云水1，李劍波1，高孟1，任皎2，金素鳳1，陳剛1，吳潔1，莊昉成1，田厚文2

1 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒病研究所浙江省醫(yī)學(xué)生物工程疫苗研究開發(fā)重點實驗室，浙江杭州 310052 2 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 102206

姜云水, 李劍波, 高孟, 等. 人乳頭瘤病毒16型L2E7融合蛋白的優(yōu)化表達、制備及其對腫瘤生長的抑制作用. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(4): 566–576.Jiang YS, Li JB, Gao M, et al. Optimized expression, preparation of human papillomavirus 16 L2E7 fusion protein and its inhibitory effect on tumor growth in mice. Chin J Biotech, 2015, 31(4): 566–576.

為提高人乳頭瘤病毒(HPV) 16型治療性融合蛋白疫苗HPV16 L2E7在大腸桿菌中的表達量，根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子，對HPV16基因進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的基因分別插入到pGEX-5X-1、pQE30和pET41a表達載體中，轉(zhuǎn)化JM109、JM109 (DE3) 和BL21 (DE3) 表達菌，篩選出高表達菌株pET41a-HPV16s/BL21 (DE3)，目的蛋白從占全菌蛋白的10%以下提高到約28%，優(yōu)化接種量、IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間，獲得最佳表達條件；通過15 L發(fā)酵罐發(fā)酵，SP Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow和Superdex 200 pg純化及復(fù)性HPV16 L2E7融合蛋白，制備的融合蛋白純度可達95%以上，經(jīng)SDS-PAGE、Western blotting鑒定證實，制備的HPV16 L2E7蛋白加CpG佐劑對小鼠移植瘤生長具有明顯的抑制作用，有75% (6/8) 的小鼠不成瘤，為后續(xù)的疫苗產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

人乳頭瘤病毒16型，優(yōu)化表達，發(fā)酵，純化，宮頸癌，疫苗

根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，宮頸癌是當前造成婦女癌癥死亡的主要因素之一，嚴重威脅婦女健康[1-3]。分子流行病調(diào)查結(jié)果證實，生殖道的高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)感染與宮頸癌有著十分密切的關(guān)系，高危型HPV的慢性、持續(xù)性感染被認為是宮頸癌及其癌前病變的主要原因，HPV16、18型是最常見的型別，其中約55%的宮頸癌與HPV16型感染相關(guān)[2,4-5]。目前對宮頸癌的治療主要采用放化療和手術(shù)治療，副作用大、復(fù)發(fā)率較高且花費較大。采用特異性的免疫方法即疫苗接種的辦法預(yù)防和治療HPV的感染是有效預(yù)防宮頸癌的重要手段之一。目前預(yù)防性疫苗研究已取得較大進展，在美國等發(fā)達國家已經(jīng)上市使用，但其僅用于沒有感染過HPV的人群[6-7]，針對已有的HPV持續(xù)性感染和宮頸癌及癌前病變患者，尚未有十分有效的免疫治療方法用于臨床，因此，研制高效、廉價的而且具備治療作用的HPV疫苗迫在眉睫。

由于HPV在體外難于培養(yǎng)及其致癌性，完整的病毒顆粒不大可能發(fā)展為疫苗，只能研制基因工程疫苗。病毒的次要衣殼蛋白L2同時具有中和抗體表位和細胞毒性T淋巴細胞 (Cytotoxin T lymphocyte，CTL) 表位，腫瘤相關(guān)抗原E7是誘導(dǎo)和維持癌細胞惡性表型所必需的蛋白，L2與E7融合后免疫機體能產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫[8-9]。本課題組選擇HPV16型L2蛋白融合已去除轉(zhuǎn)化活性的E7蛋白作為治療性疫苗的靶抗原，通過密碼子優(yōu)化、表達載體及菌株的篩選，利用基因工程技術(shù)獲得了1株高效表達HPV16 L2E7融合蛋白的工程菌株；然后通過優(yōu)化表達菌的培養(yǎng)誘導(dǎo)條件，摸索高密度發(fā)酵工藝、層析純化和復(fù)性工藝，制備了純度≥95%的HPV16 L2E7融合蛋白，復(fù)性后的蛋白在初步的動物實驗中顯示了顯著的腫瘤抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株

質(zhì)粒pET41a、pGEX-5X-1、pQE30和大腸埃希桿菌JM109、JM109 (DE3)、BL21 (DE3)由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)實驗室饋贈。pET30a-質(zhì)粒由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所應(yīng)急技術(shù)中心提供，含HPV16 L2完整的編碼區(qū)序列及經(jīng)修飾的完整E7編碼區(qū) 序列。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司，Ex酶購自Invitrogen公司。DNA marker購自天為時代公司。羊抗鼠IgG辣根過氧化物酶標記物購自美國Sigma公司。HPV16型L2單抗和E7單抗均由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所應(yīng)急技術(shù)中心饋贈。胰蛋白胨和酵母提取物購自O(shè)XOID公司。SP Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow和Superdex 200 pg均購自GE Healthcare公司。

1.1.3 實驗動物

C57BL/6(H-2b)小鼠，雌性，6?8周齡，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物繁育中心。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的設(shè)計與合成

以pET30a-質(zhì)粒中基因為模板，在保持編碼的產(chǎn)物蛋白氨基酸序列不變的前提下，結(jié)合大腸桿菌優(yōu)勢密碼子及mRNA的二級結(jié)構(gòu)分析，利用基因密碼子簡并性原則，設(shè)計出適合在大腸桿菌中表達HPV16 L2E7融合蛋白的核苷酸序列，命名為HPV16。設(shè)計好的基因序列交予上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成并插入pGEM-T Easy載體中，命名為pGEM-T-HPV16。

1.2.2重組表達載體的構(gòu)建

根據(jù)載體序列分別設(shè)計3套引物，引物中加入RⅠ和Ⅰ酶切位點序列，采用PCR方法從pGEM-T-HPV16擴增出HPV16片段。PCR產(chǎn)物和載體pGEX-5X-1、pQE30、pET41a分別用核酸內(nèi)切酶RⅠ和Ⅰ酶切。酶切后的載體和HPV16s基因片段用T4 DNA連接酶連接。連接后的產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109、JM109 (DE3) 和BL21 (DE3)：pGEX-HPV16s、pQE30-HPV16轉(zhuǎn)化JM109，pET41a-HPV16轉(zhuǎn)化JM109 (DE3)和BL21 (DE3)?？剐院Y選出來的克隆以PCR法驗證，驗證結(jié)果陽性的克隆進行基因測序驗證。

1.2.3 高表達菌株的篩選

將上述篩選出的陽性克隆菌株pGEX-HPV16/JM109、pQE30-HPV16/ JM109、pET41a-HPV16/BL21 (DE3)、pET41a-HPV16/JM109 (DE3)以及對照菌株pET30a- HPV16/BL21 (DE3) 根據(jù)載體的抗性分別接種于含抗生素Amp和Kana (100 μg/mL) 的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、300 r/min振蕩培養(yǎng)至600達0.6?1.0時，加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)表達3 h。表達菌進行SDS-PAGE分析，根據(jù)表達量的高低篩選出目的菌株用于后續(xù)研究。

1.2.4 HPV16 L2E7融合蛋白的表達條件優(yōu)化

篩選出的高表達菌株pET41a-HPV16/ BL21 (DE3) 分別進行接種量和誘導(dǎo)條件的優(yōu)化。表達條件的優(yōu)化采用搖瓶試驗方法，接種量分別選擇0.5%、2%和4%，IPTG濃度分別選擇終濃度為0.1、0.5和1.0 mmol/L，誘導(dǎo)溫度選擇30 ℃和37 ℃，誘導(dǎo)時間分別選擇2、4、6和8 h，接種量比較采取每小時取樣比濁法檢測菌液600值；誘導(dǎo)條件比較采用離心收集菌體，進行8% SDS-PAGE，并用Quantity One軟件分析蛋白表達量的百分比。高密度發(fā)酵條件以搖瓶摸索的結(jié)果為基礎(chǔ)進一步優(yōu)化。

1.2.5 HPV16 L2E7融合蛋白的發(fā)酵

高表達菌株pET41a-HPV16/BL21 (DE3) 經(jīng)LB搖床培養(yǎng)至600達0.8?1.0時，以5%的接種比例接種至含TB培養(yǎng)基的15 L發(fā)酵罐中 (德國B.BRAUN，Biostat C plus) 中，發(fā)酵溫度37 ℃，攪拌速度300?700 r/min，pH維持在7.0左右，溶氧保持在20%以上，期間恒定流加補料A (酵母粉100 g/L，檸檬酸5 g/L，氯化鎂5 g/L，氯化鈣2 g/L)，定時取樣監(jiān)測菌體密度，當600達25左右時，降溫至30 ℃，加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L進行誘導(dǎo)，期間根據(jù)發(fā)酵液中的葡萄糖濃度、pH值和溶氧反饋流加補料B (蛋白胨150 g/L，酵母粉100 g/L，葡萄糖250 g/L)，誘導(dǎo)4 h后下罐離心收獲。離心后的菌體–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 HPV16 L2E7融合蛋白的純化及柱上復(fù)性

發(fā)酵收獲的菌體經(jīng)高壓勻漿破碎后，離心收獲包涵體沉淀，包涵體經(jīng)洗滌后用變性緩沖液 (20 mmol/L Tris-Cl，8 mol/L尿素，5 mmol/L DTT，2 mmol/L EDTA-2Na，pH 8.0) 溶解，離心收集上清。層析柱SP Sepharose Fast Flow用平衡緩沖液 (20 mmol/L Tris-Cl，8 mol/L尿素，2 mmol/L DTT，pH 8.0) 平衡，離心上清上柱吸附，用緩沖液B沖洗平衡后用緩沖液C (20 mmol/L Tris-Cl，8 mol/L尿素，2 mmol/L DTT，1 mol/L NaCl，pH8.0) 梯度洗脫，收集目的蛋白峰。層析柱Q Sepharose Fast Flow用緩沖液D (20 mmol/L Tris-Cl，8 mol/L 尿素，10 mmol/L GSH，1 mmol/LGSSG，pH 8.0) 平衡，目的蛋白峰收集液稀釋后上柱吸附，用緩沖液D沖洗平衡至基線后，線性梯度緩慢增加緩沖液E (20 mmol/L Tris-Cl， 1 mol/L尿素，10 mmol/L GSH，1 mmol/L GSSG，pH 8.0) 濃度至100%，最后用緩沖液F (20 mmol/L Tris-Cl，1 mol/L尿素，10 mmol/L GSH，1 mmol/L GSSG，1 mol/L NaCl，pH 8.0) 線性梯度洗脫，收集目的蛋白峰。復(fù)性后的目的蛋白在層析柱Superdex 200 pg上進一步純化及替換緩沖液，復(fù)性后的蛋白最終替換至緩沖液G (20 mmol/L Tris-Cl，0.1 mol/L精氨酸，pH 7.5) 中保存。最終純化產(chǎn)物進行SDS-PAGE、Western blotting、N端測序等鑒定。

1.2.7 HPV16 L2E7融合蛋白的腫瘤生長抑制實驗

實驗分為PBS對照組、HPV16 L2E7+CpG組 (CpG 10 μg/只，HPV16 L2E7分別為30 μg/只、60 μg/只、90 μg/只)，每組8只小鼠，將1.2×104個TC-1腫瘤細胞于C57BL／6小鼠腹股溝皮下注射，第二天經(jīng)肌肉分別注射PBS和不同劑量的HPV16 L2E7蛋白+CpG佐劑，100 μL/只，兩周后相同劑量蛋白加強免疫，每周觀察腫瘤生長情況。

2 結(jié)果

2.1 密碼子優(yōu)化、表達載體的構(gòu)建及高表達菌株的篩選

密碼子優(yōu)化后的大小為1 713 bp的全基因片段插入pGEM-T Easy質(zhì)粒中，獲得質(zhì)粒pGEM-T-HPV16，HPV16密碼子優(yōu)化序列經(jīng)測序與設(shè)計的理論序列完全相符。以質(zhì)粒pGEM-T-HPV16為模板進行PCR擴增，引物端添加RⅠ和Ⅰ內(nèi)切酶位點，獲得 1 731 bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)RⅠ和Ⅰ雙酶切后插入表達載體pGEX-5X-1、pQE30、pET41a中，成功構(gòu)建HPV16 L2E7的原核表達載體pGEX-HPV16、pQE30-HPV16、pET41a- HPV16，構(gòu)建好的表達載體分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109、JM109 (DE3) 和BL21 (DE3) 篩選得到表達菌pGEX-HPV16/JM109、pQE30- HPV16/JM109、pET41a-HPV16/JM109 (DE3)、pET41a-HPV16/BL21 (DE3)。表達菌經(jīng)PCR法驗證，擴增出與理論值相符的約 1.7 kb的產(chǎn)物片段 (圖1)，表達載體經(jīng)測序證明目的基因插入正確，序列未發(fā)生堿基突變。

IPTG誘導(dǎo)表達結(jié)果 (圖2) 顯示，與基因密碼子優(yōu)化前的對照菌株pET30a-HPV16/BL21 (DE3)相比，菌株pET41a-HPV16/BL21 (DE3) 目的蛋白的表達量得到了明顯提高，目的蛋白從占全菌蛋白的10%以下提高到約28%，因此確定pET41a-HPV16/BL21 (DE3) 作為最優(yōu)菌株用于后續(xù)的蛋白制備研究。

圖1 不同表達菌株的PCR鑒定

2.2 HPV16 L2E7融合蛋白的表達條件優(yōu)化與發(fā)酵

前期研究表明本菌株繁殖30代 (10?15 h)內(nèi)質(zhì)粒保有率≥95%，因此整個發(fā)酵周期控制在10?15 h內(nèi)。不同接種量600檢測結(jié)果顯示2%、4%和6%的接種量培養(yǎng)4 h內(nèi)均已進入對數(shù)生長期，而0.5%的接種量進入對數(shù)生長期的時間明顯推遲 (圖3)；不同IPTG濃度不同時間誘導(dǎo)結(jié)果顯示0.5和1.0 mmol/L的IPTG濃度誘導(dǎo)的目的蛋白表達量明顯高于0.1 mmol/L，誘導(dǎo)2 h和4 h，目的蛋白表達百分比保持穩(wěn)定，6 h后開始下降 (圖4)；30 ℃和37 ℃誘導(dǎo)，目的蛋白的表達量未見明顯差異 (圖5)。高密度發(fā)酵條件以搖瓶摸索的結(jié)果為基礎(chǔ)進行優(yōu)化，接種量以5%和10%進行發(fā)酵實驗，10%接種量獲得的菌體總量比5%高，但是目的蛋白的相對表達量低于5%，而且發(fā)酵后期細菌增長過快造成補料添加速度跟不上，因此選擇5%的接種量；誘導(dǎo)則采用 1.0 mmol/L IPTG濃度37 ℃誘導(dǎo)4 h。15 L發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝為：搖瓶活化的菌種當600達0.8?1.0時，以5%的接種量接種，37 ℃培養(yǎng)約 5 h左右，600達到25以上，降溫至30 ℃，加入IPTG進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)4 h后下罐收獲發(fā)酵液約10 L，離心后收獲菌體濕重約800 g。

2.3 HPV16 L2E7融合蛋白的純化及復(fù)性

HPV16 L2E7在大腸桿菌內(nèi)主要以不溶的包涵體形式存在，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)高壓勻漿破碎離心后獲得包涵體、包涵體經(jīng)洗滌去除大量雜蛋白 (圖6A)、8 mol/L尿素變性溶解后經(jīng)SP Sepharose Fast Flow初步純化，Q Sepharose Fast Flow柱上復(fù)性，Superdex 200 pg精細純化后獲得純度≥95%目的蛋白的純化產(chǎn)物 (圖6B)。純化產(chǎn)物Western blotting結(jié)果顯示，在相對分子量約97 kDa處可見與L2和E7的抗體反應(yīng)帶 (圖6C)。純化產(chǎn)物SDS-PAGE割膠純化后的蛋白質(zhì)N端測序結(jié)果顯示與理論序列相符。

圖2 不同表達菌株表達量的SDS-PAGE分析

圖3 接種量對重組表達菌株pET41a-HPV16sl2e7/ BL21 (DE3) 生長的影響

圖5 誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間對HPV16 L2E7融合蛋白表達量的影響

2.4 HPV16 L2E7融合蛋白對腫瘤生長的抑制作用

PBS對照組在接種腫瘤細胞后28 d內(nèi)全部成瘤，抑瘤率 (0/8，0%)，HPV16 L2E7+CpG 30 μg組有2只小鼠不成瘤，抑瘤率 (2/8，25%)，HPV16 L2E7+CpG 60 μg和90 μg組有6只小鼠不成瘤，抑瘤率 (6/8，75%) (圖7)。與PBS對照組相比，HPV16 L2E7+CpG 30 μg組的抑瘤率雖有不同，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (=0.13)，HPV16 L2E7+CpG 60 μg和90 μg組則差異性極顯著 (＜0.01)，而HPV16 L2E7+CpG 30 μg組和60 μg、90 μg組則差異顯著 (0.05＞＞0.01)。

3 討論

治療性疫苗的作用機制主要是誘發(fā)強的CTL反應(yīng)，從而識別并殺傷被病毒感染的細胞。HPV治療性疫苗的靶抗原主要為衣殼蛋白和早期與腫瘤相關(guān)的蛋白。主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2中含有中和抗原表位和CTL表位，其與腫瘤相關(guān)抗原E6或E7融合后能刺激機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫[8]，E6、E7基因在癌前病變和宮頸癌中是持續(xù)表達的，它們通過失活PRb和P53抑癌蛋白，破壞細胞周期調(diào)控，從而導(dǎo)致上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化[10-12]，L1或L2融合去除轉(zhuǎn)化活性的E6和或E7蛋白可作為治療性疫苗的靶抗原[13-15]。相對于型特異性的L1基因，L2全長或L2 N端高度保守序列能誘發(fā)產(chǎn)生廣泛交叉保護作用的中和抗體[16-19]；E7序列較E6更為保守，而且更容易獲得高水平的表 達[20]，因此選擇L2和E7蛋白作為HPV16治療性疫苗的靶抗原。

大腸桿菌由于其遺傳背景清楚、成本低廉、生產(chǎn)率高、操作簡單成為克隆和表達外源基因的首選[21-22]，但是由于種屬特異性等原因，外源蛋白在大腸桿菌中表達往往存在表達量低、表達產(chǎn)物活性低或者以無活性的包涵體形式存在，給后續(xù)的純化和復(fù)性帶來了極大的挑戰(zhàn)[23]。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，大量商用的表達載體及配套菌株可供選擇，為了獲得高表達的具有活性的目的蛋白用于后續(xù)的研究以及產(chǎn)業(yè)化，需要考慮多方面的因素，包括密碼子的偏好性、表達載體和表達宿主菌的篩選、表達條件的優(yōu)化 等[22,24]。合作單位前期構(gòu)建了表達系統(tǒng)pET30a-HPV16/BL21(DE3)，表達的蛋白經(jīng)動物實驗證明了具有抗腫瘤移植的作用[25]。但是表達量偏低，難以滿足產(chǎn)業(yè)化的要求，因此，本研究首先進行了密碼子優(yōu)化，用大腸桿菌的偏愛密碼子替換了原始密碼子，從基因?qū)用嫔咸岣吡嗣艽a子的適應(yīng)性。表達載體及菌株的選擇也是影響蛋白表達的因素之一，優(yōu)化后的基因分別選用3個不同體系的表達載體和相應(yīng)的菌株來進行表達量的篩選，篩選的結(jié)果顯示：與基因密碼子優(yōu)化前的原始菌株pET30a- HPV16/BL21 (DE3) 相比，菌株pET41a- HPV16/BL21 (DE3) 目的蛋白的表達量得到了明顯的提高。

獲得高表達菌株pET41a-HPV16/ BL21 (DE3) 后，本實驗在搖瓶上選擇接種量、IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間幾個參數(shù)進行了優(yōu)化，為后續(xù)的高密度發(fā)酵提供了初步依據(jù)。接種量的大小直接影響發(fā)酵周期，采用稍大的接種量可以縮短菌體生長的遲滯期，明顯縮短發(fā)酵時間，但太大的接種量會因為帶入過多的代謝廢物，反而影響菌體的生長。從圖3結(jié)果可以看出，除了0.5%的接種量，2%、4%和6%的接種量菌體的生長速度差不多，培養(yǎng)4 h內(nèi)均已進入對數(shù)生長期，因此在發(fā)酵罐上進一步摸索5%和10%的接種量，以期通過提高接種量在一定的時間內(nèi)獲得更高的菌體密度，最終提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率 (單位體積單位時間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量)，但是發(fā)現(xiàn)過高的菌體密度造成了目的蛋白相對表達量的降低，同時增大了發(fā)酵體系的負擔(dān)，因此選擇5%的接種量。IPTG為異丙 基-β-D-硫代半乳糖苷，是一種十分有效的乳糖操縱子的誘導(dǎo)劑，可與阻遏物結(jié)合促進基因的表達。以IPTG作為誘導(dǎo)劑，其作用是與阻遏物結(jié)合，起解阻遏作用。因此當所加入的IPTG量足以封閉所有阻遏物位點時，即為理論上的最佳濃度。IPTG濃度過高時，對菌體具有一定的毒性作用，影響細胞的繁殖和生長。對于帶普通T7啟動子載體，終濃度為0.4 mmol/L的IPTG可以實現(xiàn)完全誘導(dǎo)，而帶有T7啟動子的載體則需要終濃度為1 mmol/L的IPTG才能完全誘導(dǎo)。pET-41a為帶有T7啟動子的載體，理論上需要1 mmol/L的IPTG才能完全誘導(dǎo)。搖瓶實驗結(jié)果表明0.5和1.0 mmol/L的IPTG濃度誘導(dǎo)的目的蛋白表達量明顯高于0.1 mmol/L，綜合考慮發(fā)酵培養(yǎng)時的菌體密度較高，所以選擇終濃度為 1 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時間則根據(jù)實驗結(jié)果定為4 h。

HPV16 L2E7蛋白是以不溶的包涵體形式表達的，表達的蛋白因為錯誤折疊、二硫鍵錯配等原因需要變性溶解后復(fù)性獲得活性蛋白，盡管37 ℃和30 ℃誘導(dǎo)的總表達量無明顯差異，但是30 ℃誘導(dǎo)表達的蛋白從包涵體純度、變性容易程度以及復(fù)性率上高于37 ℃誘導(dǎo)表達的蛋白，這可能是由于37 ℃誘導(dǎo)蛋白表達速率過高，造成蛋白錯誤折疊率高有關(guān)，低溫誘導(dǎo)有利于提高蛋白的折疊率從而提高蛋白的可溶性及活性。后期進行的25 ℃、30 ℃和37 ℃誘導(dǎo)表達結(jié)果表明，30 ℃和37 ℃誘導(dǎo)表達的蛋白還是以包涵體為主，25 ℃誘導(dǎo)表達的蛋白則呈現(xiàn)膠體狀，需要長時間的離心才能分離，蛋白的可溶性和純度明顯提高，但是25 ℃誘導(dǎo)在得率上降低明顯，而且誘導(dǎo)時間大大延長，不利于后期產(chǎn)業(yè)化的工藝。大腸桿菌表達的變性蛋白的復(fù)性方法有透析復(fù)性、稀釋復(fù)性和層析柱上復(fù)性等[26-27]，近年來層析柱上復(fù)性由于效率高且兼具純化作用而成為研究熱點[28]，本實驗通過 Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱上復(fù)性的方法，獲得了可溶的具有免疫活性的目的蛋白，但是復(fù)性率偏低，未復(fù)性的蛋白在柱上沉淀吸附，今后將進一步優(yōu)化復(fù)性條件以提高復(fù)性得率。

本實驗制備的蛋白在小鼠荷瘤模型上顯示出特異性的抑制腫瘤作用且具有劑量效應(yīng)，與PBS對照組和HPV16 L2E7+CpG 30 μg組相比，HPV16 L2E7+CpG 60 μg以上即具有顯著的抑瘤效果，但是最終還是有25%的小鼠誘發(fā)腫瘤，說明單獨免疫一定劑量的融合蛋白疫苗誘發(fā)的免疫反應(yīng)有限，今后進一步加大劑量以及與病毒載體疫苗等其他類型的疫苗聯(lián)合免疫將有助于提高免疫效果。

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(本文責(zé)編郝麗芳)

Optimized expression, preparation of human papillomavirus 16 L2E7 fusion protein and its inhibitory effect on tumor growth in mice

Yunshui Jiang1, Jianbo Li1, Meng Gao1, Jiao Ren2, Sufeng Jin1, Gang Chen1, Jie Wu1, Fangcheng Zhuang1, and Houwen Tian2

1,,,310052,,2,,102206,

HPV16 L2E7 is a fusion protein used for therapeutical vaccine targeting HPV virus. To increase its expression in, we optimized the codon usage of HPV16gene based on its codon usage bias. The optimized gene of HPV16was cloned into three different vectors: pGEX-5X-1, pQE30, ET41a, and expressed in JM109, JM109 (DE3) and BL21 (DE3) lines separately. A high expression line was selected with pET41a vector in BL21 (DE3) cells. After optimization of the growth condition, including inoculation amount, IPTG concentration, induction time and temperature, the expression levelof HPV16 L2E7 was increased from lessthan 10% to about 28% of total protein. HPV16 L2E7 protein was then purified from 15L culture by means of SP Sepharose Fast Flow, Q Sepharose Fast Flow and Superdex 200 pg. After renaturing, HPV16 L2E7 protein with ≥95% purity was achieved, which was confirmed via SDS-PAGE gel and Western blotting. The combined use of purified HPV16 L2E7 and CpG helper has shown clear inhibition of tumor growth in mice injected with tumor cells, with six out of eight mice shown no sign of tumor. Thisstudy lays a solid foundation for a new pipeline of large-scale vaccine production.

human papillomavirus 16, optimized expression, fermentation, purification, uterine cervica cancer, vaccines

July 23, 2014; Accepted:September 22, 2014

Fangcheng Zhuang. Tel/Fax: +86-571-88861601; E-mail: fczhuang@163.com Houwen Tian. Tel/Fax: +86-10-58900881; E-mail:houwent@126.com

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA02Z490), Science and Technology Planning Project of Zhejiang Province (No. 2012F10005).

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2006AA02Z490)，浙江省科技計劃 (No. 2012F10005) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-10-10

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140390.html