李國(guó)輝，李芒芒，周倩，胡朝陽(yáng)，唐琦，姚勤

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利用優(yōu)化改造的家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)提高NS1表達(dá)產(chǎn)量

李國(guó)輝，李芒芒，周倩，胡朝陽(yáng)，唐琦，姚勤

江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院，江蘇鎮(zhèn)江 212013

李國(guó)輝, 李芒芒, 周倩, 等. 利用優(yōu)化改造的家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)提高NS1表達(dá)產(chǎn)量. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(4): 591–602.Li GH, Li MM, Zhou Q, et al. Modified baculovirus system for high expression of Bombyx mori bidensovirus NS1 in silkworm. Chin J Biotech, 2015, 31(4): 591–602.

為優(yōu)化家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，提高外源基因的表達(dá)產(chǎn)量。文中通過(guò)同源重組技術(shù)，用串聯(lián)的氯霉素基因(Cm) 表達(dá)盒和綠色熒光蛋白基因() 表達(dá)盒將其替換，從而獲得和兩個(gè)基因缺失的家蠶桿狀病毒載體。通過(guò)轉(zhuǎn)座，將多角體啟動(dòng)子控制的家蠶二分濃核病毒(BDV)基因表達(dá)盒，定點(diǎn)插入到改造后的該分子載體中。將重組載體轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，獲得能表達(dá)家蠶二分濃核病毒 (BDV) NS1的缺失型重組病毒；另外，將多角體啟動(dòng)子控制的基因轉(zhuǎn)座到野生型Bm-bacmid中，獲得能表達(dá)BDV NS1的野生型重組病毒。將這兩種病毒分別皮下注射家蠶，對(duì)感染后的家蠶血液中NS1表達(dá)水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)缺失和重組病毒感染的家蠶血液中，NS1的表達(dá)量是對(duì)照組的3倍，從而建立了一種高效表達(dá)可溶性NS1蛋白的方法，為靶蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究奠定基礎(chǔ)。

家蠶桿狀病毒載體，家蠶二分濃核病毒，NS1

桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(BEVS) 是通過(guò)制備攜帶有外源基因的重組桿狀病毒，感染昆蟲(chóng)或昆蟲(chóng)細(xì)胞進(jìn)行外源蛋白的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有正確的空間折疊和糖基化等修飾，其生物活性接近其對(duì)應(yīng)的天然產(chǎn)物。在BEVS中，常用苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(NPV) 或者家蠶核型多角體病毒(NPV) 用作重組病毒構(gòu)建的載體，而在表達(dá)外源蛋白時(shí)，我們傾向選擇家蠶桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，這與我國(guó)的家蠶資源豐富及大規(guī)模養(yǎng)殖密切相關(guān)[1]，容易獲得大量的靶蛋白。家蠶桿狀病毒具有容納外源大片段DNA或同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因的能力；另外，家蠶桿狀病毒不感染人、畜等脊椎動(dòng)物，表達(dá)外源蛋白所需時(shí)間周期也遠(yuǎn)短于動(dòng)物或植物系統(tǒng)，可通過(guò)昆蟲(chóng)或細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)外源蛋白進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，這些特性使BEVS成為目前最有效、應(yīng)用最廣泛的一種真核表達(dá) 系統(tǒng)[2]。

盡管BEVS系統(tǒng)有諸多優(yōu)勢(shì)以及技術(shù)上的不斷改進(jìn)，但在實(shí)踐中還是面臨著一些挑戰(zhàn)，比如在培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白，其生產(chǎn)成本較為昂貴[3]；BEVS系統(tǒng)中缺乏有效的熒光信號(hào)，難以對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中是否產(chǎn)生感染性的重組病毒粒子進(jìn)行快速判定，影響外源蛋白表達(dá)的進(jìn)程；另外，與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，利用BEVS系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白，其產(chǎn)量相對(duì)較低，尤其是感染后的細(xì)胞最終會(huì)裂解，致使靶蛋白的表達(dá)水平及其修飾還未達(dá)到最佳狀態(tài)[4]，而外源蛋白的表達(dá)量和翻譯后修飾水平較低，會(huì)在很大程度上限制BEVS的應(yīng)用。研究表明：通過(guò)增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性、胞內(nèi)共表達(dá)分子伴侶Hsp70等其他蛋白、抑制胞內(nèi)一些蛋白酶的活性以及延遲細(xì)胞裂解等策略，都可提高BEVS中外源基因的表達(dá)產(chǎn)量[5-7]。

家蠶桿狀病毒基因組大小為128 kb，理論預(yù)計(jì)有143個(gè)開(kāi)放閱讀框[8]，其中幾丁質(zhì)酶和半胱氨酸蛋白酶基因緊挨排列在一起，其間隔序列有48 bp。序列分析表明：幾丁質(zhì)酶基因全長(zhǎng)1 659 bp，編碼一個(gè)由552個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)；半胱氨酸蛋白酶基因全長(zhǎng)972 bp，編碼一個(gè)由323個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，研究表明幾丁質(zhì)酶能水解家蠶內(nèi)外表皮、中腸及圍食膜組織中的幾丁質(zhì)，促進(jìn)蟲(chóng)體液化，而半胱氨酸蛋白酶與細(xì)胞裂解直接相關(guān)，能降解宿主體內(nèi)蛋白[9-11]。因此，本文通過(guò)同源重組技術(shù)，對(duì)家蠶桿狀病毒穿梭載體中和基因進(jìn)行缺失，以缺失后的Bm-bacmid為分子載體，構(gòu)建能表達(dá)家蠶二分濃核病毒NS1蛋白的重組病毒，從而延遲細(xì)胞裂解及蟲(chóng)體液化的時(shí)間，以期提高家蠶血液中NS1蛋白的表達(dá)產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、病毒和試劑

家蠶桿狀病毒穿梭載體Bm-bacmid、pUC119、pFastHTB-和pFastHTB質(zhì)粒保存于本實(shí)驗(yàn)室。pKOV-Cm質(zhì)粒由中山大學(xué)生科院楊凱教授惠贈(zèng)。大腸埃希菌DH5?和DH10B宿主菌在LB培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)。vBm-bacmid-病毒、vBm-bacmid病毒和家蠶二分濃核病毒保存于本實(shí)驗(yàn)室。氨卞青霉素(Amp)、卡那霉素(Kana)、四環(huán)素(Tet)、IPTG、L-(+) 阿拉伯糖、X-gal和OPD均購(gòu)自上海朝瑞生物公司。NS1單克隆抗體由由上海Abmart公司定制。羊抗小鼠IgG-HRP和胎牛血清白蛋白(BSA) 購(gòu)自武漢博士德生物公司。d Ⅲ、Ⅰ、ⅠⅠⅠ、T4 DNA連接酶、酶和pMD18-T載體購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司。引物 (表1)合成和序列測(cè)定由上海捷瑞生物公司完成。

通過(guò)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，首先通過(guò)US-F和US-R從Bm-bacmid中擴(kuò)增長(zhǎng)度為551 bp的US片段，對(duì)US片段與pUC119質(zhì)粒分別進(jìn)行d Ⅲ和Ⅰ雙酶切，將酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行連接，獲得pUC119-US重組質(zhì)粒；其次通過(guò)Cm-F和Cm-R，從pKOV-Cm質(zhì)粒中擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 039 bp的Cm表達(dá)盒，對(duì)其進(jìn)行Ⅰ和Ⅰ雙酶切，將酶切后的Cm表達(dá)盒與pUC119-US進(jìn)行連接，獲得pUC119-US-；通過(guò)Pie1--SV40-F和Pie1--SV40-R從pFastHTB-質(zhì)粒中擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 544 bp的表達(dá)盒，對(duì)其進(jìn)行Ⅰ和Ⅰ雙酶切，將酶切的表達(dá)盒與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的pUC119-US-進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pUC119-US--；最后通過(guò)DS-F和DS-R引物對(duì)，從Bm-bacmid中擴(kuò)增長(zhǎng)度為519 bp的DS片段，對(duì)其進(jìn)行Ⅰ酶切，將其與Ⅰ單酶切的pUC119-US--載體進(jìn)行連接，由于DS片段兩端都為Ⅰ酶切位點(diǎn)，不能與載體進(jìn)行定向連接，因此，需要對(duì)平板上的克隆進(jìn)行反復(fù)鑒定，將序列測(cè)定正確的重組質(zhì)粒命名為pUC119-US---DS。

表1 本研究所需引物列表

Underlined letters indicate restriction enzyme digestion sites.

1.3 構(gòu)建和缺失型重組Bm-bacmid

1.4 表達(dá)家蠶二分濃核病毒NS1蛋白的重組Bm-bacmid的構(gòu)建

通過(guò)轉(zhuǎn)座，將多角體啟動(dòng)子控制的表達(dá)盒定點(diǎn)插入到改造后的Bm-bacmid (ChiA–/CP–)中，具體實(shí)施流程如下：通過(guò)-F和-R從家蠶二分濃核病毒基因組中擴(kuò)增基因，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行Ⅰ和Ⅰ雙酶切，將酶切后的純化片段與經(jīng)同樣雙酶切的pFastHTB質(zhì)粒進(jìn)行連接，產(chǎn)生重組質(zhì)粒pFastHTB-。

采用氯化鈣方法[12]，制備含有Bm-bacmid及輔助質(zhì)粒的大腸埃希菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，將5 ng的重組質(zhì)粒pFastHTB-添加到DH10B感受態(tài)細(xì)胞中，42 ℃熱激45 s后，將800 μL SOC培養(yǎng)基加入到轉(zhuǎn)化后的溶液中，在37 ℃、225 r/ min振蕩培養(yǎng)2 h，取100 μL培養(yǎng)液與40 μg/mL IPTG和20 mg/mL X-gal混合，分別涂布于含三抗K+T+G+(50 μg/mL卡那霉素，5 μg/mL四環(huán)素，7 μg/mL慶大霉素) LB平板上，37 ℃培養(yǎng)36–48 h，對(duì)平板上較大的白色單菌落進(jìn)行PCR鑒定。理論上，在轉(zhuǎn)座酶的作用下，重組質(zhì)粒pFastHTB-中Tn7L-Tn7R之間的序列，可定點(diǎn)插入到Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 中，從而獲得可表達(dá)BDV NS1蛋白的重組Bm-bacmid-(ChiA–/CP–)。

1.5 制備重組病毒上清

從DH10B大腸桿菌細(xì)胞中抽提重組Bm-bacmid-(ChiA–/CP–)，在Cellfectin?(Invitrogen) 的介導(dǎo)下，將這重組桿狀病毒載體轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行熒光顯微觀察，轉(zhuǎn)染96 h后，對(duì)能觀察到熒光的轉(zhuǎn)染孔中，收集其孔中的細(xì)胞轉(zhuǎn)染上清，將收集的轉(zhuǎn)染上清感染BmN細(xì)胞，對(duì)感染后的BmN細(xì)胞進(jìn)行熒光顯微觀察，收集感染96 h后的病毒上清，從而獲得表達(dá)BDV NS1的病毒vBm- bacmid-(ChiA–/CP–)；另外，將本實(shí)驗(yàn)室保存的vBm-bacmid-(不缺失和基因) 病毒感染BmN細(xì)胞，收集感染96 h后的vBm-bacmid-上清溶液。

1.6 Western blotting分析和ELISA測(cè)定

從皮下注射5 μL vBm-bacmid-(ChiA–/CP–) 病毒液到4齡家蠶(306品系，易感品種) 體內(nèi)，共注射30頭易感品系家蠶；另外，從皮下分別注射5 μL vBm-bacmid-病毒液到30頭4齡同品系的家蠶中，每天給它們添飼新鮮的桑葉，于27 ℃的室溫條件下自然生長(zhǎng)，通過(guò)體式熒光顯微鏡對(duì)感染病毒的家蠶進(jìn)行熒光觀察，可對(duì)病毒在家蠶體內(nèi)的增殖動(dòng)態(tài)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)了解，收集兩種病毒感染后的家蠶血液，并對(duì)家蠶血液中表達(dá)的NS1蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種家蠶血液中的NS1蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，將待檢測(cè)的抗原固定于酶標(biāo)孔中，每孔100 μL于4 ℃孵育12 h，加入5%脫脂奶粉于37 ℃封閉2 h，傾去孔中的溶液并用PBS-T洗滌3次，每次3 min，加入NS1單克隆抗體于37 ℃孵育1 h，接著加入羊抗小鼠IgG-HRP于37 ℃孵育0.5 h，傾去孔中溶液并洗滌3次，加入OPD底物顯色，37 ℃濕盒溫育30 min，通過(guò)2 mol/L H2SO4終止顯色反應(yīng)，利用酶標(biāo)儀測(cè)定其在492 nm波段處的吸光值，以系列濃度的BSA與其對(duì)應(yīng)的值做標(biāo)準(zhǔn)曲線用作參考。

2 結(jié)果

鑒于該重組質(zhì)粒中酶切位點(diǎn)的復(fù)雜性，通過(guò)多輪PCR對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行反復(fù)鑒定，通過(guò)US-F/US-R引物對(duì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為551 bp的US片段(圖2，泳道1)；通過(guò)Cm-F/Cm-R引物對(duì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 079 bp的 Cm表達(dá)盒(圖2，泳道2)；通過(guò)Pie1--SV40-F/Pie1--SV40-R引物對(duì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 544 bp的表達(dá)盒(圖2，泳道3)；通過(guò)DS-F/DS-R引物對(duì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為514 bp的DS片段(圖2，泳道4)；通過(guò)US-F/Cm-R引物對(duì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 630 bp的US+Cm表達(dá)盒(圖2，泳道5)；通過(guò)US-F/Pie1--SV40-R引物對(duì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為3 174 bp的US+Cm表達(dá)盒+表達(dá)盒(圖2，泳道6)；通過(guò)US-F/DS-R引物對(duì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為3 688 bp的US+Cm表達(dá)盒+表達(dá)盒+DS片段(圖2，泳道7)；通過(guò)Cm-F/Pie1--SV40-R引物對(duì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為 2 623 bp的Cm表達(dá)盒+表達(dá)盒 (圖2，泳道8)；通過(guò)Cm-F/DS-R引物對(duì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為3 137 bp的Cm表達(dá)盒+表達(dá)盒+DS片段(圖2，泳道9)；通過(guò)Pie1-egfp-SV40-F/DS-R引物對(duì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為2 058 bp的表達(dá)盒+DS片段(圖2，泳道10)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA凝膠電泳，結(jié)果與理論預(yù)計(jì)一致，將PCR鑒定的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明測(cè)定序列與理論序列完全一致。

圖1 重組質(zhì)粒pUC119-US---DS的構(gòu)建流程示意圖

圖2 重組質(zhì)粒pUC119-US---DS的鑒定

2.2 重組Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 的鑒定

重組Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 和野生型Bm-bacmid如圖3 A所示，通過(guò)同源重組，使串聯(lián)的和表達(dá)盒替換串聯(lián)的和基因中的部分DNA片段。利用不同的引物對(duì)在重組Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 和野生型Bm-bacmid上所處的位置(圖3B) 不同，分別從野生型和缺失型Bm-bacmid中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析(圖3C)。泳道1、3、5、7、9：以缺失型Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 為模板，分別通過(guò)Cm-F/Cm-R擴(kuò)增Cm基因表達(dá)盒、Pie1--SV40-F/Pie1--SV40-R擴(kuò)增基因表達(dá)盒、Cm-F/Pie1--SV40-R擴(kuò)增Cm與基因表達(dá)盒、US-F/Cm-R擴(kuò)增US與Cm表達(dá)盒，以及US-F/DS-R擴(kuò)增包括US、Cm表達(dá)盒、基因表達(dá)盒與DS 4個(gè)DNA片段；泳道2、4、6、8、10：以野生型Bm-bacmid為模板，以Cm-F/Cm-R、Pie1--SV40-F/Pie1--SV40-R、Cm-F/Pie1-egfp-SV40-R、US-F/Cm-R及US-F/DS-R為引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用作陰性對(duì)照，電泳結(jié)果與理論預(yù)計(jì)相一致，表明已成功獲得重組Bm-bacmid (ChiA–/CP–)，可用作表達(dá)外源基因的分子載體。

2.3 熒光顯微觀察

為鑒定缺失的Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 能否產(chǎn)生具有感染性的病毒粒子，對(duì)重組Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行熒光顯微觀察，結(jié)果如圖4 A所示：轉(zhuǎn)染24 h后，在細(xì)胞之中能觀察到一些零星的綠色熒光，轉(zhuǎn)染48 h后，發(fā)現(xiàn)在視野中能觀察到的綠色熒光信號(hào)越來(lái)越多，到轉(zhuǎn)染96 h后，80%的視野中都布滿了綠色熒光。為鑒定轉(zhuǎn)染上清中是否產(chǎn)生了感染性的病毒粒子，將轉(zhuǎn)染96 h后的細(xì)胞上清與培養(yǎng)的BmN細(xì)胞孵育1 h，棄上清并添加含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，對(duì)感染后的BmN細(xì)胞進(jìn)行熒光顯微觀察，結(jié)果如圖4 B所示：在感染24–96 h時(shí)間段，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中能觀察到的綠色熒光越來(lái)越多，說(shuō)明轉(zhuǎn)染后的上清中能產(chǎn)生具有感染性的病毒粒子，具有啟動(dòng)下一輪感染的能力。該結(jié)果表明：缺失和的重組Bm-bacmid (ChiA–/CP–)，不會(huì)影響感染性病毒粒子的產(chǎn)生，以該缺失型桿粒作分子載體，可用作高效表達(dá)外源基因的重組病毒載體。

2.4 重組病毒vBm-Bacmid(ChiA–/CP–)的制備

利用鑒定的Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 為分子載體，通過(guò)轉(zhuǎn)座，將多角體啟動(dòng)子控制的基因表達(dá)盒定點(diǎn)插入到該載體的轉(zhuǎn)座位點(diǎn)，利用M13-F/M13-R引物對(duì)，對(duì)發(fā)生轉(zhuǎn)座后的白色克隆進(jìn)行PCR鑒定，未發(fā)生轉(zhuǎn)座的Bm-bacmid中擴(kuò)增產(chǎn)物為280 bp左右，而發(fā)生轉(zhuǎn)座的Bm-bacmid中擴(kuò)增產(chǎn)物為3 200 bp左右，電泳結(jié)果如圖5所示，其結(jié)果與理論預(yù)計(jì)相一致，表明基因表達(dá)盒已成功地插入到Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 轉(zhuǎn)座位點(diǎn)。

圖3 缺失型重組Bm-bacmid (ChiA–/CP–) 的構(gòu)建流程示意圖和PCR鑒定

圖4 轉(zhuǎn)染或感染的BmN細(xì)胞中不同時(shí)間點(diǎn)的熒光顯微觀察

圖5 重組Bm-bacmid -ns1 (ChiA–/CP–) 的PCR鑒定

抽提重組Bm-bacmid(ChiA–/CP–)，通過(guò)脂質(zhì)體的介導(dǎo)，將其轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的BmN細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行綠色熒光顯微觀察，收集有熒光的孔中上清溶液，將其再次感染培養(yǎng)的BmN細(xì)胞，收集感染96 h后的細(xì)胞上清，從而獲得重組病毒vBm-bacmid(ChiA–/CP–) 溶液，可用于下一步的家蠶感染實(shí)驗(yàn)中。

2.5 兩種重組病毒感染的家蠶血液中NS1蛋白的鑒定

分別收集vBm-bacmid(ChiA–/CP–) 和vBm-Bacmid病毒感染的家蠶血液，以vBm-Bacmid病毒感染的家蠶血液為空白對(duì)照(圖6泳道1)，對(duì)收集的家蠶血液蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，對(duì)等量的家蠶血液蛋白進(jìn)行Western blotting分析，以NS1單克隆抗體為一抗進(jìn)行孵育，偶聯(lián)有堿性磷酸酶的馬抗小鼠IgG為二抗，通過(guò)BCIP/NBT堿性磷酸酯酶試劑盒對(duì)其進(jìn)行顯色，結(jié)果表明：重組病毒vBm-bacmid(ChiA–/CP–) 和vBm-bacmid病毒感染的家蠶血液中，都能夠鑒定到NS1的表達(dá)，但它們的表達(dá)量有明顯的差異，在vBm-bacmid(ChiA–/CP–) 病毒感染的家蠶血液中，其靶蛋白NS1 (圖6泳道3)的表達(dá)量明顯多于對(duì)照組(圖6泳道2)。利用ELISA方法對(duì)家蠶血液中NS1蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)vBm-bacmid(ChiA–/CP–) 病毒感染的家蠶血液中，NS1蛋白濃度大約是對(duì)照組的3倍，該結(jié)果表明：以缺失幾丁質(zhì)酶和半胱氨酸蛋白酶基因的病毒為載體，能有效地提高BDV NS1的表達(dá)。

圖6 病毒感染的家蠶血液中NS1蛋白鑒定

3 討論

家蠶是我國(guó)一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的昆蟲(chóng)，主要以桑葉為食，只需要一些簡(jiǎn)單的設(shè)備就可對(duì)家蠶進(jìn)行大規(guī)模飼養(yǎng)，其生產(chǎn)的蠶絲是我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要組成部分，在改善民生和可持續(xù)發(fā)展中起著重要的作用。2009年已完成家蠶全基因組序列的測(cè)定和分析[13]，其遺傳背景清楚，飼養(yǎng)成本低廉，在家蠶體內(nèi)表達(dá)外源蛋白所需時(shí)間較短，容易對(duì)靶蛋白進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，是一種非常優(yōu)良的生物反應(yīng)器，也是實(shí)現(xiàn)基因工程產(chǎn)業(yè)化的理想載體。另外，Luckow 等和Possee等[14-15]建立了一種高效、快速的用來(lái)構(gòu)建重組病毒的篩選體系，剔除了多輪空斑篩選的繁瑣程序，提高重組病毒的陽(yáng)性得率，由此，極大地簡(jiǎn)化了家蠶重組桿狀病毒的構(gòu)建、分離、鑒定以及定量，由此使家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用得到了推廣。自1985年利用該系統(tǒng)首次成功表達(dá)人干擾素-α以來(lái)[1]，截止到目前為止，已通過(guò)BEVS在家蠶體內(nèi)成功地表達(dá)了乙型肝炎表面抗原、人酸性/堿性成細(xì)胞生長(zhǎng)因子、熒光素酶以及纖維素酶等上千種具有重要功能的重組蛋白[16-20]。

盡管BEVS系統(tǒng)有諸多優(yōu)勢(shì)以及技術(shù)上的不斷改進(jìn)，但在實(shí)踐中還是面臨著一些挑戰(zhàn)，比如在培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白，其生產(chǎn)成本較為昂貴[21]；其次，BEVS系統(tǒng)中缺乏有效的熒光信號(hào)，難以對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中是否產(chǎn)生感染性的重組病毒粒子作出快速判定，影響外源蛋白表達(dá)的進(jìn)程；最關(guān)鍵的是，與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，在BEVS中所表達(dá)的外源蛋白，其產(chǎn)量相對(duì)較低，尤其是感染后的細(xì)胞最終會(huì)裂解，致使靶蛋白的表達(dá)水平及其修飾還未達(dá)到最佳狀態(tài)[22]，這些不足之處在一定程度上都限制了BEVS系統(tǒng)的使用。

為優(yōu)化家蠶桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，本文對(duì)家蠶桿狀病毒穿梭載體上的一些序列進(jìn)行改造，通過(guò)同源重組技術(shù)，使串聯(lián)的Cm基因表達(dá)盒和表達(dá)盒成功地替換家蠶桿狀病毒載體中的和，通過(guò)熒光顯微觀察，證實(shí)這兩個(gè)基因的缺失并不影響家蠶桿狀病毒的增殖，可用作表達(dá)外源基因的分子載體；同時(shí)，在家蠶桿狀病毒載體中引入綠色熒光信號(hào)，也極大地簡(jiǎn)化了轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞中重組病毒粒子的鑒定，縮短了外源蛋白表達(dá)所需的時(shí)間。Lee等也曾構(gòu)建基因缺失的病毒，利用該缺失載體來(lái)構(gòu)建可表達(dá)纖維素酶的重組病毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在感染的家蠶幼蟲(chóng)中，纖維素酶的表達(dá)量提高了17%[23]；另外，通過(guò)抑制組織蛋白酶的表達(dá)，可提高綠色熒光蛋白3倍的表達(dá)量[24]。在本研究中，利用和基因同時(shí)缺失的Bm-bacmid為分子載體，缺失有效地提高了BDV NS1的表達(dá)產(chǎn)量。由此可知，通過(guò)缺失和基因，延長(zhǎng)病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞存活時(shí)間，抑制靶蛋白的降解，確實(shí)顯著地提高了的表達(dá)量，為NS1蛋白的功能與結(jié)構(gòu)研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為大規(guī)模表達(dá)其他功能蛋白提供參考。

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(本文責(zé)編陳宏宇)

Modified baculovirus system for high expression ofbidensovirus NS1 in silkworm

Guohui Li, Mangmang Li, Qian Zhou, Zhaoyang Hu, Qi Tang, and Qin Yao

Institute of Life Science, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu, China

To improve the expression of heterologous genes using baculovirus expression system, we constructed a novel shuttle vector based on the Bm-Bacmid. In the Bm-Bacmid, partial sequences ofandwere replaced with a tandem cassette of Cm andthrough homologous recombination.bidensovirus (BDV)under the control of polyhedrin promoter was inserted into the modified Bm-bacmid by transposition. For comparison,BDVunder the control of polyhedrin promoter was also cloned in the wild type Bm-bacmid. The resulting Bm-bacmids were transfected into the cultured BmN cells to prepare recombinant virus to infect silkworms for expression ofBDV. Total proteins of hemocyte from infected silkworms were subjected to Western blotting and ELISA analysis. The yield ofBDV NS1 with the modified vector was three times as much as that with the unmodified vector. The method to improve the yield ofBDV NS1 in silkworms will facilitate the function and three-dimensional structure study ofBDV NS1.

Bm-bacmid,bidensovirus, NS1

August 4, 2014; Accepted:September 29, 2014

Guohui Li. Tel: +86-511-88791702; E-mail: ghli@ujs.edu.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 31270192, 31272507, 31402016), Startup Scientific Research Fund from Jiangsu University (No. 09JDG057).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 31270192, 31272507, 31402016)，江蘇大學(xué)高級(jí)人才基金 (No. 09JDG057) 資助。