袁家代，陳貴英，程世君，葛方蘭，王瓊，李維，李江

?

3-甾酮-9α-羥基化酶基因在分枝桿菌中的異源表達(dá)與9α-羥基雄烯二酮的制備

袁家代*，陳貴英*，程世君，葛方蘭，王瓊，李維，李江

四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 610068

袁家代, 陳貴英, 程世君, 等. 3-甾酮-9α-羥基化酶基因在分枝桿菌中的異源表達(dá)與9α-羥基雄烯二酮的制備. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(4): 523–533.Yuan JD, Chen GY, Cheng SJ, et al. Accumulation of 9α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione by co-expressing kshA and kshBencoding component of 3-ketosteroid-9α-hydroxylase in Mycobacteriumsp. NRRL B-3805. Chin J Biotech, 2015, 31(4): 523–533.

9α-羥基雄烯二酮(9-OH-AD) 是制備甾體類藥物的重要中間產(chǎn)物。3-甾酮-9α-羥基化酶(KSH) 能夠轉(zhuǎn)化雄烯二酮(AD) 產(chǎn)生9α-羥基雄烯二酮(9-OH-AD)，該酶由KshA和KshB兩個亞基構(gòu)成。為獲得高效積累9-OH-AD的重組菌株，本研究選擇恥垢分枝桿菌mc2155和戈登氏菌NRRL B-59395，對其在膽固醇為唯一碳源條件下表達(dá)明顯上調(diào)的和候選基因進(jìn)行克隆，插入到分枝桿菌表達(dá)載體pNIT中，構(gòu)建共表達(dá)質(zhì)粒，并將它們導(dǎo)入分枝桿菌spNRRL B-3805中，獲得重組菌株。利用重組菌株分別對植物甾醇、膽固醇和谷甾醇進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，分離純化轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，采用光譜學(xué)方法鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，確定該轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為9α-羥基雄烯二酮，說明分枝桿菌spNRRL B-3805由積累雄烯二酮變?yōu)榉e累9α-羥基雄烯二酮(9-OH-AD)，進(jìn)而證明導(dǎo)入的候選基因和確實為有功能的基因。生物轉(zhuǎn)化實驗表明，與膽固醇、谷甾醇相比，植物甾醇作為底物更易于轉(zhuǎn)化；而用來源于恥垢分枝桿菌的、構(gòu)建的重組菌轉(zhuǎn)化率更高，可達(dá)90%，具有較高的應(yīng)用價值。本研究通過對KSH編碼基因的異源表達(dá)，成功地進(jìn)行了分枝桿菌生物轉(zhuǎn)化特性的改造，為探索各種甾體藥物中間體的工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

分枝桿菌NRRL B-3805，9α-羥基雄烯二酮，3-甾酮-9α-羥基化酶，異源表達(dá)，生物轉(zhuǎn)化

甾醇化合物又稱固醇，為細(xì)胞膜的重要組成成分，廣泛存在于動植物體內(nèi)，它們種類繁多，資源極為豐富，但多作為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的副產(chǎn)物而被廢棄，未能得到有效利用。從上世紀(jì)50年代以來，微生物降解植物甾醇和膽固醇而制備甾體藥物重要中間體的研究逐漸受到人們廣泛關(guān)注，微生物轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是取代傳統(tǒng)工業(yè)中化學(xué)分解方法生產(chǎn)甾體類藥物的重要途徑[1]。研究表明，甾醇化合物經(jīng)微生物細(xì)胞吸收進(jìn)入胞內(nèi)，通過類似β-氧化的循環(huán)途徑降解甾醇的側(cè)鏈，獲得雄烯二酮(AD)，后者經(jīng)過各種轉(zhuǎn)化修飾，可以進(jìn)一步合成睪酮、雌二醇、炔雌醇、睪酮內(nèi)酯、可的松、皮質(zhì)醇、潑尼松等多種重要的類固醇衍生物。但多數(shù)甾醇降解菌株如馬紅球菌、諾卡氏菌等能徹底分解甾醇化合物而無法積累上述甾體藥物中間體。

3-甾酮-9α-羥基化酶(KSH) 是甾體微生物轉(zhuǎn)化中的一個關(guān)鍵酶[2]，它可在AD(D) 多元環(huán)的第9位引入一個羥基(9α-OH)，將AD(D) 轉(zhuǎn)化為9-OH-AD(D)[3]。9-OH-AD在化學(xué)結(jié)構(gòu)上由于9α-羥基的存在，可利用化學(xué)方法形成C9,11-雙鍵體系，進(jìn)而在C9-位引入一個鹵族原子，同時在C11β-位上形成重要的功能羥基，該中間體可進(jìn)一步合成糖皮質(zhì)激素抗炎藥和高效含鹵 (氟，氯) 的皮質(zhì)激素。該工藝流程的實現(xiàn)可根本解決目前工業(yè)生產(chǎn)中存在的C11α-羥基化轉(zhuǎn)化率低、副產(chǎn)物多的問題，具有極高的商業(yè)價值[4]。

3-甾酮-9α-羥基化酶廣泛存在于甾醇化合物降解菌中，屬于單加氧酶IA家族，由編碼的Rieske型加氧酶和編碼的還原酶兩個亞基構(gòu)成[5]。2002年，van der Geize等首先對紅平紅球菌SQ1的3-甾酮-9α-羥基化酶編碼基因和進(jìn)行了分子鑒定[2]。2006年，Andor等發(fā)現(xiàn)了恥垢分枝桿菌mc2155中的基因并獲得異源表達(dá)[6]。2009年，Petrusma等在大腸桿菌中表達(dá)了來自紫紅紅球菌DSM 43269的和基因，并證明將來自NADH的還原力傳遞給，后者催化底物的羥基化反應(yīng)[7]。2009年，范書玥等對分枝桿菌sp. NwIB-01中的進(jìn)行了異源表達(dá)和表達(dá)蛋白的純化[8]。2011年，van der Geize所在課題組分析了存在于紫紅紅球菌DSM 43269基因組中的5個基因產(chǎn)物的酶學(xué) 特性[9]。

本研究在戈登氏菌NRRL B-59395和恥垢分枝桿菌mc2155的轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，克隆受膽固醇誘導(dǎo)的候選基因，構(gòu)建和基因共表達(dá)質(zhì)粒，將其導(dǎo)入甾醇轉(zhuǎn)化的模式菌-分枝桿菌spNRRL B-3805，構(gòu)建了和基因共表達(dá)的重組菌，并利用該重組菌轉(zhuǎn)化甾醇化合物，制備獲得了9-OH-AD。本研究成功利用基因工程手段對甾醇轉(zhuǎn)化模式菌株的3-甾酮-9α-羥基化酶基因進(jìn)行改造，為甾體藥物中間體9α-雄烯二酮的工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

戈登氏菌.NRRL B-59395為膽固醇高效降解菌，由本實驗室從肉食動物腸道中分離獲得[10]；恥垢分枝桿菌mc2155、大腸桿菌DH5α、分枝桿菌sp. NRRL B-3805，均保存于本實驗室。分枝桿菌表達(dá)質(zhì)粒pNIT由Christopher M. Sassettia教授 (University of Massachusetts Medical School) 構(gòu)建、西南大學(xué)謝建平教授轉(zhuǎn)贈。

1.2 培養(yǎng)基和主要試劑

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MgSO4?7H2O 0.25 g，NH4NO31.0 g，K2HPO40.25 g，F(xiàn)eSO4?7H2O 1.0 mg，酵母粉5 g，葡萄糖1 g，加水至1 000 mL，pH調(diào)為7.2。

大腸桿菌LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉10 g，加水至1 000 mL。

限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；卡那霉素購自Amresco公司。

1.3 DNA的常規(guī)操作方法

質(zhì)粒提取、DNA限制性酶切、DNA片段連接以及大腸桿菌的轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)常規(guī)操作方法參照分子克隆實驗指南[11]以及相關(guān)產(chǎn)品說明書。

1.4 總DNA的提取

戈登氏菌.NRRL B-59395和恥垢分枝桿菌mc2155的總DNA提取方法參照文獻(xiàn)[12]。

1.5 目的DNA片段的PCR擴(kuò)增

本研究所用引物如表1所示，由北京華大基因服務(wù)技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：模板1 μL，上下引物各0.5 μL，10×緩沖液5 μL，酶0.6 μL，MgCl23 μL，加水補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min，擴(kuò)增反應(yīng)36個循環(huán) (94 ℃變性50 s，52 ℃復(fù)性50 s，72 ℃延伸1 min)，72 ℃保溫10 min。

1.6 分枝桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制作

分枝桿菌sp. NRRL B-3805電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制作參照文獻(xiàn)[13]。

1.7 分枝桿菌的電轉(zhuǎn)化

取100 μL分枝桿菌sp. NRRL B-3805感受態(tài)細(xì)胞與2 μL重組質(zhì)?；靹?，冰上放置30 min，吸取感受態(tài)細(xì)胞與質(zhì)粒混合液垂直加入電轉(zhuǎn)杯中，設(shè)定電壓為2 500 V進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，吸出轉(zhuǎn)化混合液，加入500 μL液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于30 ℃、180 r/min條件下恢復(fù)培養(yǎng)3 h后，5 000 r/min離心2 min，倒掉培養(yǎng)液，用100 μL無菌水重懸細(xì)胞，將其涂布于含20 μg/mL卡那霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)8–10 d，統(tǒng)計菌落數(shù)。挑取平板上長出的抗性單菌落進(jìn)行PCR快速鑒定[14]。

1.8 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)的鑒定

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)分離純化后，采用13C NMR、1H NMR、高分辨質(zhì)譜、紅外光譜進(jìn)行分析，鑒定其結(jié)構(gòu)，得到的波譜數(shù)據(jù)如下：TOF-MS m/z 303 [M+H]+；IR vmax(cm–1)：3304,1735,1655；13C NMR (CDCl3,400 MHz)δ：29.2(C-1)，33.4(C-2)，180.36(C-3)，125.1(C-4)，172.0(C-5)，31.6(C-6)，23.0(C-7)，35.8(C-8)，76.1(C-9)，37.1(C-10)，26.8(C-11)，28.2(C-12)，44.2(C-13)，42.0(C-14)，21.1(C-15)，35.3(C-16)，200.8(C-17)，11.8(C-18)，18.9(C-19)。1H NMR (CDCl3) 0.93(3H,s,H-18)，1.38(3H,s,H-19)，2.03 (1H,ddd,H-8)，6.05 (1H,s,H-4)。

表1 本研究中所用引物

1.9 甾醇的生物轉(zhuǎn)化及定量分析

將重組菌株接種于100 mL分別含植物甾醇、膽固醇、谷甾醇 (0.5 g/L) 的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中 (加入0.05% Tween-80乳化底物)，于30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌液600約為0.8時加入己內(nèi)酰胺 (終濃度為28 mmol/L)，誘導(dǎo)表達(dá)24 h[15]。每隔12 h取樣，乙酸乙酯振蕩萃取，薄層層析檢測，展層劑為環(huán)己烷：乙酸乙酯=6∶4。將萃取樣品真空干燥后，甲醇溶解，用于HPLC分析，計算其轉(zhuǎn)化率[16]。采用島津Essentia LC-15C高效液相色譜儀進(jìn)行HPLC分析；色譜柱為島津WondaSil C18色譜柱 (4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，檢測波長 254 nm，流動相為甲醇∶水=65∶35，流速： 1 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL。轉(zhuǎn)化率計算方法為：轉(zhuǎn)化率=(9-OH-AD產(chǎn)生量/底物量)×100%。

1.10 重組分枝桿菌穩(wěn)定性分析

將重組菌株接種于50 mL液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，分別于48、96、144 h吸取菌液，用無菌水稀釋，濃度梯度為10–3、10–4、10–5，分別涂布于不含卡那霉素和含20 μg/mL卡那霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d，對單菌落數(shù)進(jìn)行計數(shù)[1]。

2 結(jié)果與分析

2.1 3-甾酮-9α-羥基化酶候選基因轉(zhuǎn)錄與同源性分析

對恥垢分枝桿菌mc2155基因組進(jìn)行搜索，結(jié)果顯示和為候選基因和為候選基因；而戈登氏菌NRRL B-59395基因組中存在著3個候選基因，分別是；同時有2個候選基因，它們分別是。在前期研究中，我們分別對恥垢分枝桿菌和戈登氏菌在不同甾醇化合物為唯一碳源條件下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測序 (該研究結(jié)果另文報道)，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明恥垢分枝桿菌mc2155的2個候選基因中，在3種碳源條件下表達(dá)量均相對較高，RPKM值為分別為101.47、288.50、100.33，而且該基因在膽固醇條件下表達(dá)明顯上調(diào)，如表2所示；其兩個候選基因表達(dá)量均較低，其中在膽固醇條件下表達(dá)上調(diào)。戈登氏菌NRRL B-59395轉(zhuǎn)錄組測序表明，候選基因和的表達(dá)均受到膽固醇的誘導(dǎo)，其中表達(dá)量較高，RPKM值為214.60；候選基因在雄烯二酮條件下表達(dá)上調(diào)。綜合上述分析，我們推測差異表達(dá)的候選基因、參與了甾醇化合物的羥基化，因此對其進(jìn)行克隆并用于重組菌株的構(gòu)建。

表2 恥垢分枝桿菌與戈登氏菌3-甾酮-9α-羥基化酶編碼基因及其轉(zhuǎn)錄水平分析

RPKM: reads per kilobase of coding sequence, per million mapped reads.

氨基酸同源性分析表明恥垢分枝桿菌mc2155中的與結(jié)核分枝桿菌H37RV的KshA[17]編碼基因在氨基酸水平的同源性高達(dá)82%，同紅平紅球菌SQ1中KshA[2]同源性為61%，同紫紅紅球菌DSM 43269中的KshA[7]同源性為58%。與結(jié)核分枝桿菌H37RV編碼KshB的基因在氨基酸水平的同源性為73%，同紅平紅球菌SQ1中KshB[2]的氨基酸同源性為60%，同紫紅紅球菌DSM 43269中的KshB同源性為58%。

戈登氏菌NRRL B-59395中的同結(jié)核分枝桿菌H37RV的() 基因在氨基酸水平的同源性達(dá)到53%，同紅平紅球菌SQ1中KshA[2]的氨基酸同源性為61%，與紫紅紅球菌DSM 43269中KshA[6]同源性為55%。與結(jié)核分枝桿菌H37RV編碼KshB的在氨基酸水平的同源性達(dá)到52%，與紅平紅球菌SQ1中的KshB[2]同源性為64%，同紫紅紅球菌DSM 43269中的KshB[7]同源性為65%。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

構(gòu)建的共表達(dá)質(zhì)粒圖譜如圖1所示。以恥垢分枝桿菌mc2155總DNA為模板，分別用引物-F/R和-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段(大小為1 151 bp) 和(大小為1 061 bp)，如圖2A泳道1、2所示。用Ⅰ/RⅠ雙酶切DNA片段，將其插入經(jīng)過同樣酶切處理的表達(dá)載體pNIT中，獲得的中間質(zhì)粒再經(jīng)RⅠ/d Ⅲ雙酶切，與經(jīng)過同樣酶切處理的連接，從而與融合，獲得含有和融合基因的表達(dá)質(zhì)粒，命名為 pNIT-Mksh (圖1A)。

同時，以戈登氏菌NRRL B-59395的總DNA為模板，用引物-F/R和-F/R分別擴(kuò)增得到DNA片段(圖2B泳道1，1 170 bp) 和(圖2B泳道2，1 056 bp)。經(jīng)Ⅰ/HⅠ雙酶切將重組入pNIT載體，獲得的中間質(zhì)粒再經(jīng)HⅠ/d Ⅲ雙酶切，與經(jīng)過同樣酶切的DNA片段連接，獲得含有和融合的表達(dá)質(zhì)粒，命名為pNIT-Gksh (圖1B)。

用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和d Ⅲ對兩重組質(zhì)粒pNIT-Mksh和pNIT-Gksh分別進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖電泳顯示，pNIT-Mksh經(jīng)雙酶切產(chǎn)生兩條DNA條帶 (圖2A泳道4)，其中較大的條帶大小為6 261 bp，與原載體pNIT相符，大小約為2 kb的DNA條帶是、融合片段。圖2B泳道4為pNIT-Gksh雙酶切的結(jié)果，產(chǎn)生的條帶為融合片段(2 226 bp) 和原載體pNIT (6 261 bp)，同樣與預(yù)期相符。

圖1 表達(dá)質(zhì)粒pNIT-Mksh和pNIT-Gksh示意圖

圖2 共表達(dá)重組質(zhì)粒瓊脂糖電泳分析

采用電轉(zhuǎn)化方法將上述表達(dá)質(zhì)粒分別導(dǎo)入分枝桿菌sp. NRRL B-3805感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，陽性菌落即為構(gòu)建的基因重組菌株。質(zhì)粒pNIT-Mksh電轉(zhuǎn)入分枝桿菌sp. NRRL B-3805得到的重組菌株命名為3805-Mksh，質(zhì)粒pNIT-Gksh電轉(zhuǎn)入分枝桿菌sp. NRRL B-3805得到的重組菌株命名為3805-Gksh。

2.3 重組菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的鑒定

分別利用原始菌株和重組菌株對膽固醇、植物甾醇和谷甾醇進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，用薄層層析 (圖3A) 和HPLC (圖3B) 檢測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的變化。原始菌株分枝桿菌sp. NRRL B-3805轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是大量AD和極少量ADD (圖3A泳道1，圖3B曲線c)，而導(dǎo)入-共表達(dá)質(zhì)粒的重組菌株的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中，AD產(chǎn)量變低甚至消失，并產(chǎn)生了新的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 (圖3A泳道7–12，圖3B曲線a)。圖3B (曲線a、c) 還顯示，原始菌株sp. NRRL B-3805和重組菌株的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中除目的產(chǎn)物外均含有少量副產(chǎn)物或雜質(zhì)，但并未對其做進(jìn)一步分析和鑒定。從薄層層析板上刮取產(chǎn)物，乙酸乙酯萃取，減壓蒸餾，獲得純化的樣品，進(jìn)行光譜學(xué)分析以鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。紅外光譜出現(xiàn)了數(shù)值為3 304的吸收峰，說明轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中含有羥基基團(tuán)；TOF-MS譜顯示其[M+H]+處于m/z 303，說明該產(chǎn)物分子量為302，與9-OH-AD的分子質(zhì)量302.4相符合；對比AD的13C NMR譜，C9的吸收峰值從δ53.8 ppm位置化學(xué)位移到δ76.1 ppm，驗證了C9出現(xiàn)1個羥基基團(tuán)，這與文獻(xiàn)[18]報道的相符。1H NMR光譜分析表明存在兩個甲基基團(tuán)，其δ值分別為0.93(s) 和 1.35(s) ppm，6.05(d) ppm表示存在1個雙鍵；未出現(xiàn)δ3.5–4.5范圍的化學(xué)位移，推測羥基應(yīng)該存在于一個三級碳原子上，這與Horinouchi等的報道一致[19]，確定該基團(tuán)應(yīng)存在于9α-位上。因此重組菌株轉(zhuǎn)化甾醇底物獲得產(chǎn)物9-OH-AD，證明導(dǎo)入的基因成功表達(dá)出了有活性的KSH，重組菌株直接將膽固醇、植物甾醇和谷甾醇轉(zhuǎn)化為9-OH-AD。

圖3 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的薄層層析(A) 和HPLC (B)分析

2.4 重組菌株對不同底物的轉(zhuǎn)化

分別以植物甾醇、膽固醇、谷甾醇為底物，利用構(gòu)建的重組菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，取樣，HPLC檢測，結(jié)果表明，重組菌株轉(zhuǎn)化36 h時，3種不同底物的轉(zhuǎn)化液中均開始積累9-OH-AD。菌株3805-Mksh在轉(zhuǎn)化108 h時，以植物甾醇或以膽固醇為底物的培養(yǎng)液中，9-OH-AD積累量達(dá)到最大，分別為453.1 μg/mL和34 μg/mL。其中，植物甾醇的最高轉(zhuǎn)化率達(dá)到了90.6% (圖4A)；而以谷甾醇為底物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化120 h后，培養(yǎng)液中9-OH-AD積累量達(dá)到最高，為183.3 μg/mL。隨著轉(zhuǎn)化時間的延長，9-OH-AD積累量逐漸降低。

圖4 菌株3805-Mksh (A) 和3805-Gksh (B) 對幾種底物的轉(zhuǎn)化

重組菌3805-Gksh以植物甾醇或谷甾醇為底物轉(zhuǎn)化，9-OH-AD最大積累量出現(xiàn)在108 h，達(dá)到335 μg/mL、296 μg/mL；而以膽固醇為底物轉(zhuǎn)化，則出現(xiàn)在120 h，達(dá)到225.7 μg/mL，底物的最大轉(zhuǎn)化率為67% (圖4B)。其9-OH-AD積累量同樣隨著轉(zhuǎn)化時間延長而降低。

2.5 重組分枝桿菌穩(wěn)定性分析

選取轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)的重組分枝桿菌3805-Mksh進(jìn)行質(zhì)粒穩(wěn)定性分析，結(jié)果如表3所示，經(jīng)過144 h的發(fā)酵培養(yǎng)，含有質(zhì)粒的菌落由98.97%降到了85%，因而隨著培養(yǎng)時間的延長，質(zhì)粒穩(wěn)定性略有下降，但總體穩(wěn)定性良好。

表3 重組分枝桿菌3805-Mksh的質(zhì)粒穩(wěn)定性分析

3 討論

KSH為雙組分酶，由KshA和KshB組成。KshA是9α-羥基化起主體作用的酶，而KshB為鐵氧還蛋白還原酶，對KshA起還原和電子循環(huán)傳遞作用。目前，僅有恥垢分枝桿菌mc2155的、紅平紅球菌SQ1的和，來自紫紅紅球菌DSM 43269的和[20]以及分枝桿菌sp. NwIB-01中的獲得了功能驗證。我們依據(jù)基因在膽固醇條件下基因表達(dá)上調(diào)的情況，從恥垢分枝桿菌mc2155的2個候選基因和2個候選基因中選擇了(候選基因)、(候選基因) 進(jìn)行克隆并用于基因重組菌的構(gòu)建；從戈登氏菌NRRL B-59395 基因組的3個候選基因、2個候選基因中，選擇了(候選基因)(候選基因) 進(jìn)行克隆并用于基因重組菌的構(gòu)建。

為了實現(xiàn)和的共表達(dá)和增加翻譯效率，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時，在基因上游引物中設(shè)計了核糖體結(jié)合位點SD序列和間隔序列(CGGAGGAATCACTTCGCA)，依次將和克隆到分枝桿菌表達(dá)質(zhì)粒pNIT中時，從而在兩個基因之間引入了核糖體結(jié)合位點序列(SD) 和間隔序列。分枝桿菌sp. NRRL B-3805是研究甾醇微生物轉(zhuǎn)化的模式菌，能夠轉(zhuǎn)化膽固醇、植物甾醇積累大量雄烯二酮和少量雄二烯二酮。將和的共表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入分枝桿菌sp. NRRL B-3805，構(gòu)建重組菌株，利用該重組菌株轉(zhuǎn)化膽固醇、植物甾醇和谷甾醇，進(jìn)而誘導(dǎo)和進(jìn)行表達(dá)，但可能由于表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)過低，表達(dá)量較少，因而在蛋白質(zhì)電泳中并未檢測到目的蛋白質(zhì)條帶，但是通過分離純化轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，進(jìn)行光譜學(xué)鑒定，確定該轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為9α-羥基雄烯二酮，可表明導(dǎo)入的和獲得了有效表達(dá)，從而證明將出發(fā)菌株積累的雄烯二酮轉(zhuǎn)化為9α-羥基雄烯二酮。同時也證明了來自恥垢分枝桿菌的、和戈登氏菌的分別為有功能的和編碼基因。

各重組菌株分別以3種甾醇化合物為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，以植物甾醇為底物較膽固醇和谷甾醇的轉(zhuǎn)化率要高；利用重組分枝桿菌 3805-Mksh以植物甾醇為底物轉(zhuǎn)化時，轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到90.6%，而重組分枝桿菌 3805-Gksh最大轉(zhuǎn)化率僅為67%，顯示來自來恥垢分枝桿菌mc2155的和基因產(chǎn)物具有更高的羥基化活性。

在生物轉(zhuǎn)化的過程中，9-OH-AD會隨著轉(zhuǎn)化時間的延長而降解，其可能的原因是分枝桿菌sp. NRRL B-3805大量積累AD的同時，也能產(chǎn)生少量的ADD，說明其細(xì)胞中仍有少量的類固醇脫氫酶 (3-ketosteroid D1-dehydrogenase, KsdD) 活性，將AD轉(zhuǎn)變ADD，ADD在羥基化酶的催化作用下，打開核心環(huán)，從而進(jìn)一步被降解，因而9-OH-AD會隨著轉(zhuǎn)化時間的延長而減少。因此，要進(jìn)一步提高9-OH-AD產(chǎn)率，需要敲除基因，消除其脫氫酶活性。本研究在甾醇化合物轉(zhuǎn)化模式菌株中實現(xiàn)了3-甾酮-9α-羥基化酶基因共表達(dá)，使其由積累AD變?yōu)榉e累9-OH-AD，因而成功地進(jìn)行了分枝桿菌生物轉(zhuǎn)化特性的改造，為探索各種甾體藥物中間體的工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1] Wei W, Fan SY, Wang FQ, et al. Accumulation of androstadiene-dione by overexpression of heterologous 3-ketosteroid Δ1-dehydrogenase inNwIB-01. World J Microbiol Biotechnol, 2014, 30(7): 1947?1954.

[2] van der Geize R, Hessels GI, Van Gerwen R, et al.Molecular and functional characterization of kshA and kshB, encoding two components of 3-ketosteroid-9α-hydroxylase, a class IA monooxygenase, instrain SQ1. Mol Microbiol, 2002, 45(4): 1007–1018.

[3] Sukhodolskaya GV, Nikolayeva VM, Khomutov SM, et al. Steroid-1-dehydrogenase ofsp. VKM-Ac-1817D strain producing 9α-hydroxy- androst-4-ene-3,17-dione from sitosterol.Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 74(4): 867–873.

[4] Yang SK, Yang YL, Wu ZL, et al. Microbial fermentation of phytosterol side chain cleaved for production of 17-keto steroids. Chin J Bioproc Eng, 2010, 8(5): 69–77 (in Chinese).楊順楷, 楊亞力, 吳中柳, 等. 微生物發(fā)酵降解植物甾醇側(cè)鏈生產(chǎn)17-酮甾體研究進(jìn)展. 生物加工過程, 2010, 8(5): 69–77.

[5] Hu Y, van der Geize R, Besra GS, et al. 3-ketosteroid 9α-hydroxylase is an essential factor in the pathogenesis of. Mol Microbial, 2010, 75(5): 107–121.

[6] Andor A, Jekkel A, Hopwood DA, et al. Generation of useful insertionally blocked sterol degradation pathway mutants of fast-growing mycobacteria and cloning, characterization, and expression of the terminal oxygenase of the 3-ketosteroid 9α-hydroxylase inmc2155. Appl Environ Microbiol, 2006, 72(10): 6554–6559.

[7] Petrusma M, Dijkhuizen L, van der Geize R.DSM 43269 3-ketosteroid- 9α-hydroxylase, a two-component iron-sulfur-containing monooxygenase with subtle steroid substrate specificity. Appl Environ Microbiol, 2009, 75(16): 5300–5307.

[8] Fan SY, Wei W, Wang FQ, et al. Cloning, heterologous expression and purification of a 3-ketosteroid-9α-hydroxylase (KSH) fromsp. NwIB-01. Chin J Biotech, 2009, 25(12): 2014–2021 (in Chinese).范書玥, 魏巍, 王風(fēng)清, 等. 分枝桿菌sp. NwIB-01 3-甾酮-9α-羥基化酶基因的克隆、異源表達(dá)及分離純化. 生物工程學(xué)報, 2009, 25(12): 2014–2021.

[9] Mirjan P, Gerda H, Lubbert D, et al.Multiplicity of 3-ketosteroid-9α-hydroxylase enzymes in Rhodococcus rhodochrous DSM 43269 for specific degradation of different classes of steroids. J Bacteriol, 2011, 193(15): 3931–3940.

[10] Liu YC, Chen GY, Li W, et al. Efficient biotransformation of cholesterol to androsta-1,4-diene-3,17-dione by a newly isolated actinomycete. World J Microbiol Biotechnol, 2011, 27(4): 759–765.

[11] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 20–25.

[12] Liu YC, Ge F, Li W, et al.sp. nov., a cholesterol side-chain-cleaving actinomycete isolated from the faeces of Neofelis nebulosa. Internat J System Evolut Microbiol, 2011, 61(1): 1–5.

[13] Veiga-Crespo P, Feijoo-Siota L, de Miguel T, et al. Proposal of a method for the genetic transformation of. J Appl Microbiol, 2006, 100(3): 608–614.

[14] Daniel B, Matthias A, Alexander S. Transfer of megaplasmid pKB1 from the rubber-degrading bacteriumstrain Kb1 to related bacteria and its modification. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 77(6): 1317–1327.

[15] Chen T, Zhao QJ, Li W, et al.PE_PGRS17 promotes the death of host cell and cytokines secretion via Erk kinase accompanying with enhanced survival of recombinant. J Interf Cytok Res, 2013, 33 (8): 452–458.

[16] Wei W, Fan SY, Wang FQ, et al. A new steroid-transforming strain ofand cloning of 3-ketosteroid 9α-hydroxylase in NwIB-01. Appl Biochem Biotechnol, 2010, 162(5): 1446–1456.

[17] Capyk J K, Angelo I D, et al. Characterization of 3-ketosteroid- 9α-hydroxylase, a rieske oxygenase in the cholesterol degradation pathway of. J Biol Chem, 2009, 284(15): 9937–9946.

[18] Mohammad AF, Maryam A, Mojtaba TY. Metabolism of androst-4-en-3,17-dione by the filamentous fungus. Steroids, 2008, 73 (1): 13–18.

[19] Horinouchi M, Hayashi T, Yamamoto T, et al. A new bacterial steroid degradation gene cluster in comamonas testosteroni TA441 which consists of aromatic-compound degradation genes for seco-steroids and 3-ketosteroid dehydrogenase genes. Appl Environ Microbiol, 2003, 69 (8): 4421–4430.

[20] Wilbrink MH, Petrusma M, Dijkhuizen L, et al. FadD19 ofDSM43269, a steroid-coenzyme ligase essential for degradation of C-24 branched sterol side chains. Appl Environ Microbiol, 2011, 77(13): 4455–4464.

(本文責(zé)編陳宏宇)

Accumulation of 9α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione by co-expressingandencoding component of 3-ketosteroid-9α-hydroxylase inspNRRL B-3805

Jiadai Yuan*, Guiying Chen*, Shijun Cheng, Fanglan Ge, Wang Qiong, Wei Li, and Jiang Li

College of Life Sciences, Sichuan Normal University, Chengdu 610068, Sichuan, China

9α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione (9-OH-AD) is an important intermediate in the steroidal drugs production. 3-ketosteroid-9α-hydroxylase (KSH), a two protein system of KshA and KshB, is a key-enzyme in the microbial steroid ring B-opening pathway. KSH catalyzes the transformation of 4-androstene-3,17-dione (AD) into 9-OH-AD specifically. In the present study, the putative KshA and KshB genes were cloned frommc2155 andNRRL B-59395 respectively, and were inserted into the expression vector pNIT, the co-expression plasmids ofwere obtained and electroporated intosp. NRRL B-3805 cells. The recombinants were used to transform steroids, the main product was characterized as 9α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione (9-OH-AD), showing thatandwere expressed successfully. Different from the original strainspNRRL B-3805 that accumulates 4-androstene-3,17-dione, the recombinants accumulates 9α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione as the main product. This results indicates that the putative genes,encode active KshA and KshB, respectively. The process of biotransformation was investigated and the results show that phytosterol is the most suitable substrate for biotransformation,andfrommc2155seemed to exhibit high activity,becausethe resultant recombinant of them catalyzed the biotransformation of phytosterol to 9-OH-AD in a percent conversion of 90%, which was much higher than that ofNRRL B-59395. This study on the manipulation of thegenes insp. NRRL B-3805 provides a new pathway for producing steroid medicines.

sp. NRRL B-3805, 9α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione, 3-ketosteroid-9α-hydroxylase, heterologous expression, biotransforamtion

August 12, 2014; Accepted:November 15, 2014

Wei Li. Tel: +86-28-84480654; E-mail: weelee201@aliyun.com

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31271332), Sichuan Provincial Science & Technology Department (Nos. 2009JY0067, 2012SZ0074), Sichuan Provincial Department of Education (No. 13ZA0145), Sichuan Normal University (No. 2013-12).

國家自然科學(xué)基金 (No. 31271332)，四川省科技廳項目 (Nos. 2009JY0067, 2012SZ0074)，四川省教育廳項目(No. 13ZA0145)，四川師范大學(xué)校級重點科研基金(No. 2013-12) 資助。

*These authors contributed equally to this study.