楊磊，劉天慶，范曉光，王菲，李政

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聚N-異丙基丙烯酰胺細胞培養(yǎng)平臺的研究進展

楊磊1，劉天慶2，范曉光3，王菲1，李政1

1 遼寧石油化工大學環(huán)境與生物工程學院，遼寧撫順 113001 2 大連理工大學大連市干細胞與組織工程研發(fā)中心，遼寧大連 116024 3 中國石油撫順石化分公司，遼寧撫順 113008

楊磊，劉天慶，范曉光，等. 聚N-異丙基丙烯酰胺細胞培養(yǎng)平臺的研究進展. 生物工程學報, 2015, 31(2): 172-182.Yang L, Liu TQ, Fan XG, et al. Advances in poly (N-isopropylacrylamide) based platforms for cell culture. Chin J Biotech, 2015, 31(2): 172-182.

聚N-異丙基丙烯酰胺 (poly(N-isopropylacrylamide), PNIPAAm)，溫敏性聚合物，可利用其溫敏特性替代酶類物質(zhì)或細胞刮刀用于貼壁細胞的收獲，從而有效避免酶解和機械損傷，可為生物醫(yī)藥領域提供品質(zhì)優(yōu)良的種子細胞。重點闡述促進細胞有效粘附和快速脫附的溫敏性PNIPAAm二維平面的研發(fā)情況，包括選取特殊基材、引入親水基團、調(diào)節(jié)反應物比率、控制聚合物厚度/密度、提供適宜外力等方式，從而有效改善細胞對溫敏性平面的適應性并降低染菌風險以及減少低溫處理對細胞的影響。同時介紹PNIPAAm微載體、支架和凝膠等溫敏性三維培養(yǎng)介質(zhì)的研究進展，此方式不僅增加細胞生長面積，更可以模擬體內(nèi)微環(huán)境，從而保持細胞原始生理特征，同時實現(xiàn)大規(guī)模擴增和非酶解收獲細胞以及組織器官修復和重構的目標。最后簡單說明PNIPAAm培養(yǎng)平臺的應用，PNIPAAm的研發(fā)為再生醫(yī)學的發(fā)展提供了嶄新思路。

聚N-異丙基丙烯酰胺，溫敏性聚合物，細胞培養(yǎng)介質(zhì)，干細胞，細胞片層工程

在材料表面良好粘附對體外培養(yǎng)的貼壁細胞十分重要，將影響其遷移、增殖、分化等生理活動，同時從培養(yǎng)基底有效脫附也是細胞繁衍后代和維持性狀的必要過程。目前常用的細胞回收方式包括酶解法和機械法，但此二法均在某種程度損傷膜蛋白致使細胞功能缺失。為了向生物醫(yī)藥領域提供品質(zhì)優(yōu)良的種子細胞，有必要采用非酶解非機械方式將細胞與培養(yǎng)表面分離。研究表明溫敏型聚合物PNIPAAm可有效替代傳統(tǒng)方法進行細胞回收，主要利用其自身具有隨溫度變化而呈現(xiàn)表面和整體性質(zhì)轉換的特性來控制細胞粘附抑或脫附。采用此種收獲方式，細胞伴隨完整膜蛋白和粘附蛋白共同脫離，同時細胞間連接蛋白也未遭受破壞。因此，運用PNIPAAm的降溫回收法與傳統(tǒng)收獲方法相比，能夠保持細胞更強的生長特性或分化潛能。本文將綜述近年來以PNIPAAm為主體的溫敏性二維、三維細胞培養(yǎng)平臺的研發(fā)及應用情況。

1 溫敏性PNIPAAm二維平面

20世紀90年代初，日本學者Okano團隊[1]首次將PNIPAAm用于細胞培養(yǎng)和收獲過程。他們采用電子束照射的方式將NIPAAm單體聚合接枝于聚苯乙烯培養(yǎng)皿，使材料表面具有溫敏特性，當溫度高于最低臨界溶液溫度 (Lower critical solution temperature, LCST) 時其表面呈現(xiàn)疏水性，而溫度降低時則轉化為親水性，接種于此智能表面的細胞僅通過變溫調(diào)節(jié)就可控制其粘附生長或脫附回收。至此開創(chuàng)了溫敏性材料用于細胞培養(yǎng)的新紀元。我們采用自由基聚合法以NIPAAm、甲基丙烯酸羥丙酯 (HPM) 和甲基丙烯酸 (3-三甲氧基硅) 丙酯 (TMSPM) 為原料合成了P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物，然后采用旋轉涂膜法和真空退火法在蓋玻片上形成共聚物膜，并且成功地將它們應用于細胞的培養(yǎng)和非酶解收獲過程[2-3]。

早期研究表明雖然溫敏性培養(yǎng)介質(zhì)可實現(xiàn)貼壁細胞的自發(fā)脫附，但由于細胞完全覆蓋基底表面，使PNIPAAm類材料在降溫處理過程只能從邊緣向中心區(qū)域逐步發(fā)生水合作用，導致細胞完全脫附達數(shù)小時之久，這一方面增加了細胞染菌的風險，另一方面難以評估長時間暴露于低溫環(huán)境對細胞造成的影響。因此，研究人員努力尋求促進細胞有效粘附和快速脫附的溫敏性PNIPAAm二維平面。

1.1 選取特殊基材

將PNIPAAm接枝或涂覆于特殊基材表面，如親水性的聚合物層或通透性良好的多孔膜，可使降溫溶液在基材邊緣和底部同步滲透，加速PNIPAAm的水合作用，從而促進細胞的快速脫附。Akiyama等[4]在PNIPAAm與培養(yǎng)板之間引入親水性聚丙烯酰胺，降溫過程中間層的快速水合加速了細胞或細胞片層的脫附速率。Kwon等[5]采用聚 (對苯二甲酸乙二醇酯) 多孔膜作為PNIPAAm接枝的基底材料，結果表明無論分散細胞還是細胞片層從溫敏性多孔膜完全脫附的時間均少于從純PNIPAAm表面分離的時間。Oh等[6]將PNIPAAm接枝于聚苯乙烯納米纖維墊，結果表明人成纖維細胞在其上的脫附速率遠大于在PNIPAAm接枝聚苯乙烯培養(yǎng)皿的速率。

1.2 引入親水基團

親水性物質(zhì)的加入可促使溫敏性材料降溫過程的快速水合從而減少細胞完全脫附的時間，同時引入親水鏈段會提升溫敏性聚合物的LSCT，因此無需過度降溫就可達到優(yōu)越的細胞脫附效果。Ebara等[7]在PNIPAAm合成過程引入2-羧基異丙基丙烯酰胺，用于牛主動脈內(nèi)皮細胞的快速脫附，結果顯示在20 ℃絕大部分細胞在60 min內(nèi)從共聚物表面脫離，而粘附在純PNIPAAm表面上的細胞僅處于起始脫附階段。Liu等[8]考察L929細胞在PNIPAAm-聚乙二醇 (PEG) 納米復合水凝膠上的生長和脫附情況，結果表明細胞在溫敏性水凝膠上增殖狀態(tài)良好并未受到親水組分的影響，且在降溫處理時展現(xiàn)快速的脫附能力。Kim等[9]將高度吸濕性聚合物聚 (2-羥乙基甲基丙烯酸酯) (PHEMA) 和PNIPAAm共同接枝于細胞培養(yǎng)板，并與常規(guī)PNIPAAm接枝培養(yǎng)板比較，結果表明細胞從PHEMA-PNIPAAm接枝培養(yǎng)板全部脫附時間僅為13 min，而對照組則需75 min。Wang等[10]將NIPAAm、丙烯酸和殼聚糖合成新型的溫敏性凝膠，殼聚糖的加入可促進細胞粘附，而丙烯酸的引入則加快細胞的脫附速率。上述結果證實溫敏性終產(chǎn)物中的羥基、羧基、酯基等基團確為細胞的快速脫附提供了良好的親水環(huán)境。我們同樣在聚合物制備過程引入親水性HPM成分，結果表明不同類型細胞均可在10 min內(nèi)從各自適宜的P(NIPAAm-co-HPM-co- TMSPM) 共聚物膜完全脫附。

1.3 調(diào)節(jié)反應物比率

生物材料的化學組成會影響其結構和性質(zhì)，如表面潤濕性、粗糙度、溶脹性能、機械強度等，從而波及細胞各項生理活動。PNIPAAm與功能成分 (如親水性、促粘附、帶電荷物質(zhì)等) 之間的比例，以及材料整體呈現(xiàn)的電荷極性、密度和LCST等參數(shù)均會影響細胞的粘附和脫附，所以需要通過系列實驗來確定最佳反應物混合比率。Ohya等[11]制備具有不同接枝密度的PNIPAAm-明膠水凝膠，用于確定最佳反應物混合比率 (P/G)。人臍帶血靜脈上皮細胞可粘附和鋪展于具有較高P/G的水凝膠，因為此水凝膠表面更為粗糙且具備較高的機械強度，同時互穿微孔可促進營養(yǎng)物質(zhì)的擴散。Kong等[12]考察PNIPAAm與親水性[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基]-二甲基(3-硫代丙基)氫氧化銨內(nèi)鹽的比例對NIH3T3細胞粘附和脫附的影響，結果證明最優(yōu)反應物配比為75∶1。Liu等[13]將NIPAAm和帶電單體合成納米復合凝膠。結果表明L929細胞的增殖與電荷極性和密度相關，含有小于5%甲基丙烯酸-N,N-二甲胺基乙酯的陽離子凝膠可促進細胞增殖，而含有2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸鈉的陰離子凝膠相對抑制細胞生長；降溫處理后，細胞可從含有1%離子單體的復合凝膠快速脫附，但更高單體含量制備的表面卻不再支持細胞的快速脫附，這可能是溶脹效果不佳或靜電吸引增強所致。

我們研究的最終目的是制備溫敏性聚合物膜，實現(xiàn)貼壁細胞在其上的粘附和降溫脫附。選用聚合-涂覆二步成膜方案，合成的終產(chǎn)物作為聚合物膜的前體，其組分的選擇和比例的控制都要利于溫敏性聚合物膜的制備和性能的調(diào)節(jié)。分別選取NIPAAm、TMSPM和HPM三種雙鍵類單體，采用自由基聚合法將三者合成新型的P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM) 共聚物。圖1展示了共聚物分子結構中的功能基團和反應基團[14]。

NIPAAm作為主體反應物，在終產(chǎn)物中占用足夠比例，可有效維持PNIPAAm的溫敏特性，酰胺鍵和異丙基鍵作為共聚物膜的功能基團 (實線標注)，用以實現(xiàn)細胞在其上的有效粘附和降溫脫附，所以選取90%的摩爾比例。TMSPM作為硅烷交聯(lián)劑，在共聚物合成過程相對穩(wěn)定，但在高熱或輻照條件下可創(chuàng)建共聚物與含有羥基基團的鏈接，TMSPM的添加量一般為5%。HPM組分可為共聚物分子鏈間的鍵合提供羥基。硅氧烷鍵和羥基作為共聚物中的反應基團 (虛線標注)，在共聚物膜形成過程中，TMSPM既可與基底的羥基發(fā)生脫甲醇反應，又可與自身或其他分子鏈的羥基產(chǎn)生鍵合，從而實現(xiàn)共聚物與共聚物之間，共聚物與基底之間的同時鏈接。此外，親水性HPM的添加利于共聚物膜在降溫過程的快速水合，從而加速細胞的脫附速率，但過多添加HPM，培養(yǎng)表面過強的親水性則不利于細胞粘附，所以選用適宜的添加量5%，即完成共聚物與共聚物之間，共聚物與基底之間的同時鏈接即可。綜上，NIPAAm、TMSPM和HPM的摩爾比為18∶1∶1。后續(xù)結果表明采用此比例制備的P(NIPAAm-co-HPM-co- TMSPM) 共聚物膜具有良好的溫敏性、穩(wěn)定性、可控性及快速響應性等，且可用于貼壁細胞的培養(yǎng)與收獲。

圖1 P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物分子結構的功能基團(實線)和反應基團(虛線)[14]

1.4 控制聚合物厚度/密度

盡管經(jīng)由等離子體處理獲得的PNIPAAm表面，細胞附著不受其聚合物厚度/密度的制約，但采用電子束或紫外線照射、原子轉移自由基聚合以及可逆加成-斷裂鏈轉移聚合等方式制取的PNIPAAm基底，其聚合物厚度/密度則會影響細胞的粘附和脫附。Li等[15]制備具有厚度梯度的PNIPAAm膜層，結果表明具有20-45 nm厚度的溫敏性膜適宜HepG2細胞在37 ℃粘附和24 ℃脫附。Takahashi等[16]采用調(diào)節(jié)鏈轉移劑二硫代酯的濃度和可逆加成-斷裂鏈轉移聚合技術調(diào)控PNIPAAm接枝鏈的分子量和密度，他們指出接枝鏈的長度和密度顯著影響細胞的粘附和脫附行為，并且應用上述技術可為不同細胞篩選合適的溫敏性平面。Nash等[17]采用旋轉涂覆和紫外照射的方式制備PNIPAAm凝膠涂層，結果顯示3T3細胞只在厚度小于30 nm的涂層粘附和增殖，且細胞片層可在降溫10 min 后完全脫附。我們的實驗結果同樣證實不同種類細胞對P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM) 共聚物膜具有各異的選擇性，并根據(jù)同時滿足促進細胞粘附和減少細胞脫附時間的原則，可為不同種類細胞選擇適宜的溫敏性培養(yǎng)基底。

綜上，由于制備方法、組成成分的差異，適宜不同細胞的PNIPAAm基底的聚合物厚度/密度 (T/D) 有所不同，但均呈下述規(guī)律，如 圖2所示。當T/D較小時，細胞能夠粘附和生長于PNIPAAm基底，但其表面潤濕性和溶脹性能隨降溫變化的幅度較小，不足以提供足夠的驅(qū)動力使細胞脫附；當T/D增至一定范圍，此溫敏性表面在生理條件下適合細胞粘附和增殖，而經(jīng)過降溫處理其性質(zhì)改變的程度足以使細胞與表面脫離，可通過后續(xù)細胞鑒定實驗篩選出適宜的培養(yǎng)介質(zhì)；當T/D繼續(xù)增加，溫敏性表面由于較強的水合作用而不再支持細胞粘附，細胞由于失去粘附位點而懸浮于培養(yǎng)基，最終凋亡甚至死亡。

圖2 降溫前后細胞在不同厚度和表面潤濕性的溫敏性基底的粘附和脫附情況

1.5 提供適宜外力

降溫處理時，為減少直接置于低溫環(huán)境培養(yǎng)基自然冷卻時間且避免細胞再次粘附，通常采用低溫無血清培養(yǎng)基作為冷卻介質(zhì)。冷鮮培養(yǎng)基的人工注入可為細胞脫附的啟動提供外在驅(qū)動力，使PNIPAAm基底邊緣區(qū)域迅速變厚且更具親水性，細胞與基底之間的平衡瞬間破壞。處于邊緣的細胞變圓隨即脫附，為培養(yǎng)基持續(xù)進入細胞-基底界面提供有效空間，從而導致細胞連續(xù)脫附。除手動提供驅(qū)動力外，自動化供力方式具備可控性、重復性、再現(xiàn)性等優(yōu)點，更為可取。Tang等[18]在具有平行通道的PNIPAAm接枝培養(yǎng)板上鍵合聚二甲基硅氧烷薄片從而構建封閉的細胞培養(yǎng)空間，以保證各組細胞處于相同培養(yǎng)環(huán)境，而當降溫細胞脫離時又可提供不同的剪切力，結果證實外力的介入有助于細胞的快速脫附。

綜上，目前促進細胞有效粘附和快速脫附的方法仍以溫敏性表面物理性質(zhì)的改造為主，而關于化學性質(zhì)的改造以及兩種性質(zhì)的結合仍待于深入研究。并且通過現(xiàn)有研究內(nèi)容，難以確定影響細胞行為各種參數(shù)的重要程度以及彼此之間的最佳組合。

2 溫敏性PNIPAAm三維介質(zhì)

PNIPAAm及其衍生物介導的溫敏性二維培養(yǎng)平面的研究已初具成效，但仍存在難以模擬細胞天然生長狀態(tài)、材料制備和細胞培養(yǎng)耗時繁瑣，細胞產(chǎn)量微小等局限性，而三維培養(yǎng)模式既可保留體內(nèi)微環(huán)境的物質(zhì)結構基礎，又能體現(xiàn)細胞培養(yǎng)的直觀性及可控性，同時便于將體外細胞培養(yǎng)體系與組織器官及整體研究有機結合。因此，研究人員逐步嘗試將PNIPAAm引入微載體、支架或凝膠等體系從而形成溫敏性三維介質(zhì)，用于貼壁細胞的大規(guī)模擴增和非酶解收獲以及組織器官的修復或重構等。我們在PNIPAAm合成過程引入HPM和TMSPM，可實現(xiàn)P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM) 共聚物與任何形狀和尺寸的含羥基材質(zhì)的耦合，如果將該溫敏性共聚物膜制備于微載體或中空纖維膜上，再結合生物反應器技術，則有望形成新的體外大規(guī)模擴增細胞的培養(yǎng)體系，這亦是我們下一階段的研究重點。

2.1 PNIPAAm微載體

采用溫敏性微載體或支架培養(yǎng)細胞是目前模擬體內(nèi)空間微環(huán)境的最佳方案，如圖3所示。這種模式有利于細胞間信號傳導和細胞因子相互作用，從而保持細胞原始生理特征，并且由于增加細胞生長面積以及引入溫敏性PNIPAAm可在短時間、小空間內(nèi)實現(xiàn)大規(guī)模擴增和非酶解收獲細胞的目標。

Yang等[19]將PNIPAAm接枝于Cytodex-3(R) 微載體，并結合生物反應器考查大規(guī)模擴增Vero細胞的可行性，結果表明Vero細胞可在此溫敏性微載體上粘附、鋪展和生長，同時降溫處理后細胞可發(fā)生自發(fā)脫附，從而有效避免酶解損失同時實現(xiàn)擴增細胞的目標。Tamura等[20]通過原子轉移自由基聚合的方式將PNIPAAm接枝于氯甲基化聚苯乙烯微球表面，結果表明在37 ℃，CHO-K1細胞可附著于溫敏性微球，而當溫度降至20 ℃，細胞可發(fā)生自發(fā)脫附，并且細胞脫附率隨PNIPAAm接枝量的增加以及微球直徑的增大而增加。Park等[21]借助超支化聚硅氧烷將PNIPAAm固定于二氧化硅微球表面，并闡明具有高分子量PNIPAAm的溫敏性微球可用于控制細胞的粘附和脫附。Cetinkaya 等[22]指出盡管胎牛軟骨細胞在自制PHEMA-PNIPAAm微球上的粘附效率和增殖能力略低于在商品化Cytodex-1和Biosilon微載體的培養(yǎng)結果，但通過降溫處理從溫敏性微球分離的細胞依然具有正常增殖活性。Wu等[23]構建了乳糖基化PNIPAAm-PEG微球，HepG2細胞在此溫敏性微球內(nèi)成球生長并展現(xiàn)較高的肝臟分泌水平，降溫后微球液化可輕易獲取肝細胞球狀體。

圖3 用于細胞培養(yǎng)和收獲的溫敏性微載體和支架Fig. 3 Thermoresponsive microcarrier and scaffold for cell culture and recovery.

2.2 PNIPAAm支架

采用微球模板、低溫冷凍和靜電紡絲等方式可制備具有特定構造和溫敏特性的PNIPAAm支架。Galperin等[24]結合紫外照射和微球模板等方式將PNIPAAm、2-亞甲基-1,3-二氧雜環(huán)庚烷和聚已內(nèi)酯甲基丙烯酸二酯合成為可降解、孔徑均一且可調(diào)控的溫敏性支架。結果證實具有(55±5) μm孔徑的支架適合NIH3T3細胞的接種且保證細胞在37 ℃時無法脫出，同時細胞在支架內(nèi)展現(xiàn)良好的信號傳遞和鋪展狀態(tài)。Peniche等[25]在低溫條件下采用自由基聚合的方式制備附載殼聚糖和貝米肝素納米顆粒的PNIPAAm大孔支架。這種冷凍支架對人成纖維細胞無毒，且可控制肝素的釋放。Tiwari等[26]采用耦合化學和靜電紡絲的方式構建以PNIPAAm-碳納米管-聚苯胺為主體的無紡布纖維組構支架，與商品化Matrigel相比，L929細胞在該組構支架上展現(xiàn)極好的增殖能力和活性，溫度降至LCST以下時細胞可自發(fā)脫附。

2.3 PNIPAAm凝膠

PNIPAAm均聚物和共聚物凝膠具備如下優(yōu)點：允許細胞外基質(zhì)重構且使細胞錨定在材料內(nèi)部，可根據(jù)生理環(huán)境調(diào)整自身形狀，適合傳遞和輸送營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，可通過調(diào)整其組成來控制凝膠的相轉變點等。將細胞包埋于PNIPAAm介導的凝膠內(nèi)，結果證實溫敏性凝膠具有良好的生物相容性，細胞可在其內(nèi)部粘附和鋪展，培養(yǎng)一定時期仍呈較高的生長活性，并保持較強的生理功能。Lu等[27]將MIN6細胞包埋于PNIPAAm-聚乙二醇-PNIPAAm微凝膠內(nèi)，結果表明此溫敏性水凝膠具有良好的生物相容性，5 d后MIN6細胞在微凝膠內(nèi)部呈現(xiàn)較高的生長活性并形成小型團聚物且保持較強的胰島素分泌能力。Gan等[28]采用自由基沉淀聚合法制備PNIPAAm-甲基丙烯酸羥乙酯微凝膠，具有互聯(lián)多孔結構，且其孔徑隨脫水收縮作用的增強而逐漸變小，結果顯示HepG2細胞在脫水收縮作用較低的微凝膠內(nèi)，展現(xiàn)較強的增殖和成球生長能力，但在收縮作用較高的微凝膠內(nèi)其生長受到抑制。Sa-Lima等[29]考察了PNIPAAm-甲基纖維素水凝膠作為軟骨細胞微囊化三維介質(zhì)的可行性，結果表明微囊化的ATDC5細胞依然保持較高的活性和增殖能力。Chen等[30]將透明質(zhì)酸、殼聚糖和PNIPAAm合成可注射性溫敏性水凝膠，同時嵌入雙相磷酸鈣陶瓷顆粒，用于工程仿生骨的構建。

綜上，就生長區(qū)域而言，細胞分別生長在PNIPAAm微載體的表面和支架或凝膠的內(nèi)部；就最終目的而言，凝膠主要用于組織工程，通常不涉及細胞收獲問題，添加PNIPAAm的原因主要是利用其隨溫度改變的體積相變化進而將種子細胞隨凝膠共同注入活體的受損部位，用于組織或器官的修復或重構；而應用微載體和支架則以體外大規(guī)模擴增細胞為目標，添加PNIPAAm的目的主要是利用其隨溫度改變的表面潤濕性和整體厚度變化從而進行細胞的無侵害性收獲。

3 溫敏性PNIPAAm培養(yǎng)平臺的應用

根據(jù)PNIPAAm平臺的類型和后續(xù)操作方案的不同，可將細胞培養(yǎng)結果分為下述4種 情況：

1) 將貼壁型細胞接種于PNIPAAm二維或三維表面，如果接種密度較低或培養(yǎng)時間較短，盡管細胞不斷分泌細胞外基質(zhì) (Extracellular matrix, ECM)，但無法完全融合，所以降溫處理并輕微吹打后，細胞展現(xiàn)單獨分散狀態(tài)，但伴隨膜蛋白和粘附蛋白共同脫附[5,7,31]，如圖4A所示。這一方面利于細胞再次接種的快速定位，另一方面由于對細胞膜的有效保護從而利于細胞原始特性的維持。

2) 將貼壁型細胞接種于PNIPAAm二維或三維表面，如果接種密度較高或培養(yǎng)時間較長，除大量分泌ECM外，細胞的增殖和通訊可使細胞間形成連接蛋白，從而生成融合的細胞片層，經(jīng)由降溫處理，細胞會以完整片層形式從培養(yǎng)表面脫離，即細胞膜蛋白、粘附蛋白和連接蛋白均被完好的保留并隨細胞共同脫附[5,7,31]，如圖4B所示。但存在例外，如果在PNIPAAm中引入過多陽離子型物質(zhì)，那么在降溫過程細胞與溫敏性材料之間的靜電引力便會大于引起細胞自身脫附的骨架張力，因此細胞片層不能完整從材料表面剝離，反而在細胞骨架張力的作用下使細胞連接受到破壞[13]。

3) 將細胞包埋于PNIPAAm支架或凝膠內(nèi)部，隨培養(yǎng)時間延長，細胞在孔道中相繼完成粘附、鋪展、生長和增殖等系列生理活動，但同一孔道容納細胞數(shù)量有限。降溫處理使孔道尺寸擴大或主體解離，促使細胞釋放，經(jīng)輕微吹打，細胞可呈離散狀態(tài)[24]。

4) 將細胞包埋于PNIPAAm支架或凝膠內(nèi)部，主要針對組織工程背景進行研究，重點考查細胞在材料內(nèi)部的增殖分化及組織形成能力[27-30]，通常不涉及將細胞從支架或凝膠中取出的過程。

綜上，方案1) 和3) 可獲取單獨分散細胞，利于細胞繼續(xù)接種或性能檢測，且避免酶解損傷從而有效維持細胞的原始特征，所以其最終目的是大規(guī)模擴增細胞。特別對于培養(yǎng)敏感細胞或需要維持高水平的細胞活力抑或控制細胞的分化程度，此培養(yǎng)方案尤為適用，如干細胞等。研究表明，作為智能型培養(yǎng)基底，PNIPAAm表面在37 ℃時可支持干細胞的粘附、鋪展、遷移、生長、增殖和分化，且經(jīng)過降溫收獲后的干細胞仍具有較強的增殖能力和多向分化潛能及較高活性和較完整的免疫表型，可為生物醫(yī)藥領域提供品質(zhì)優(yōu)良的種子細胞[32-35]。

圖4 降溫前后分散細胞和細胞片層在溫敏性表面的粘附和脫附情況

如上所述，方案4) 主要應用于組織工程領域。由于方案2) 可形成完整的富含多種關鍵蛋白的細胞片層，因此衍生出新的組織工程方向——細胞片層工程 (Cell sheet engineering)[36-38]。降溫收獲的細胞片層可用于組織構建，即將細胞片層進行逐層疊加，其中單層細胞片層可用于皮膚和角膜的重構，相同的細胞片層疊加可用于心臟的重構，圖案化的細胞片層疊加可用于肝和腎組織的重構，而形狀化的細胞片層可用于血管、腎小管等組織的重構[39]。

因此，需要根據(jù)最終應用來選擇適宜的溫敏性PNIPAAm培養(yǎng)平臺，從而實現(xiàn)大規(guī)模擴增具有原始特征的重要細胞或達到組織器官修復和重構的目標。

4 結論與展望

以溫敏性材料PNIPAAm為培養(yǎng)介質(zhì)，以與之匹配的降溫脫附法作為收獲方式的細胞培養(yǎng)和回收體系持續(xù)受到廣泛關注。研究人員一直致力于新型PNIPAAm培養(yǎng)平臺的研發(fā)以及多種細胞類型的嘗試。但可通過以下途徑加以改進：1) 開發(fā)簡單經(jīng)濟的制備工藝，便于PNIPAAm在細胞體外培養(yǎng)領域的推廣和應用；2) 引入無毒無害的功能原/輔料，增強PNIPAAm介質(zhì)的快速響應性、反復使用性和生物相容性；3) 探討影響細胞行為各種參數(shù)的重要程度及彼此之間的最佳組合，促進細胞有效粘附和快速脫附。4) 將溫敏性材料與動態(tài)培養(yǎng)模式相結合，實現(xiàn)細胞的大規(guī)模擴增和組織重構的目標。

REFERENCES

[1] Yamada N, Okano T, Sakai H, et al. Thermo- responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells. Macromol Rapid Commun, 1990, 11(11): 571–576.

[2] Yang L, Pan F, Zhao XB, et al. Thermoresponsive copolymer nanofilms for controlling cell adhesion, growth, and detachment. Langmuir, 2010, 26(22): 17304–17314.

[3] Yang L, Cheng F, Liu TQ, et al. Comparison of mesenchymal stem cells harvested from poly(N- isopropylacrylamide) copolymer film and by trypsinization. Biomed Mater, 2012, 7(3): 035003.

[4] Akiyama Y, Kikuchi A, Yamato M, et al.Accelerated cell-sheet recovery from a surface successively grafted with polyacrylamide and poly(N-isopropylacrylamide). Acta Biomater, 2014, 10(8): 3398–3408.

[5] Kwon OH, Kikuchi A, Yamato M, et al. Rapid cell sheet detachment from poly(N-isopropylacrylamide)- grafted porous cell culture membranes. J Biomed Mater Res, 2000, 50(1): 82–89.

[6] Oh HH, Ko YG, Uyama H, et al. Fabrication and characterization of thermoresponsive polystyrene nanofibrous mats for cultured cell recovery. Biomed Res Int, 2014, 2014: 480694.

[7] Ebara M, Yamato M, Hirose M, et al. Copolymerization of 2-carboxyisopropylacrylamide with N-isopropylacrylamide accelerates cell detachment from grafted surfaces by reducing temperature. Biomacromolecules, 2003, 4(2): 344–349.

[8] Liu D, Wang T, Liu XX, et al. Accelerated cell sheet detachment by copolymerizing hydrophilic PEG side chains into PNIPAm nanocomposite hydrogels. Biomed Mater, 2012, 7(5): 055008.

[9] Kim SJ, Kim WI, Yamato M, et al. Successive grafting of PHEMA and PIPAAm onto cell culture surface enables rapid cell sheet recovery. Tissue Eng Regen Med, 2013, 10(3): 139–145.

[10] Wang JY, Chen L, Zhao YP, et al. Cell adhesion and accelerated detachment on the surface of temperature-sensitive chitosan and poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. J Mater Sci Mater Med, 2009, 20(2): 583–590.

[11] Ohya S, Kidoaki S, Matsuda T. Poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)-grafted gelatin hydrogel surfaces: interrelationship between microscopic structure and mechanical property of surface regions and cell adhesiveness. Biomaterials, 2005, 26(16): 3105–3111.

[12] Kong B, Choi JS, Jeon S, et al. The control of cell adhesion and detachment on thin films of thermoresponsive poly[(N-isopropylacrylamide)- r-((3-(methacryloylamino) propyl)-dimethyl (3-sulfopropyl) ammonium hydroxide)] . Biomaterials, 2009, 30(29): 5514–5522.

[13] Liu D, Wang T, Liu XX, et al. Cell Proliferation and cell sheet detachment from the positively and negatively charged nanocomposite hydrogels. Biopolymers, 2014, 101(1): 58–65.

[14] Yang L. Preparation of novel temperature- responsive film and stem cell culture and recovery on it [D]. Dalian: Dalian University of Technology, 2012 (in Chinese).楊磊. 新型溫敏膜的構建及其培養(yǎng)收獲干細胞的研究[D]. 大連: 大連理工大學, 2012.

[15] Li LH, Zhu Y, Li B, et al. Fabrication of thermoresponsive polymer gradients for study of cell adhesion and detachment. Langmuir, 2008, 24(23): 13632–13639.

[16] Takahashi H, Nakayama M, Yamato M, et al. Controlled chain length and graft density of thermoresponsive polymer brushes for optimizing cell sheet harvest. Biomacromolecules, 2010, 11(8): 1991–1999.

[17] Nash ME, Carroll WM, Foley PJ, et al. Ultra-thin spin coated crosslinkable hydrogels for use in cell sheet recovery-synthesis, characterisation to application. Soft Matter, 2012, 8(14): 3889–3899.

[18] Tang ZL, Akiyama Y, Itoga K, et al. Shear stress-dependent cell detachment from temperature-responsive cell culture surfaces in a microfluidic device. Biomaterials, 2012, 33(30): 7405–7411.

[19] Yang HS, Seo JH, Kim BS. Serial propagation of cells on thermo-sensitive microcarrier. Tissue Eng Regen Med, 2009, 6(13): 1262–1267.

[20] Tamura A, Kobayashi J, Yamato M, et al. Temperature-responsive poly(N-isopropylacrylamide) -grafted microcarriers for large-scale non- invasive harvest of anchorage-dependent cells. Biomaterials, 2012, 33(15): 3803–3812.

[21] Park BR, Nabae Y, Surapati M, Poly(N-isopropylacrylamide)-modified silica beads with hyperbranched polysiloxysilane for three-dimensional cell cultivation. Polym J, 2013, 45(2): 210–215.

[22] Cetinkaya G, Kahraman AS, Gumusderelioglu M, et al. Derivation, characterization and expansion of fetal chondrocytes on different microcarriers. Cytotechnology, 2011, 63(6): 633–643.

[23] Wu Y, Zhao Z, Guan Y, et al. Galactosylated reversible hydrogels as scaffold for HepG2 spheroid generation. Acta Biomater, 2014, 10(5): 1965–1974.

[24] Galperin A, Long TJ, Ratner BD. Degradable, thermo-sensitive poly(N-isopropyl acrylamide)- based scaffolds with controlled porosity for tissue engineering applications. Biomacromolecules, 2010, 11(10): 2583–2592.

[25] Peniche H, Reyes-Ortega F, Aguilar MR, et al. Thermosensitive macroporous cryogels functionalized with bioactive chitosan/bemiparin nanoparticles. Macromol Biosci, 2013, 13(11): 1556–1567.

[26] Tiwari A, Sharma Y, Hattori S, et al. Influence of Poly(N-isopropylacrylamide)-CNT-Polyaniline three-dimensional electrospun microfabric scaffolds on cell growth and viability. Biopolymers, 2013, 99(5): 334–341.

[27] Lu HF, Targonsky ED, Wheeler MB, et al. Thermally induced gelable polymer networks for living cell encapsulation. Biotechnol Bioeng, 2007, 96(1): 146–155.

[28] Gan TT, Guan Y, Zhang YJ. Thermogelable PNIPAM microgel dispersion as 3D cell scaffold: effect of syneresis. J Mater Chem, 2010, 20(28): 5937–5944.

[29] Sa-Lima H, Tuzlakoglu K, Mano JF, et al. Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)- g-methylcellulose hydrogel as a three-dimensional extracellular matrix for cartilage-engineered applications. J Biomed Mater Res A, 2011, 98A(4): 596–603.

[30] Chen JP, Tsai MJ, Liao HT. Incorporation of biphasic calcium phosphate microparticles in injectable thermoresponsive hydrogel modulates bone cell proliferation and differentiation. Colloids Surf B Biointerfaces, 2013, 110(10): 120–129.

[31] Cole MA, Voelcker NH, Thissen H, et al. Stimuli-responsive interfaces and systems for the control of protein-surface and cell-surface interactions. Biomaterials, 2009, 30(9): 1827–1850.

[32] Shi DY, Ma D, Dong FQ, et al. Proliferation and multi-differentiation potentials of human mesenchymal stem cells on thermo-responsive PDMS surfaces grafted with PNIPAAm. Biosci Rep, 2010, 30(3): 149–158.

[33] Yang HS, Jeon O, Bhang SH, et al. Suspension culture of mammalian cells using thermosensitive microcarrier that allows cell detachment without proteolytic enzyme treatment. Cell Transplant, 2010, 19(9): 1123–1132.

[34] Shen ZY, Bi JX, Shi BY, et al. Exploring thermal reversible hydrogels for stem cell expansion in three-dimensions. Soft Matter, 2012, 8(27): 7250–7257.

[35] Nash ME, Fan XL, Carroll WM, et al. Thermoresponsive Substrates used for the expansion of human mesenchymal stem cells and the preservation of immunophenotype. Stem Cell Rev Rep, 2013, 9(2): 148–157.

[36] Shimizu T, Yamato M, Kikuchi A, et al. Cell sheet engineering for myocardial tissue reconstruction. Biomaterials, 2003, 24(13): 2309–2316.

[37] Isenberg BC, Tsuda Y, Williams C, et al. A thermoresponsive, microtextured substrate for cell sheet engineering with defined structural organization. Biomaterials, 2008, 29(17): 2565– 2572.

[38] Chen YS, Tsou PC, Lo JM, et al. Poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels with interpenetrating multiwalled carbon nanotubes for cell sheet engineering. Biomaterials, 2013, 34(30): 7328–7334.

[39] Elloumi-Hannachi I, Yamato M, Okano T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med, 2010, 267(1): 54–70.

(本文責編 郝麗芳)

Advances in poly (N-isopropylacrylamide) based platforms for cell culture

Lei Yang1, Tianqing Liu2, Xiaoguang Fan3, Fei Wang1, and Zheng Li1

1 School of Environmental and Biological Engineering, Liaoning Shihua University, Fushun 113001, Liaoning, China 2 Dalian R&D Center for Stem Cell and Tissue Engineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China 3 Fushun Petrochemical Company, China National Petroleum Corporation, Fushun 113008, Liaoning, China

Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm), a temperature-responsive polymer, can be potentially applied to replace enzymes or cell scrapers to recover attached cells. Taking full advantage of this unique function of PNIPAAm, cells can be protected from enzymatic hydrolysis and mechanical treatment, thereby to provide ideal seed cells with high quality for biomedical fields. In this review we describe the method to facilitate cell effective adhesion and rapid detachment on thermoresponsive two dimensional surfaces, including selecting special substrate, introducing hydrophilic group, adjusting reactant ratio, controlling polymer thickness/density, providing appropriate external force, so as to effectively improve adherent cell adaptability to thermoresponsive surfaces, depress the risk of bacterial contamination and reduce the effect of low-temperature treatment on the cells. The three dimensional cell culture systems involved in temperature-sensitive microcarriers, scaffolds and gels were briefly discussed. The application based on the platforms for cell culture was also presented.

poly (N-isopropylacrylamide), temperature-responsive polymer, cell culture substrate, stem cell, cell sheet engineering

April 14, 2014; Accepted: September 1, 2014

Lei Yang. Tel: +86-24-56861705; E-mail: leiyang1982@yahoo.com

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31170945).

國家自然科學基金 (No. 31170945) 資助。

網(wǎng)絡出版時間：2014-09-24

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140226.html