郗艷麗，張啟娟，周　婧，都　耀，王舒然（吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林132103）

女貞子中齊墩果酸提取工藝優(yōu)化

郗艷麗，張啟娟，周婧，都耀，王舒然*
（吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林132103）

摘要：以女貞子中齊墩果酸的含量為評價指標(biāo)，研究提取溫度、料液比、回流次數(shù)對女貞子中齊墩果酸提取含量的影響，香草醛-高氯酸比色法測定其含量。在提取溫度85℃，料液比1∶30（g/mL），回流5次的條件下，齊墩果酸的提取含量最高，可達(dá)到122.66 μg/mL，此時齊墩果酸提取率為4.066%。高效液相法驗(yàn)證提取物為齊墩果酸，此時齊墩果酸DPPH自由基清除率為70.96%。

關(guān)鍵詞：女貞子；齊墩果酸；高氯酸-香草醛比色法；高效液相色譜法

女貞子在我國的大部分地方均可生長，且種植面積廣，資源豐富，東北地區(qū)亦有大面積種植。其果實(shí)中含有多種活性物質(zhì)，具有豐富的食用價值和極高的營養(yǎng)保健功效。研究證實(shí)，齊墩果酸是女貞子中的重要活性成分之一[1]。齊墩果酸對由自由基堆積引起的記憶減退、糖尿病、高血脂、腫瘤等疾病的防治效果明顯[2-5]。此外，齊墩果酸的毒副作用小、安全性高，已成為醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和食品保健科學(xué)的研究熱點(diǎn)[6]。齊墩果酸的用途廣，市場需求量大，從天然植物中提取的齊墩果酸更是供不應(yīng)求[7]。因此，對齊墩果酸提取工藝的研究仍有非常重要的意義。本研究主要以女貞子為原料，通過對女貞子中齊墩果酸的提取和鑒定，建立了一種簡便易行、低廉高效的齊墩果酸提取工藝，以滿足對齊墩果酸的需求。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料與試劑

女貞子：購買自吉林市某藥房；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品[標(biāo)準(zhǔn)品號為：GBW（E）100141]：購于中國生物制品研究所。

無水甲醇、乙酸乙酯、高氯酸、香草醛、氫氧化鈉等試劑皆為分析純，購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；高效液相用甲醇為色譜純，購于天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2儀器

202-1型電熱恒溫干燥箱：天津市泰森特儀器有限公司；CN-500A多功能中藥粉碎機(jī)：中南制藥機(jī)械廠；FA1104電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；索氏提取器：上海欣榮儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；722型可見光分光光度計：上海菁華科技實(shí)業(yè)有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵：上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；1260高效液相色譜儀：安捷倫；UV-1800紫外分光光度儀：日本島津。

1.2工藝流程

1.2.1原料預(yù)處理

女貞子在60℃條件下干燥，多功能粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，制成女貞子粉末，密封干燥儲藏，備用。

1.2.2提取工藝

準(zhǔn)確稱取女貞子粉末，濾紙包成紙包置于索氏提取器中，加入甲醇溶劑進(jìn)行回流提取，收集提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行減壓蒸餾，浸出膏用香草醛-高氯酸溶解并定容，加入乙酸乙酯終止反應(yīng)，比色法測定浸出膏中齊墩果酸的含量。

1.3齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.3.1測定波長的選擇

取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品5 mg置于潔凈干燥試管中，加入5%香草醛冰醋酸和高氯酸混合液（1∶4，體積比）定容至20 mL，配成濃度為0.25 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品使用液，紫外分光光度計在全波長范圍內(nèi)進(jìn)行波譜掃描，在波長560 nm處獲得最大吸收峰。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取6支潔凈干燥的試管，分別加入配制好的0.25 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品使用液0、1、1.5、2、2.5、3 mL于試管中，再分別加入5%香草醛冰醋酸和高氯酸混合液5、4、3.5、3、2.5、2 mL，充分搖勻，在70℃水浴下加熱10 min，冷卻至室溫，迅速在各管中加入乙酸乙酯4 mL搖勻，即得齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在波長560 nm波長下測其吸光度值，并以濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2）。

1.4單因素試驗(yàn)

1.4.1提取溫度對齊墩果酸提取含量的影響

準(zhǔn)確稱取女貞子粉末3 g，加入無水甲醇60 mL置于索氏提取器中，分別在80、85、90、95、100℃條件下進(jìn)行回流提取?；亓?次后取出冷卻過0.22 μm孔徑的濾膜，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干得浸出膏，分別加入5%香草醛冰醋酸溶液和高氯酸混合液（1∶4，體積比）定容至10 mL，再加入乙酸乙酯終止反應(yīng)，70℃水浴15 min，在波長560 nm下測吸光度，計算提取含量。

1.4.2料液比對齊墩果酸提取含量的影響

準(zhǔn)確稱取女貞子粉末1、1.2、1.5、2、3 g，加入無水甲醇60 mL置于索氏提取器中，90℃水浴溫度下回流提取2次，取出冷卻過0.22 μm孔徑的濾膜，剩余步驟同“1.4.1”，計算提取含量。

1.4.3回流次數(shù)對齊墩果酸提取含量的影響

準(zhǔn)確稱取女貞子粉末3 g，加入無水甲醇60 mL置于索氏提取器中，90℃水浴溫度下回流提取，回流次數(shù)分別為1、2、3、4、5次。提取結(jié)束后冷卻過0.22 μm孔徑的濾膜，剩余步驟同“1.4.1”，計算提取含量。

1.5正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取溫度、料液比、回流次數(shù)為考察條件，每個因素選3個條件作為考察條件，并以L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以提取含量為考察指標(biāo)，篩選最佳提取條件，并按下列公式計算齊墩果酸的提取率。

提取率/%=（C/M×103）×100

式中：C為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出提取液中齊墩果酸含量，μg/mL；M為女貞子樣品的質(zhì)量，g。

1.6驗(yàn)證試驗(yàn)

1.6.1高效液相法鑒定提取樣品

取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品2 mg，加入色譜甲醇溶液定容至10 mL，過0.22 μm孔徑微孔濾膜，超聲40℃、脫氣20 min，手動進(jìn)樣，測定齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品。提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入色譜甲醇定容至10 mL，其余處理方法同標(biāo)準(zhǔn)品。

高效液相色譜條件：色譜柱：DiamonsilC18（150 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇：水為（16∶80，體積比）mL；檢測波長：220 nm；流速：1.0 mL/min；室溫；進(jìn)樣量：20 μL。

1.6.2DPPH自由基清除能力的測定

選取最佳提取條件提取齊墩果酸，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后加入95%乙醇充分溶解并定容至10 mL。取潔凈干燥的試管4支，分別標(biāo)記為0、1、2、3號，在0號管中加入95%乙醇3 mL，在1號管中按0.8∶5（體積比）的比例加入提取液及95%DPPH溶液，在2號管中加入相同比例的提取液及95%乙醇，在3號管中加入相同比例的95%乙醇及95%DPPH溶液，充分搖勻。37℃水浴30 min，冷卻至室溫，在517 nm波長下測定吸光度并計算清除率。

清除率（R）/%=[1-（Ai-Aj）/AC]×100

式中：Ac為不含DPPH的空白溶液吸光度；Ai為加入提取液后DPPH溶液的吸光度；Aj為沒有加提取液的DPPH溶液吸光度。

2　結(jié)果與討論

2.1齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1　齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of oleanolic acid determination

經(jīng)線性回歸分析得回歸方程：Y=0.006 4X-0.127 2，R2=0.998 0，齊墩果酸在50 μg～150 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1提取溫度對齊墩果酸提取含量的影響

提取溫度對齊墩果酸提取含量的影響結(jié)果見圖2。

圖2　提取溫度對齊墩果酸提取含量的影響Fig.2　Effect of extraction time on oleanolic acid yield

提取溶劑的選擇對提取時間有很大的影響?？晒┻x擇的提取溶劑有很多種，利用甲醇、乙醇或石油醚提取齊墩果酸的方法都有過報道[8-10]。其中石油醚毒性大，容易揮發(fā)，安全性低，不便于試驗(yàn)所用。乙醇沸點(diǎn)高，難以考慮低溫條件對提取率的影響，而甲醇比乙醇沸點(diǎn)低，毒性比石油醚小，能滿足試驗(yàn)要求。因此，選擇甲醇為提取溶劑。此外，溫度對齊墩果酸的提取也有很大影響。齊墩果酸具有很強(qiáng)的抗氧化活性[11]，對炎癥反應(yīng)也有抑制作用[12]，溫度過高，會導(dǎo)致提取物活性的失活。適宜的提取溫度，既會獲得較高含量的齊墩果酸提取物，又能保護(hù)提取物的活性。

由圖2可看出，隨著提取溫度的不斷升高，齊墩果酸提取含量逐漸減小，提取溫度為80℃時提取含量最大，85℃、90℃次之，95℃最低，但100℃時提取含量有所提高，但仍比90℃時的提取含量低，可能是溫度過高導(dǎo)致齊墩果酸的結(jié)構(gòu)被破壞，影響了提取的效果。

2.2.2料液比對齊墩果酸提取含量的影響

料液比對齊墩果酸提取含量的影響結(jié)果見圖3。

圖3　料液比對齊墩果酸提取含量的影響Fig.3　Effect of solid-liquid ratio on oleanolic acid yield

料液的比例會影響齊墩果酸的提取含量，合適的料液比會使女貞子粉末充分分散，接觸有機(jī)溶劑，提高齊墩果酸的提取效率，降低溶劑的消耗，減少成本，同時也可以避免大量廢棄的溶劑污染環(huán)境[13]。研究結(jié)果顯示，當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時，齊墩果酸提取含量最大。隨著溶劑使用量的增大，提取含量反而下降，當(dāng)料液比為1∶60（g/mL）時的提取含量最低。這一結(jié)果表明，大量使用溶劑不會獲得高含量的齊墩果酸提取物，料液比為1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）這3個條件下獲得的齊墩果酸含量符合要求，因此這3個水平可以被列入正交因素的考查水平。

2.2.3回流次數(shù)對齊墩果酸提取含量的影響

回流次數(shù)對齊墩果酸提取含量的影響結(jié)果見圖4。

圖4　回流次數(shù)對齊墩果酸提取含量的影響Fig.4　Effect of reflux times on oleanolic acid yield

研究結(jié)果表明，回流次數(shù)與齊墩果酸的提取含量呈正相關(guān)，回流次數(shù)為3、4、5次時，獲得的提取物中齊墩果酸的含量分別為88.82、96.76、121.53 μg/mL。回流次數(shù)越多，齊墩果酸提取物的含量越高。

2.3正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，選取提取溫度、料液比、回流次數(shù)為考察因素，每個因素選取3個水平以L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平表見表1，以提取含量為考察指標(biāo)，篩選最佳提取條件，結(jié)果見表2。

表1　齊墩果酸正交試驗(yàn)因素水平表Table 1　Level of orthogonal examination

由表2可知，極差的大小順序?yàn)镃＞B＞A，因此女貞子中齊墩果酸提取工藝影響因素的主次順序也為C＞B＞A，即索氏提取的回流次數(shù)對提取含量影響最大，料液比次之，提取溫度最小。最佳組合條件為A2B2C3，即提取溫度為85℃，料液比為1∶30（g/mL），回流次數(shù)為5次，在此條件下，女貞子中齊墩果酸的提取含量為122.66 μg/mL，最優(yōu)條件齊墩果酸的提取率為4.066%。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2　Result of orthogonal examination

2.4驗(yàn)證性試驗(yàn)

2.4.1高效液相法鑒定提取樣品

高效液相法鑒定提取樣品結(jié)果見圖5。

高效液相色譜法檢測結(jié)果表明，提取樣品（如圖5 中2所示）的出峰時間與齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（如圖5中1所示）出峰時間相一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了提取樣品的主要成分是齊墩果酸。

2.4.2齊墩果酸對DPPH自由基清除作用測定

加入樣品后DPPH溶液的吸光度（Ai）為0.249，不含DPPH的空白溶液吸光度（Ac）為1.295，沒有加樣品的DPPH溶液吸光度（Aj）為0.168，計算求得DPPH自由基的清除率為70.96%。這表明提取物對DPPH自由基有明顯的清除作用，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報道的一致[14]，可判斷從女貞子中提取的物質(zhì)是齊墩果酸。

圖5　齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品和提取樣品色譜圖Fig.5　HPLC chromatograms of oleanolic acid standard and extraction sample

3　結(jié)論

影響女貞子齊墩果酸提取含量的因素（提取溫度、料液比和回流次數(shù)）中，回流次數(shù)為主要影響因素，料液比為次要影響因素，提取溫度對提取含量的影響最小。通過正交試驗(yàn)得到了女貞子齊墩果酸的最佳提取工藝條件：提取溫度85℃，料液比1∶30（g/mL），回流次數(shù)5次，在此條件下的齊墩果酸的提取含量為122.66 μg/mL，提取率為4.066%。通過高效液相色譜法和自由基清除率檢測法進(jìn)一步驗(yàn)證了提取物為齊墩果酸。試驗(yàn)結(jié)果表明，正交試驗(yàn)法能夠優(yōu)化女貞子齊墩果酸的提取工藝，獲得較高純度的齊墩果酸提取物。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.011

收稿日期：2015-01-08

基金項(xiàng)目：吉林省衛(wèi)生計生委吉林省財政廳資助項(xiàng)目（2014ZC063）

作者簡介：郗艷麗（1981—），女（漢），講師，博士，從事食品毒理學(xué)研究。

*通信作者：王舒然（1968—），男（漢），教授，博士，從事食品營養(yǎng)學(xué)研究。

Study on Optimum Extraction Process of Oleanolic Acid from Ligustrum Lucidum Ait

XI Yan-li，ZHANG Qi-juan，ZHOU Jing，DU Yao，WANG Shu-ran*
（School of Public Health，Jilin Medical University，Jilin 132013，Jilin，China）

Abstract：With the content of oleanolic acid from ligustrum lucidum ait as evaluating indicator，the effect of extraction temperature，solid-liquid ratio and reflux times on the extraction content was considered.The contents of oleanolic acid were measured by vanillin-perchlorate colorimetry.The optimal extraction processes were as follows：extraction temperature of 85℃，solid-liquid ratio of 1∶30（g/mL）and reflux times of five.In these conditions，the extraction content of oleanolic acid was 122.66 μg/mL，and the extraction ratio was about 4.066%.Then the extraction was identified as oleanolic acid by HPLC method，and the scavenging rate of DPPH was 70.96%.

Key words：ligustrum lucidum ait；oleanolic acid；vanillin-perchlorate colorimetry；HPLC method