張穎++梁美楊

摘要：通過探討8周的有氧運(yùn)動對雌性大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡的影響，探究體育鍛煉是否通過改善細(xì)胞凋亡的能力從而延緩了細(xì)胞衰老。按照月齡將大鼠分為青年組、中年組、老年組，每個(gè)年齡又分為運(yùn)動組和對照組。運(yùn)動組大鼠每日進(jìn)行1h的跑臺運(yùn)動，對照組常規(guī)飼養(yǎng)。8周后，處理動物，取大鼠骨骼肌，通過免疫組化技術(shù)，定量分析大鼠骨骼肌BCL-2、BAX的含量。結(jié)論發(fā)現(xiàn)：所有大鼠骨骼肌中均存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。隨著年齡增長，老年組大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡呈明顯上升趨勢（P<0.01）。有氧運(yùn)動對青年組大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用（P<0.05），老年運(yùn)動組大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡則有下降的趨勢（P>0.05）。年齡和有氧運(yùn)動的交互作用證明：8周有氧運(yùn)動對促進(jìn)青年組大鼠骨骼肌新陳代謝、延緩老年組大鼠肌細(xì)胞萎縮有積極作用。

關(guān)鍵詞：有氧運(yùn)動；大鼠；骨骼?。患?xì)胞凋亡

中圖分類號：G804 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1008-2808（2015） 02-0087-05

Abstract：Through an investigation of 8 weeks aerobic exercise influence on female rat skele-tal muscle cell apoptosis. To explore whether the physical exercise by improving the ability ofthe cell apoptosis and delayed the senescence of cells. methods According to months rats di-vided into young， middle - aged and elderly group. Every age is divided into exercise groupand control group. Exercise group rats run daily for l hour's motion， the control group con-ventional breeding. After eight weeks， handle animal， in rat skeletal muscle， using immuno-histochemical techniques， quantitative analysis of rat skeletal muscle the BCL-2， BAXlevels. Conclusion all the rat skeletal muscle apoptosis phenomenon exists. As we age， eld-erly group rats skeletal muscle apoptosis showed a trend of increased obviously （P<0.01）.Aerobic exercise for youth promote skeletal muscle cells apoptosis in rats （P<0.05）， theolder group rats skeletal muscle apoptosis is the trend of decline （P>0.05 ） . Age and the in-teraction of the aerobic exercise to prove： 8 weeks aerobic exercise to promote young rat skel-etal muscle metabolism， delay the elderly group muscle atrophy in rats have a positive effect.

Key words：Aerobic exercise ； Rats ； Skeletal muscle ； Cell apoptosis ；

有氧運(yùn)動是由Kennth H.Cooper博士于1968年倡導(dǎo)的，顧名思義就是在有氧代謝狀態(tài)下做運(yùn)動，在運(yùn)動過程中，人體吸人的氧氣與需求相等，達(dá)到生理上的平衡狀態(tài)。作為運(yùn)動人體科學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，科研人員在諸多領(lǐng)域?qū)τ醒踹\(yùn)動進(jìn)行了深入的研究，也取得了長足的進(jìn)展。細(xì)胞凋亡是指在生命體發(fā)育、生長、衰老過程中，為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而對不同有害刺量的應(yīng)答，或在疾病中所產(chǎn)生的一種特殊的，受核DNA控制的細(xì)胞自殺行為。由此可見細(xì)胞凋亡是一種主動的、由遺傳控制的程序性現(xiàn)象，故也稱為細(xì)胞程序化死亡。細(xì)胞凋亡是受基因控制的。根據(jù)所起作用可將參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因分為促進(jìn)凋亡基因和抑制凋亡基因。BCL-2就是抑制細(xì)胞凋亡的典型基因，而BAX則屬于促進(jìn)凋亡亞族的一員。

運(yùn)動與骨骼肌密切相關(guān)。人體的各種運(yùn)動都是在骨骼肌的收縮下完成的。因此對于骨骼肌的研究一直是運(yùn)動人體科學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)。但通過查閱資料發(fā)現(xiàn)：對于骨骼肌的研究多集中在生理生化領(lǐng)域，針對骨骼肌細(xì)胞凋亡的研究文獻(xiàn)較少。因此，本文通過實(shí)驗(yàn)，闡述有氧運(yùn)動對增齡SD大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 實(shí)驗(yàn)對象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象及分組

不同月齡雌性SD大鼠60只，購白黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物安全評價(jià)中心，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)。飲食飲水自由，動物房內(nèi)溫度18℃～ 25℃，相對濕度40%～50%。白然光照，保證動物房安靜，整潔，通風(fēng)。每天上午填食、加水、換墊料。按照月齡將SD大鼠分為青年組（3個(gè)月左右）20只，（6個(gè)月左右）20只，老年組（13個(gè)月左右）20只。將每組大鼠隨機(jī)抽取10只作為實(shí)驗(yàn)組，10只作為對照組。實(shí)驗(yàn)組和對照組體重、體質(zhì)均無顯著性差異。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，然后進(jìn)行適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練20min。第二天進(jìn)行篩選：跑臺坡度0°，速度15m/min，運(yùn)動60min。凡不能完成或完成但出現(xiàn)異常表現(xiàn)者（如運(yùn)動不協(xié)調(diào)、長時(shí)間趴在跑臺帶上、有明顯傷口及出血者）淘汰。接下來參照T.G.Bedford等方法，采用中等強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練。跑臺坡度00，lh/次，1次/日，每周6次，休息1天，共8周。跑速逐漸遞增。開始速度為10 m/min，lOmin后速度增加至11 m/min。以此類推，每個(gè)速度均跑10min，最后調(diào)整至15m/min。不能完成測試者淘汰。選材時(shí)沒有大鼠被淘汰。對照組常規(guī)飼養(yǎng)。endprint

1.3 動物取材及細(xì)胞凋亡的檢測

1. 3.1 動物取材 各組大鼠在8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行取材，取材前一天禁食。配制10%的水合氯醛溶液作為麻醉劑。麻醉劑量根據(jù)體重決定，每千克注射350ml水合氯醛。麻醉后，把大鼠固定在手術(shù)臺上，剪開下肢皮膚，取腓腸肌作為實(shí)驗(yàn)樣本。在生理鹽水中沖洗后，保存至福爾馬林溶液中。

1.3.2 制作蠟塊 將泡在福爾馬林中的腓腸肌橫切，厚度約3mm左右。切好的肌肉置于模具中，用自來水沖洗th。然后脫水：70%乙醇1 h→80%乙醇Ⅰh→90%乙醇過夜→100%乙醇Ⅰ1h→100%乙醇Ⅱ1h→二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ20min。

骨骼肌脫水后浸蠟，在70℃的溫箱中，將組織分別放在液體臘（一）1.5 h→液體蠟（二）1.Sh→液體蠟（三）1h。

將溶化好的純臘倒在制蠟塊的模具中，把浸好蠟的肌肉組織放入其中，室溫條件下過夜。第二天蠟塊即可制成。蠟塊修理后用YD-1508B輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)把蠟塊切成7μm的蠟片。在溫水浴中展片、用載玻片撈片、用DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱把片子烘干。石蠟切片即制作完成。

1. 3.3 細(xì)胞內(nèi)基因蛋白表達(dá)的檢測 通過試劑和抗體來檢測大鼠腓腸肌組織內(nèi)bcl-2和bax的基因蛋白表達(dá)。試劑盒購白武漢博士德公司?？贵w為PV6001（山羊抗或兔1gG抗體-HRP多聚體）。主要步驟如下：

（1）脫蠟、水化組織切片：二甲苯15min→二甲苯Ⅱ5 min→100%乙醇Ⅰ5min→100 %乙醇Ⅱ5min→90%乙醇5min→80%乙醇Smi0→70%乙醇5min→水5min→PBS沖洗2次，每次5min→抗原修復(fù)→室溫下晾涼。

注：PBS濃度為0.02mol/L，PH值7.2～7.6。具體配置方法：精確稱取并在燒瓶中依次加入Nac19g，Na2HP04 12H206g，NaH2P04 2H2O 0.4g，加蒸餾水1000ml，PBS液即配制而成。

注：抗原修復(fù)所用檸檬酸鹽緩沖液濃度為0.01 mol/L，PH=6.0。具體配制方法：C6H5Na3072H2O（檸檬酸三鈉）3g，C6H8O7 H2O（檸檬酸）0.4g，加蒸餾水1000ml配制而成。檸檬酸鹽緩沖液的優(yōu)點(diǎn)是染色背景清晰，適用于絕大多數(shù)抗體?？乖迯?fù)即把載玻片架置于檸檬酸溶液中，用微波爐加熱4min。加熱過程中試劑不可太少，因?yàn)槲⒉t溫度太高，液體蒸發(fā)過快。試劑也不可太多，有溢出的危險(xiǎn)。加熱時(shí)給容器加蓋，但需要留出一條縫。

（2）把載玻片置于3%過氧化氫中孵育10min，用PBS沖洗3次，每次2min。

（3）封閉：在組織上滴加羊抗血清封閉，20min后甩去。

（4）滴加一抗，37℃孵育1.5h，或者4℃過夜。然后用PBS沖洗3次，每次2min。（通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定一抗的濃度為1：75）

（5）按照一抗的來源，分別加相應(yīng)的檢測試劑PV6001（山羊抗或兔IgG抗體-HRP多聚體）。在室溫或者37℃溫箱里孵育30min后，用PBS沖洗3次，每次2min。

（6）顯色：滴加DAB顯色劑，5min左右即可。當(dāng)觀察到組織變成棕色即可判定為陽性細(xì)胞?？梢越K止反應(yīng)。

（7）用蒸餾水充分沖洗2次，每次2min。加蒸餾水即阻斷了反應(yīng)。

（8）復(fù)染、脫水、透明：蘇木素2min→自來水→蒸餾水3min→80%乙醇3min→90%乙醇3min→100%乙醇Ⅰ3min→l00%乙醇Ⅱ3min→二甲苯Ⅰ3min→二甲苯Ⅱ3min

（9）封片：用中性樹脂膠滴在載玻片的組織旁，再用蓋玻片蓋上。

（10）觀察：用光學(xué)顯微鏡觀察片子，統(tǒng)計(jì)后進(jìn)行定量分析。

1. 3.4 免疫組化染色統(tǒng)計(jì) Bcl-2、bax的免疫反應(yīng)產(chǎn)物的標(biāo)記強(qiáng)度用平均值A(chǔ)來表示。把每組制作的8張骨骼肌組織切片在40×10的放大倍數(shù)下選取3個(gè)視野拍照。使用LEICA Q550W圖像分析系統(tǒng)對照片進(jìn)行分析。從而測定出bcl-2、bax的A值。調(diào)節(jié)系統(tǒng)去除本底后測量特異染色的平均光密度值。用測得的bcl-2、bax蛋白的A值減去背景A值即得到校正A值（CA值）。CA值即為凋亡蛋白免疫反應(yīng)的實(shí)際A值。用CA值進(jìn)行分析可以避免染色過程中非特異染色所造成的誤差。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件包進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性差異分析。P<0.05即表示有顯著性差異，P<0.01，為差異非常顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表1可以看出青年對照組和青年運(yùn)動組大鼠的骨骼肌中bcl-2的表達(dá)無顯著性差異（P>0.05）。中年組的值整體上雖然略低于青年組，但在中年對照組和中年實(shí)驗(yàn)組織間也沒有體現(xiàn)出明顯差異。老年運(yùn)動組bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于老年對照組（P<0.05）。增齡因素對骨骼肌bcl-2的表達(dá)影響非常顯著，不同年齡段對照組大鼠比較P<0.01。各年齡段運(yùn)動組大鼠之間bcl-2有顯著性差異（P<0.05）。

通過表2可知：各年齡段大鼠bax的表達(dá)結(jié)果組間比較均無顯著性差異（P>0.05）。對照組大鼠之間差異顯著（P<0.05）。但bax的CA值沒有與年齡呈現(xiàn)線性關(guān)系。

青年組促凋亡蛋白因子的表達(dá)高于中年組。老年對照組bax顯著高于中青年組。在運(yùn)動和年齡的雙重因素干預(yù)下，各組織間bax的表達(dá)有顯著性差異（P<0.05）。運(yùn)動組大鼠bax值與年齡呈現(xiàn)出線性關(guān)系。即隨著年齡的增長，運(yùn)動組大鼠bax的表達(dá)逐漸明顯。

2.2 分析與討論

目前的研究普遍認(rèn)為，細(xì)胞凋亡是一個(gè)“瀑布式”基因表達(dá)過程，根據(jù)所起的作用將參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因分為促凋亡基因和抑制凋亡基因。以bcl-2為代表的抑制凋亡的因子和以bax為代表的促進(jìn)調(diào)往因子共同決定了大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡情況。白20世紀(jì)80年代中期起，對細(xì)胞凋亡的研究日益蓬勃發(fā)展起來，所涉及的領(lǐng)域也越來越廣泛。2002年，諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎(jiǎng)授予了在細(xì)胞凋亡的研究中有卓越貢獻(xiàn)的三位科學(xué)家。此后的10余年，諸多研究人員對細(xì)胞凋亡現(xiàn)象進(jìn)行了全面的研究探索，并取得了一定的進(jìn)展。但對運(yùn)動刺激引起細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的研究還比較滯后。特別是運(yùn)動對骨骼肌細(xì)胞凋亡的研究更是不多見。endprint

本實(shí)驗(yàn)通過對不同年齡的對照組和運(yùn)動組大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測，來研究運(yùn)動、年齡兩個(gè)因素與骨骼肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系。機(jī)體的各種運(yùn)動都是依靠骨骼肌的收縮來完成的。骨骼肌是體內(nèi)含量最多的組織，約占體重的40%左右。哺乳動物的骨骼肌會隨著衰老而發(fā)生萎縮。細(xì)胞死亡的阻抑基因和啟動基因彼此相互作用，最終結(jié)果依賴于死亡因子與死亡抑制因子的比值。長時(shí)間中等強(qiáng)度的有氧運(yùn)動對骨骼肌細(xì)胞凋亡的影響，國內(nèi)外的研究基本都是針對廢用性肌萎縮、肌營養(yǎng)不良和肌肉失重等肌纖維損傷的情況而開展的。有研究證明：骨骼肌細(xì)胞凋亡是肌營養(yǎng)不良癥、肌廢用性萎縮以及心力衰竭病人運(yùn)動耐受力下降的原因。但通過進(jìn)行長期有氧運(yùn)動訓(xùn)練，可以明顯的減弱細(xì)胞凋亡的能力，從而延緩由于細(xì)胞凋亡增多而導(dǎo)致的廢用性肌萎縮。

如表1所示，各年齡段大鼠骨骼肌bcl-2的表達(dá)結(jié)果有顯著性差異。說明年齡對于大鼠肌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡有著至關(guān)重要的影響。對照組之間差異非常顯著（P<0.01），隨著年齡增長bcl-2的表達(dá)逐漸減弱。表2的對照組數(shù)據(jù)也表明：老年大鼠骨骼肌bax的表達(dá)顯著高于青年、中年組大鼠。說明年齡越大，肌細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)越多。這可以解釋衰老的大鼠骨骼肌萎縮老化、肌纖維減少等現(xiàn)象。關(guān)于增齡骨骼肌萎縮與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，國內(nèi)外的報(bào)道并不多見。Amie Dirks等對大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，老年大鼠腓腸肌細(xì)胞凋亡率比青年大鼠提高50%左右。這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。在運(yùn)動組中，bcl-2因子的表達(dá)在不同年齡段大鼠也有顯著性差異（P<0.05），但沒有對照組變化明顯。Bax的表達(dá)隨年齡增加而增加。且形成了顯著性差異（P<0.05）。這說明隨著年齡的增漲，老年大鼠細(xì)胞凋亡加速。但是運(yùn)動可以讓老年大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)可以延緩。

年齡的增漲促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞凋亡這一規(guī)律在青年、中年大鼠中并不適用。通過表1和表2的數(shù)據(jù)，可以看到青年、中年組大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)無顯著性差異。促凋亡因子bax在青年對照組的表達(dá)高于中年對照組。這可能是由于青年組大鼠處于生長發(fā)育期，新陳代謝活躍。促凋亡蛋白的活躍表達(dá)加快了青年組大鼠肌細(xì)胞的更新速率，適應(yīng)了青年組大鼠骨骼肌在增齡過程中的功能需求。而中年組大鼠骨骼肌的生長趨于穩(wěn)定，因此促凋亡因子的表達(dá)低于青年組，這也說明長期有氧運(yùn)動促進(jìn)了青年大鼠肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展。從一個(gè)側(cè)面反應(yīng)了中年大鼠的新陳代謝低于青年大鼠。本文推測，青年大鼠正處于生命旺盛、活動力極強(qiáng)的階段，長期有氧運(yùn)動促進(jìn)青年大鼠肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，使那些衰老退化、功能低下的細(xì)胞迅速清除出去；肌細(xì)胞凋亡率的增加同時(shí)引發(fā)衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)入肌細(xì)胞中，產(chǎn)生新的肌原纖維并對損傷的肌纖維進(jìn)行修復(fù)。

總之，有氧運(yùn)動加快了青年大鼠肌細(xì)胞的更新速率，使那些不能適應(yīng)機(jī)體運(yùn)動需要的細(xì)胞在競爭中選擇了凋亡的形式來結(jié)束生命，而那些強(qiáng)健的細(xì)胞則保留，滿足青年大鼠肌肉強(qiáng)健的生理需要。通過運(yùn)動干預(yù)，發(fā)現(xiàn)青年運(yùn)動組、中年運(yùn)動組大鼠骨骼肌促凋亡因子更加活躍，均高于同年齡段的對照組大鼠。提示有氧運(yùn)動加快了青年和中年大鼠骨骼肌新陳代謝。細(xì)胞凋亡是生物體細(xì)胞死亡的一種獨(dú)特方式，在骨骼肌生長發(fā)育過程中，細(xì)胞凋亡對肌細(xì)胞的數(shù)量、質(zhì)量均起到重要的調(diào)節(jié)作用。對于長期有氧運(yùn)動對于肌細(xì)胞的影響，李爽通過實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論：長期有氧運(yùn)動可以明顯誘導(dǎo)青年組大鼠骨骼肌發(fā)生細(xì)胞凋亡，從而加快了肌細(xì)胞的更新速率。運(yùn)動可以明顯抑制老年組大鼠細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展，從而延緩了由于白然增齡引發(fā)的肌纖維萎縮等現(xiàn)象的發(fā)生。這與本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)各組大鼠骨骼肌均存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。老年組大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象最為明顯。這可能是導(dǎo)致肌肉萎縮、肌細(xì)胞減少等衰老現(xiàn)象出現(xiàn)的原因之一。青年組大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡情況比中年組大鼠明顯，這可能是青年組大鼠新陳代謝旺盛所導(dǎo)致的。

年齡和有氧運(yùn)動的交互結(jié)果證明，中等強(qiáng)度的有氧運(yùn)動可以促進(jìn)中青年雌性大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，使機(jī)體肌肉保持在較高的新陳代謝水平上。同時(shí)可以有效延緩增齡導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡率上升，從而延緩骨骼肌萎縮的趨勢。

本實(shí)驗(yàn)采用的大鼠均是自然增齡的樣本，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果對于人也有借鑒意義。基于實(shí)驗(yàn)結(jié)論，建議各年齡段的人均可以采取中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動的方式來進(jìn)行強(qiáng)身健體。特別是老年人，適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動能夠增強(qiáng)肌肉功能，提高肌肉能力。

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