張鳳娟，曹佳培，王鵬，穆淑梅，康現(xiàn)江

（河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北省動物系統(tǒng)學(xué)與應(yīng)用重點實驗室，河北 保定 071002）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）蛻皮抑制激素（molt－inhibiting－h(huán)ormone，MIH）屬于甲殼動物高血糖激素家族（crustacean hyperglycemic hormone family）神經(jīng)肽.該家族的激素包括：高血糖激素（crustacean hy－perglycemic hormone，CHH）、蛻皮抑制激素、性腺抑制激素（gonad－inhibiting hormone，GIH）、大顎器抑制激素（mandibular organ－inhibiting hormone，MOIH）.這些激素均包含6個半胱氨酸殘基，形成3個鏈內(nèi)二硫鍵.由于其結(jié)構(gòu)相似，它們也具有交叉的生物學(xué)功能［1－4］.這些激素產(chǎn)生于眼柄的端髓X 器（medulla terminalis X－organ，MT－XO）或無眼柄甲殼類前腦相應(yīng)的位置，釋放到竇腺，進入血淋巴系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)甲殼類許多重要的生理過程［5－6］.

MIH 通過與蛻皮激素（ecdysone）相互作用調(diào)節(jié)甲殼動物蛻皮進程［7］.以前的研究認為MIH 只在甲殼動物的眼柄視上神經(jīng)節(jié)的X 器官中表達，但是具體在眼柄視上神經(jīng)節(jié)的哪幾種分泌細胞中表達尚且未知［8－9］.據(jù)報道，X 器官中，小神經(jīng)元細胞（直徑15～25μm）產(chǎn)生促色素細胞激素，而大神經(jīng)元細胞（直徑30～70μm）產(chǎn)生高血糖家族激素［3，10］.近年來研究發(fā)現(xiàn)，MIH 不僅在X 器官中有分布，而且在甲殼動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（胸神經(jīng)節(jié)、腹神經(jīng)節(jié)和腦）中也存在，但與眼柄中的MIH 相比，可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的MIH 發(fā)揮不同的作用［3，11］.

本實驗利用分子生物學(xué)與免疫組織化學(xué)技術(shù)，對中華絨螯蟹MIH 進行系統(tǒng)的研究，并對其在視上神經(jīng)節(jié)的分泌情況進行了具體的研究，可以為進一步研究其作用機制奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用中華絨螯蟹購自河北省白洋淀；新西蘭大白兔由河北大學(xué)實驗中心提供；pET－30a載體（TaKa－Ra）、表達菌株大腸桿菌Rosseta（DE3）為本實驗室保存.

1.2 方法

1.2.1 中華絨螯蟹MIH 蛋白的表達與純化

按照姚燕等［12］的研究方法獲得中華絨螯蟹的MIH 基因，并構(gòu)建表達載體，構(gòu)建好的表達載體命名為pET－30a－MIH.

將pET－30a－MIH 質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌Rosseta（DE3）感受態(tài)細胞，37 ℃，200r／min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6左右時，用0.5mmol／L IPTG 誘導(dǎo)表達4h，超聲破碎后，離心收集沉淀，用8mol／L 的尿素溶解2h，12 000r／min 4 ℃離心20 min，取其上清液用鎳柱進行純化，純化后的蛋白用體積分數(shù)為12%的SDSPAGE檢測.

1.2.2 多克隆抗體的制備及特異性檢測

按照常規(guī)方法制備兔抗多克隆抗體，在注射蛋白時，每次注射抗原2.0mg，間隔7～10d，注射4次；獲得免疫血清.利用雙向免疫擴散法檢測抗體效價.用western blot法對血清的特異性進行檢測，其中實驗組以融合蛋白為抗原，以MIH 抗血清為一抗，而對照組以免疫前血清代替一抗，具體操作步驟按常規(guī)western blot法進行.

1.2.3 MIH 在視上神經(jīng)節(jié)分布的免疫組織化學(xué)研究

解剖處于蛻皮間期的中華絨螯蟹眼柄置于布氏固定液（未加冰醋酸）中，4 ℃固定過夜，梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，進行連續(xù)切片，切片厚度為6μm，50 ℃烤片；常規(guī)脫蠟至水，用體積分數(shù)為3%的H2O2處理7～10min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶.蒸餾水浸泡沖洗.用檸檬酸緩沖液（pH 6.0），采用微波修復(fù)法修復(fù)抗原.用質(zhì)量分數(shù)為5%的BSA 室溫孵育30min.一抗（MIH 抗血清）4 ℃過夜孵育，對照組用PBS代替一抗進行孵育.PBS浸洗3次，每次5min，在樣品上滴加抗兔生物素化二抗，37 ℃孵育20min，PBS洗掉二抗.加上SABC 37 ℃孵育20min，PBS沖洗SABC.滴加DAB顯色液，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，梯度脫水至二甲苯，中性樹膠封片.顯微觀察拍照.

2 結(jié)果

2.1 MIH 基因克隆結(jié)果

質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果在250bp處有特異性條帶（圖1），與預(yù)期大小（243bp）相符合.測序發(fā)現(xiàn)該片段與中華絨螯蟹蛻皮抑制激素成熟肽序列一致.

2.2 pET－30a－MIH 質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

構(gòu)建好的PET－30a－MIH 經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測在250bp處有目的條帶（圖2），表明表達載體構(gòu)建成功且讀碼框正確.

圖1 MIH 基因克隆結(jié)果Fig.1 Result of MIH cloning

圖2 重組質(zhì)粒PET－30a－MIH 雙酶切電泳結(jié)果Fig.2 Enzyme digestion result of PET－30a－MIH recombinant plasmid

2.3 融合蛋白的表達與純化

將帶有pET－30a－MIH 質(zhì)粒的表達菌株Rosseta（DE3）經(jīng)誘導(dǎo)后用體積分數(shù)為12%的SDS－PAGE 電泳檢測，在14.3ku與20.1ku之間有一特異條帶（圖3）.SDS－PAGE檢測融合蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中，溶解后的包涵體蛋白用鎳柱進行純化，得到較高純度的目的蛋白（圖4）.

圖3 融合蛋白在大腸桿菌中的表達Fig.3 Expression of fusion protein in E.coli

圖4 融合蛋白鎳柱純化結(jié)果Fig.4 Purification of fusion protein using Ni－Resin

2.4 多克隆抗體效價及特異性的檢測

多克隆抗體經(jīng)雙向免疫擴散測定其效價為1:32（圖5）.用MIH 抗血清對融合蛋白進行免疫印跡分析，在14.3～20.1ku內(nèi)有1特異條帶，而對照組沒有，表明其特異性較高（圖6）.

圖6 融合蛋白western blot結(jié)果Fig.6 Western blot result of the fusion protein

2.5 MIH 在視上神經(jīng)節(jié)的免疫組織化學(xué)定位

康現(xiàn)江等［13］將中華絨螯蟹視上神經(jīng)節(jié)分泌細胞分為5種類型，本實驗發(fā)現(xiàn)端髓中的細胞類型1（ct）、細胞類型3（ct3）和細胞類型4（ct4）的核周圍呈陽性反應(yīng)，這表明ct1，ct3，ct4參與了MIH 的分泌（圖7）.而陰性對照中均無陽性反應(yīng).

端髓中的ct1細胞核周圍呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，由于MIH 在視上神經(jīng)節(jié)中的合成和儲存量很低，所以并不是所有的ct1細胞核周圍均呈陽性反應(yīng)（圖7a）.ct3細胞核周圍呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，由于切片方向不同，所以細胞核沒有完全呈現(xiàn)，但是依據(jù)其位置和核大小確定其為ct3（圖7a）.ct4周圍呈陽性反應(yīng)，故其也參與了MIH的分泌（圖7c）.

圖7 端髓中分泌MIH 的細胞免疫陽性反應(yīng)（bar＝50μm）Fig.7 Immune positive reaction of cells in medulla terminalia

在中華絨螯蟹視上神經(jīng)節(jié)的端髓與內(nèi)髓交界處發(fā)現(xiàn)ct2細胞核周圍呈現(xiàn)陽性反應(yīng)（圖8a），同時在竇腺（SG）處也呈現(xiàn)免疫陽性反應(yīng)（圖8c）.

圖8 端髓與內(nèi)髓交界及竇腺免疫陽性反應(yīng)Fig.8 Immune positive reaction in SG and the edge of medulla terminalia

3 討論

中華絨螯蟹視上神經(jīng)節(jié)由外髓、內(nèi)髓和端髓組成，神經(jīng)分泌細胞主要集中分布在端髓，端髓在視神經(jīng)節(jié)中體積最大，有大量神經(jīng)分泌細胞分布.竇腺位于端髓與內(nèi)髓交界偏端髓處，由神經(jīng)分泌細胞軸突末端聚集而成，神經(jīng)分泌細胞分泌的激素可暫時儲存于此，之后排出運輸至血液.中華絨螯蟹MIH 由眼柄視上神經(jīng)節(jié)中的X－器官分泌，與蛻皮激素共同調(diào)節(jié)著中華絨螯蟹的蛻皮周期［14－18］.中華絨螯蟹MIH 基因成熟肽編碼區(qū)含有228bp，編碼75個氨基酸殘基［19］，姚燕等［12］制備了中華絨螯蟹MIH 鼠抗抗體，并對抗體進行了效價的檢測，但并未進行后續(xù)實驗的研究.

康現(xiàn)江等［13］將中華絨螯蟹視上神經(jīng)節(jié)分泌細胞分為5種類型，在本實驗中，除細胞類型5之外，其他類型的細胞均具有陽性反應(yīng)，證明細胞類型1、細胞類型2、細胞類型3和細胞類型4均參與了MIH 的分泌.MIH 在端髓細胞中分布，此結(jié)果與不同物種中MIH 的分泌位置的研究一致［20－21］.Gu等［22］研究發(fā)現(xiàn)，刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）中，MIH 在眼柄的分泌位置是端髓X－器官，但是，在其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，例如胸神經(jīng)節(jié)、腹神經(jīng)節(jié)中均無MIH 分泌.然而，在遠海梭子蟹（Portunus pelagicus）中，MIH 不僅分布于眼柄中，在胸神經(jīng)節(jié)、腹神經(jīng)節(jié)等中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也有分布［3］.而在中華絨螯蟹中，除了眼柄以外的中樞神經(jīng)系統(tǒng)是否分泌MIH 還不得而知，這也是今后的研究目標.在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，在沒有細胞核分布的區(qū)域也有呈現(xiàn)陽性反應(yīng)的，有可能是MIH 經(jīng)這些分泌細胞的軸突或結(jié)締組織被運往竇腺暫時儲存或釋放.此結(jié)果與Stewart等的研究結(jié)果相符［3］.

本實驗研究了MIH 在眼柄中的分泌位置，為甲殼動物內(nèi)分泌的研究提供新的資料，同時為解決蝦蟹類的早熟問題提供參考.

［1］ NAKATSUJI T，LEE C Y ，WATSON R D.Crustacean molt－inhibiting hormone：structure，function，and cellular mode of action［J］.Comp Biochem Phy A，2009，152（2）：139－148.

［2］ WEBSTER S G，KELLER R，DIRCKSEN H.The CHH－superfamily of multifunctional peptide hormones controlling crustacean metabolism，osmoregulation，moulting，and reproduction［J］.Gen Comp Endocr，2012，175（2）：217－233.

［3］ STEWART M J，STEWART P，SROYRAYA M.Cloning of the crustacean hyperglycemic hormone and evidence for molt－inhibiting hormone within the central nervous system of the blue crab Portunus pelagicus［J］.Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol，2013，164（2）：276－290.

［4］ 焦?jié)M靜，曹佳培，陳勤娜，等.莠去津?qū)χ腥A絨螯蟹蛻皮激素分泌的影響［J］.河北大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2013，33（2）：181－184. JIAO Manjing，CAO Jiapei，CHEN Qinna，et al.Effects of atrazine on ecdyson secretion in Eriocheir sinensis［J］.Journal of Hebei University：Natural Science Edition，2013，33（2）：181－184.

［5］ COVI J A，CHANG E S，MYKLES D L.Conserved role of cyclic nucleotides in the regulation of ecdysteroidogenesis by the crustacean molting gland［J］.Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol，2009，152（4）：470－477.

［6］ MYKLES D L，ADAMS M E，GADE G，et al.Neuropeptide action in insects and Crustaceans［J］.Physiol Biochem Zool，2010，83（5）：836－846.

［7］ 康現(xiàn)江，溫秀榮，穆淑梅，等.中華絨螯蟹高血糖素的分離及其功能初探［J］.河北大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2007，27（1）：68－73.KANG Xianjiang，WEN Xiurong，MU Shumei，et al.Extraction and function of hyperglycemic hormone in Eriocheir sinensis［J］.Journal of Hebei University：Natural Science Edition，2007，27（1）：68－73.

［8］ SKINNER D M.Molting and regeneration［J］.The Biology of Crustacea，1985，9（43）：144－146.

［9］ HOPKONS P M.The eyes have it：a brief history of crustacean neuroendocrinology［J］.Gen Comp Endocrinol，2012，175：357－366.

［10］ LEE K J，WATSON R D.Antipeptide antibodies for detecting crab（Callinectes sapidus）molt－inhibiting hormone［J］.Peptides，2002，23：853－862.

［11］ YODMUANG S，UDOMKIT A，TREETRATTRAKOOL S，et al.Molecular and biological characterization of molt－inhibiting hormone of Penaeus monodon［J］.J Exp Mar Biol Ecol，2004，312：101－114.

［12］ 姚燕，周開亞，宋大祥.中華絨螯蟹蛻皮抑制激素基因的表達及抗體制備［J］.動物學(xué)報，2006，52（1）：209－214.YAO Yan，ZHOU Kaiya，SONG Daxiang.Expression and polyclonal antibody preparation of molt inhibiting hormone 1（MIH l）from the mitten crab（Eriocheir sinensis）［J］.Acta Zoologica Sinica，2006，52（1）：209－214.

［13］ 康現(xiàn)江，米婭，孫輝建，等.中華絨鰲蟹眼柄神經(jīng)內(nèi)分泌結(jié)構(gòu)的研究Ⅰ.神經(jīng)分泌細胞的種類與分布［C］∥動物學(xué)專輯—上海市動物學(xué)會1997年會議論文集.上海：華東師范大學(xué)出版社，1998：22－26.

［14］ CHAN S M，GU P L，CHU K H，et al.Crustacean neuropeptide genes of the CHH／MIH／GIH family：implications from molecular studies［J］.Gen Comp Endocr，2003，134（3）：214－219.

［15］ REDDY P R，REDDY P S.Isolation of peptide hormones with pleiotropic activities in the freshwater crab［J］.Aquaculture，2006，259（1）：424－431.

［16］ GU P L，YU K L，CHAN S M.Molecular characterization of an additional shrimp hyperglycemic hormone：cDNA cloning，gene organization，expression and biological assay of recombinant proteins［J］.FEBS letters，2000，472（1）：122－128.

［17］ TIU S CHAN S M.The use of recombinant protein and RNA interference approaches to study the reproductive functions of a gonad‐stimulating hormone from the shrimp Metapenaeus ensis［J］.Febs Journal，2007，274（17）：4385－4395.

［18］ TSUTSUI N，OHIRA T，KAWAZOE I，et al.Purification of sinus gland peptides having vitellogenesis－inhibiting activity from the whiteleg shrimp Litopenaeus vannamei［J］.Marine Biotechnology，2007，9（3）：360－369.

［19］ ZHANG Yichen，SUN Yan，LIU Yichen，et al.Molt－inhibiting hormone from Chinese mitten crab：Cloning，tissue expression and effects of recombinant peptide on ecdysteroid secretion of YOs［J］.Gen Comp Endocr，2011，173（3）：467－474.

［20］ LEE K J，WATSON R D.Antipeptide antibodies for detecting crab（Callinectes sapidus）molt－inhibiting hormone［J］.Peptides，2002，23（5）：853－862.

［21］ GU，P L，TOBE，S S，CHOW，B K，et al.Characterization of an additional molt inhibiting hormone－like neuropeptide from the shrimp（Metapenaeus ensis）［J］.Peptides，2002，23（11）：1875－1883.

［22］ GU P L，CHU K H，CHAN S M.Bacterial expression of the shrimp molt－inhibiting hormone（MIH）：antibody production，immunocytochemical study and biological assay［J］.Cell Tissue Res，2001，303（1）：129－136.