焦巖，常影，余世鋒，孫曉宏，宋春麗（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006）

大果沙棘總黃酮體外抗氧化和抑菌作用研究

焦巖，常影，余世鋒，孫曉宏，宋春麗
（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006）

摘要：研究大果沙棘總黃酮的體外抗氧化和抑菌活性。采用DPPH和ABTS自由基清除率檢測(cè)大果沙棘總黃酮體外抗氧化活性；通過測(cè)定抑菌圈直徑和最低抑菌濃度檢測(cè)大果沙棘總黃酮的抑菌作用。100μg/mL的大果沙棘總黃酮對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除率分別為65.1%和92.3%，接近蘆丁和兒茶素對(duì)照品；抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示：0.125mg/mL～1.0mg/mL的大果沙棘總黃酮對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有顯著的抑菌效果。

關(guān)鍵詞：大果沙棘總黃酮；抗氧化；抑菌活性

人體新陳代謝以及體內(nèi)外環(huán)境包括呼吸（氧化反應(yīng)）、外界污染、放射線照射等因素不斷的在人體體內(nèi)產(chǎn)生自由基。近年來，隨著對(duì)自由基研究的深入，人體中的活性氧和自由基被認(rèn)為是引發(fā)衰老、癌變和細(xì)胞損傷的主要原因。因此，減少自由基對(duì)機(jī)體的傷害可以減少多種疾病的發(fā)生[1]。天然植物中含有多種活性成分，與合成藥物相比，天然活性成分相對(duì)安全、副作用小。近年來研究表明，植物多酚、黃酮、多糖、甾醇、生物堿等活性成分都有抗氧化和抑菌作用[2]。

沙棘（Hippophaerhamnoides L.）為胡頹子科（Elaeagnaceae）酸刺屬植物。沙棘中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，果實(shí)中黃酮含量為309mg/100 g～945mg/100 g。研究表明，沙棘總黃酮類具有具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌抗病毒、增強(qiáng)人體的耐受性、降血脂等多種作用[3-5]。因此，在本研究中，通過考察大果沙棘總黃酮的體外抗氧化和抑菌作用，為開發(fā)和利用天然黃酮類功能食品和抗菌瘤藥物提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

大果沙棘果渣：黑龍江省孫吳縣林業(yè)局提供。

菌種：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）：黑龍江省微生物研究所。

試劑：蘆丁、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH（1，1-dipheny1-2-picrylhydra-zyl）、ABTS[2，2'-amino-di（2-ethylbenzothiazoline sulphonic acid-6）ammonium salt]：美國Sigma公司；牛肉膏、蛋白胨：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉、瓊脂、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

756PC型紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；PHS-25數(shù)顯pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；培養(yǎng)箱：Thermo Forma公司；顯微鏡：Nikon公司；SWCJ-IF超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；TDL-5臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3方法

1.3.1大果沙棘果渣總黃酮提取純化

首先用超臨界CO2萃取設(shè)備將大果沙棘果渣脫脂。然后用75%的乙醇做溶劑，將脫脂后的大果沙棘果渣粉以10∶1（mL/g）液固比進(jìn)行3次超聲波輔助提取，將提取得到的黃酮液經(jīng)離心、過濾、濃縮、除去乙醇得到大果沙棘果渣黃酮溶液[6]。將黃酮溶液用X-5大孔樹脂層析柱進(jìn)行純化[7]，純化后真空凍干得橙黃色固體粉末，采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[8]進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)測(cè)定分離前后大果沙棘總黃酮純度分別為11.9%和34.1%。使用前配置成一定濃度的黃酮溶液進(jìn)行體外抗氧化和抑菌試驗(yàn)。

1.3.2大果沙棘總黃酮對(duì)DPPH·自由基清除效果[9]

DPPH溶液配制：準(zhǔn)確稱取20mgDPPH，用無水乙醇溶解并定容至250mL。

分別吸取10mg/mL～100mg/mL的純化前后的大果沙棘總黃酮溶液和蘆丁、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品溶液2.0mL于具塞試管中（分2組），向其中一組加入DPPH溶液至2mL，搖勻30min后，用無水乙醇做參比在517 nm波長下測(cè)吸光度，即為Ai；同時(shí)測(cè)定2mLDPPH溶液與2m L無水乙醇混合后的吸光度，即為Ac；向另一組中加入無水乙醇至2mL，混合后測(cè)其吸光度，即為Aj。根據(jù)下式計(jì)算清除率K：K/%=（1-（Ai-Aj）/Ac）×100。

1.3.3大果沙棘總黃酮清除ABTS+自由基的活力測(cè)定[10]

將5m L的7mmol/LABTS和88μL的140mmol/L過硫酸鉀混合，在室溫、避光的條件下靜置過夜，形成ABTS+自由基儲(chǔ)備液。該儲(chǔ)備液在室溫、避光的條件下穩(wěn)定。使用前用無水乙醇稀釋成工作液，要求其在30℃、734 nm波長下的吸光度為0.7±0.02。

取100μL不同濃度的大果沙棘總黃酮及對(duì)照品溶液，加入2mLABTS+溶液，準(zhǔn)確振蕩30 s，在20℃下測(cè)定反應(yīng)液在734 nm處6min內(nèi)的吸光值變化。

抑制率/%=A0-（At-B）/A0×100（t=6min）其中，A0為未加樣品的ABTS+的吸光值；At為樣品與ABTS+反應(yīng)后的吸光值；B為樣品空白的吸光值。

1.3.4大果沙棘總黃酮的抑菌活性

1.3.4.1菌懸液的制備

在無菌環(huán)境下，將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌接種于培養(yǎng)瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24 h，然后置于10mL 0.9%的生理鹽水的試管中，振蕩搖勻，1/10系列稀釋至含菌量為106CFU/mL～108CFU/mL的菌懸液。

1.3.4.2濾紙片法測(cè)定大果沙棘總黃酮的抑菌作用

將定性濾紙用打孔器制成直徑為9 mm的小圓片，高壓滅菌后，分別浸入沙棘總黃酮、無菌水中30min。用無菌移液管吸取0.2mL菌懸液，加入到制備好的固體平板培養(yǎng)基中，用刮鏟將菌懸液涂勻。用無菌鑷子鑷取含有黃酮的濾紙片平鋪在培養(yǎng)基表面上，每皿呈十字鋪4片，每個(gè)濃度重復(fù)3次。并且用浸有無菌水的濾紙片作為空白對(duì)照。貼好濾紙片后的平板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，即37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定其抑菌圈直徑，取其平均值[11]。

1.3.5大果沙棘總黃酮的最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

在無菌操作條件下，分別將含有濃度為0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、2.5、3.0mg/mL的沙棘總黃酮的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板中加入0.2m L菌懸液，涂布均勻，以無菌水為空白對(duì)照，在相應(yīng)條件下，即置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，每個(gè)濃度做平行試驗(yàn)3次。以不長菌的最低濃度作為該黃酮的最低抑菌濃度（MIC）[12]。

2　結(jié)果

2.1大果沙棘總黃酮對(duì)DPPH·自由基清除效果

大果沙棘總黃酮對(duì)DPPH·自由基清除效果見圖1和表1。

圖1　清除DPPH·自由基能力的測(cè)定Fig.1　Themensuration ofDPPH·free radical-scavenging activity

表1大果沙棘總黃酮清除DPPH·自由基的IC50Table 1　IC50valuesof DPPH·free radical-scavenging activity

由圖1可知看出，在濃度為20μg/mL～100μg/mL時(shí)，大沙棘總黃酮顯示出較好的清除DPPH·自由基能力，100μg/mL時(shí)，純化前后黃酮對(duì)DPPH·自由基的清除率分別為49.7%和65.1%，IC50值分別為81.13μg/mL 和64.4μg/mL。在相同濃度條件下，純化后黃酮對(duì)DPPH·自由基的清除率比粗提物高，但比蘆丁和兒茶素都低，兒茶素最高。

2.2大果沙棘總黃酮對(duì)ABTS+自由基的除效果

大果沙棘總黃酮對(duì)ABTS+自由基清除效果見圖2和表2。

圖2　不同樣品對(duì)ABTS+自由基清除力的比較Fig.2　Themensuration of ABTS+free radical-scavenging activity

表2　大果沙棘總黃酮清除ABTS+自由基的IC50Table 2　IC50valuesof ABTS+free radical-scavenging activity

當(dāng)濃度在20μg/mL～60μg/mL范圍時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增加，4種樣品清除ABTS+自由基清除能力明顯提高，ABTS+自由基清除能力大小為兒茶素對(duì)照＞盧丁＞純化黃酮＞粗提黃酮。但是當(dāng)濃度大于60μg/mL時(shí)，純化黃酮的ABTS+自由基清除能力略大于蘆丁，但始終小于兒茶素。ABTS+的清除能力大小依次為兒茶素＞蘆?。炯兓簏S酮＞粗黃酮，100μg/mL時(shí)，純化前后黃酮對(duì)ABTS+自由基的清除率分別為80.1%和92.3%，IC50值分別為42.45μg/mL和30.76μg/mL。

2.3大果沙棘總黃酮的抑菌結(jié)果

2.3.1大果沙棘總黃酮的抑菌活性

大果沙棘總黃酮的抑菌活性見表3。

表3　大果沙棘總黃酮對(duì)試驗(yàn)菌的抑制效果Table 3　Bacteria inhibition zoneof different concentration of flavonoids

由表3可知不同濃度的大果沙棘總黃酮對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑菌效果，抑菌圈直徑分別為：14.38、13.25、12.75mm。由此可見，大果沙棘黃酮具有顯著的抑菌活性，對(duì)不同菌種抑制作用大小依次為：大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌。

2.3.2大果沙棘總黃酮的最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定結(jié)果

不同濃度大果沙棘總黃酮的抑菌結(jié)果見表4。

表4　不同濃度大果沙棘總黃酮對(duì)試驗(yàn)菌的最低抑菌濃度Table4　M inimum inhibitory concentration（M IC）of flavonoids

最低抑菌濃度（MIC）是測(cè)量抗菌藥物的抗菌活性指標(biāo)，指在體外培養(yǎng)18 h～24 h后能抑制培養(yǎng)基內(nèi)病原菌生長的最低藥物濃度。由表4可以得出結(jié)論，大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.5mg/mL；枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度為1.0mg/mL；金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為1.0mg/mL。

3　結(jié)論

1）抗氧化研究表明，100μg/m L的大果沙棘總黃酮對(duì)DPPH·自由基的清除率分別為49.7%和65.1%，IC50值分別為81.13μg/mL和64.4μg/mL；對(duì)ABTS+自由基的清除率分別為80.1%和92.3%，IC50值分別為42.45μg/mL和30.76μg/mL。其抗氧化能力接近蘆丁和兒茶素對(duì)照品。說明大果沙棘總黃酮的純度和其抗氧化活性存在著顯著的量效關(guān)系，通過和黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比也進(jìn)一步證實(shí)了大果沙棘總黃酮的體外抗氧化作用。

2）通過抑菌試驗(yàn)，得出大果沙棘總黃酮對(duì)3種常見危害菌大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制效果，抑菌效果大小依次為大腸桿菌>枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌。

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.004

收稿日期：2014-03-14

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳項(xiàng)目（12521593）

作者簡介：焦巖（1981—），男（漢），副教授，博士，研究方向：生物活性物質(zhì)與功能食品。

Study on the An tioxidant and Antibacterial Activities in Vitro of Seabuck thorn Flavonoids

JIAOYan，CHANGYing，YUShi-feng，SUNXiao-hong，SONGChun-li
（1.College of Food and Biological Engineering，Qiqihar University，Qiqihar161006，Heilongjiang，China；2.Key LaboratoryofProcessing Agricultural ProductsofHeilongjiang Province，Qiqihar University，Qiqihar 161006，Heilongjiang，China）

Abstract：The study was purported to research on the antioxidant activities in vitro and antibacterial activities ofseabuckthorn flavonoids.The capacitiesof eliminating 1，1-dipheny1-2-picrylhydra-zyl（DPPH·）and the 2，2'-amino-di（2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6）ammonium salt（ABTS+）were assayed compared with the standard sample of rutin and catechin controls.The antibacterial activities were studied through the detemination of the antibacterial circle diameter and minimum inhibitory concentration.The seabuckthorn flavonoids in 100μg/mL had a capacitiesof eliminating DPPH·and ABTS+at the percentages of 65.1%and 92.3%，respectively，approximate to the rutin and catechin at the same concentration and the antibacterial studies showed strong antibacterialeffectagainst Escherichia coli，Staphylococcusaureus and Bacillus subtilis.

Keywords：seabuckthorn flavonoids；antioxidation；antibacterial