李曉晶，于鴻，謝進(jìn)（廣州市疾病預(yù)防控制中心，廣東廣州510440）

快速液相色譜法測(cè)定龜苓膏中綠原酸和蘆丁

李曉晶，于鴻，謝進(jìn)
（廣州市疾病預(yù)防控制中心，廣東廣州510440）

摘要：建立高分離度快速液相色譜RRLC法同時(shí)測(cè)定龜苓膏中綠原酸、蘆丁的方法。采用采用ZORBAXSB-C18柱（150mm×4.6mm，1.8μm），乙腈-0.4%磷酸水溶液為流動(dòng)相的梯度洗脫模式分離各測(cè)定組分，采用可變波長(zhǎng)的方式測(cè)定相應(yīng)組分的峰面積并計(jì)算樣品含量。綠原酸和蘆丁分別在0.009 42μg～0.471μg（r=0.999 9）和0.000 85μg～0.044 25μg（r=0.999 8）范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系；且平均加樣回收率分別為101.77%（RSD=1.2%，n=6）和99.84% （RSD=1.4%，n=6）；重復(fù)性試驗(yàn)，2個(gè)成分含量的RSD均小于2.0%（n=6）。

關(guān)鍵詞：龜苓膏；綠原酸；蘆??；高分離度快速液相色譜

龜苓膏是龜板、金銀花、槐花、地黃、土茯苓、茵陳、火麻仁、甘草等藥味組成，臨床用于虛火煩躁，口舌生瘡，津虧便秘，熱淋白濁，赤白帶下，皮膚瘙癢，癤腫瘡瘍等[1]。綠原酸和蘆丁作為龜苓膏中主要藥材金銀花和槐花的特征有效成分，具有廣泛的抗菌消炎、利膽、止血及增高白血球數(shù)量的作用[2]。目前針對(duì)蘆丁和綠原酸的測(cè)定國(guó)家已出臺(tái)了相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T22250-2008《保健食品中綠原酸的測(cè)定》），其中蘆丁的測(cè)定方法為紫外分光光度法、綠原酸的含量為高效液相色譜法[3-5]。為有效控制龜苓膏的質(zhì)量，筆者通過(guò)相應(yīng)的方法學(xué)考察建立了以高分離度快速液相色譜RRLC法同時(shí)測(cè)定龜苓膏中綠原酸和蘆丁2個(gè)指標(biāo)成分含量的方法。結(jié)果表明，所建立方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于龜苓膏的質(zhì)量控制。

1　儀器與試藥

1.1儀器

安捷倫1200型高分離度快速效液相色譜儀（RRLC），包括G1314-SL型二級(jí)管陣列檢測(cè)器（安捷倫科技有限公司，美國(guó)）；METTLER TOLEDO AG245型電子分析天平、METTLER TOLEDO XP26型電子分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司，德國(guó)）；BRANSONB5510E-MT型超聲儀（必能信超聲有限公司，美國(guó)）。

1.2試藥

龜苓膏6個(gè)批次，生產(chǎn)廠家及自編號(hào)分別為：東莞市正膏坊龜苓膏有限公司，自編號(hào)1201、1202；廣西梧州雙錢實(shí)業(yè)有限公司，自編號(hào)1203、1204；廣州潘高壽天然保健品有限公司，自編號(hào)1205、1206。綠原酸對(duì)照品（批號(hào)110753-200413）和蘆丁對(duì)照品（批號(hào)11080-200707，含量90.5%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純；水為超純水；甲醇和磷酸為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，1.8μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脫條件見(jiàn)表1；檢測(cè)波長(zhǎng)，采用可變波長(zhǎng)分別測(cè)定綠原酸327 nm，蘆丁257 nm，見(jiàn)表1；流速1mL/min，柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：各2μL。

表1　梯度洗脫條件及相應(yīng)的檢測(cè)波長(zhǎng)

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品貯備液

取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥12 h以上的綠原酸和蘆丁各2mg，精密稱定，置10mL棕色量瓶中，加流動(dòng)相制成綠原酸濃度為235.5μg/mL和蘆丁濃度為221.25μg/mL的混合對(duì)照品貯備液。

2.2.2混合對(duì)照品溶液

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品貯備液1mL，置5mL棕色量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，即得。

2.2.3供試品溶液

取本品，研細(xì)，取約15 g，精密稱定，置50mL棕色量瓶中，加流動(dòng)相40mL，超聲處理30min，放冷，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4陰性對(duì)照溶液

分別取按處方工藝制備的不含金銀花、槐花的陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.3方法學(xué)考察和樣品測(cè)定

2.3.1系統(tǒng)適用性及專屬性考察

分別吸取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖。結(jié)果，供試品樣品中綠原酸、和蘆丁均與雜質(zhì)峰完全分離，綠原酸和蘆丁的理論板數(shù)均不低于3 000，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1　龜苓膏中綠原酸和蘆丁的色譜圖Fig.1　The chrom atogram of chlorogenic acid and rutin in Guiling Paste

2.3.2線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品貯備液6份各1.00mL，分別置50、25、10、5、2、1mL棕色量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰峰面積。以進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得綠原酸和蘆丁的回歸方程分別為Y=20.380 6X-15.019 3（r=0.999 9）和Y=13.523 7X+ 2.780 8（r=0.999 8）。結(jié)果表明綠原酸在0.009 42μg～0.471μg和蘆丁在0.000 85μg～0.044 25μg范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸和蘆丁的RSD%分別為1.26%及1.06%。表明儀器精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別于0、2、5、10、15、24 h進(jìn)樣2μL，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸和蘆丁的RSD%分別為1.48%及0.83%。表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5重復(fù)性試驗(yàn)

取供試品（自編號(hào)：1201）適量，勻漿，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，綠原酸和蘆丁的平均含量分別為14.732mg/kg和5.262 g/kg，RSD分別為1.83%和0.98%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.6加樣回收率試驗(yàn)

取同一批樣品（自編號(hào)：1201）6份，每份約7.5 g，置50 mL棕色量瓶中，分別精密加入含綠原酸0.115 67mg/mL和蘆丁0.040 32mg/mL的混合溶液各1.00m L，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，綠原酸平均回收率為101.77%，RSD為1.2%；蘆丁的平均回收率為99.84%，RSD為1.4%。表明該方法回收率良好。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　綠原酸和蘆丁加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab le2　The recoveriesof chlorogenic acid and rutin

2.3.7樣品測(cè)定

取本品，研細(xì)，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法以峰面積計(jì)算樣品中各測(cè)定成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=6）Table 3　The content resultsofsamples

3　結(jié)論與討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

經(jīng)DAD掃描（波長(zhǎng)200 nm～400 nm），確定綠原酸和蘆丁各自的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為327 nm及257 nm。結(jié)果，在相應(yīng)的測(cè)定波長(zhǎng)條件下，2種成分均具有理想的響應(yīng)值，且重復(fù)性良好。

3.2流動(dòng)相的選擇

因待測(cè)定組分綠原酸呈顯弱酸性，所以選擇有機(jī)相-酸水溶液做流動(dòng)相，當(dāng)選擇甲醇（A）-醋酸水溶液（B）作流動(dòng)相時(shí)，由于甲醇的黏度較大，在改變洗脫梯度時(shí)，整個(gè)系統(tǒng)的壓力會(huì)明顯升高，且基線波動(dòng)較大；而選擇乙腈（A）-醋酸水溶液（B）作流動(dòng)相時(shí)，基線波動(dòng)較大；最后，選擇乙腈（A）-磷酸水溶液（B）作流動(dòng)相時(shí)，得到了較滿意的色譜圖，經(jīng)過(guò)比較，發(fā)現(xiàn)采用乙腈（A）-0.4%的磷酸溶液（B）作流動(dòng)相，并按本文的梯度比例洗脫時(shí)，色譜圖的分離效果理想，保留時(shí)間適宜。

3.3小結(jié)

本方法對(duì)3個(gè)廠家6批龜苓膏中綠原酸和蘆丁2種成分進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果表明本方法能夠在同一色譜條件下測(cè)定龜苓膏中主要成分的含量，有利于控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

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[5]時(shí)維靜,李立順,陸鳳琪,等.可見(jiàn)及紫外分光光度法測(cè)定中藥復(fù)方總黃酮的比較[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,18(6):1071-1073

DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.041

收稿日期：2015-03-23

作者簡(jiǎn)介：李曉晶（1982—），女（漢），主管技師，碩士，主要從事食品衛(wèi)生檢驗(yàn)工作。

RRLC Simultaneous Determ ination of Ch lorogenic Acid and Rutin in Guiling Paste

LIXiao-jing，YUHong，XIE Jin
（Guangzhou Centers for DiseaseControland Prevention，Guangzhou 510440，Guangdong，China）

Abstract：To establish a RRLCmethod ofsimultaneously determining the contentof chlorogenic acid and rutin in Guiling Paste.Sampleswere separated by ZORBAX SB-C18column（150mm×4.6mm，1.8μm）.Acetonitrile -0.4%phosphoric acid wasmobile phasewith both a gradientelutionmode and a variable detectingwavelength in order to determine the concentration of the respective components simultaneously.Chlorogenic Acid and Rutin all had good linearity in the rangesof0.009 42μg-0.471μg（r=0.999 9）and 0.000 85μg-0.044 25μg（r=0.999 8），correspondingly.The average recoverieswere 101.77%（RSD=1.2%，n=6）；and 99.84%（RSD=1.4%，n=6），respectively.Repeatability experiments presented that RSD valuesof their contentswere less than 2.0%.

Keywords：Guiling Paste；chlorogenic acid；rutin；RRLC