高曉東

甘肅省中醫(yī)院血液凈化中心（蘭州 730050）

小RNA干擾對氟他胺耐受性前列腺癌細胞LNCaP端粒酶活性的影響機制研究

高曉東

甘肅省中醫(yī)院血液凈化中心（蘭州 730050）

目的 探討hTERT基因的兩端各三個堿基硫代修飾反義寡核苷酸（AS PS-ODN）對氟他胺耐受性前列腺癌細胞LNCaP端粒酶活性的影響機制。方法 采用TRAP-PCR- ELISA 法檢測氟他胺耐受性前列腺癌細胞的端粒酶活性；采用RT-PCR方法檢測hTERT基因mRNA 的表達水平；以免疫組化通過流式細胞儀檢測hTERT基因蛋白水平的變化。結(jié)果 hTERT基因的兩端各三個堿基硫代修飾反義寡核苷酸（AS PS-ODN）作用于LNCaP細胞48h，其端粒酶活性下降，作用72h，其端粒酶活性受到抑制。結(jié)論 通過hTERT基因的兩端各三個堿基硫代修飾反義寡核苷酸（AS PS-ODN）特異性抑制hTERT基因mRNA 的表達降低氟他胺耐受性前列腺癌細胞LNCaP端粒酶活性，為氟他胺耐受性前列腺腫瘤的基因治療提供新思路。

端粒， 末端轉(zhuǎn)移酶； 寡核苷酸類， 反義； 人類端粒酶催化亞單位； 前列腺腫瘤

前列腺癌是男性癌癥死亡的主要原因之一。雄激素阻斷療法是治療晚期前列腺癌的主要方法。這種方法在治療雄激素依賴性前列腺癌非常有效。然而，這種惡性腫瘤最終會成為雄激素非依賴性，抗雄激素藥物逐漸失去作用，對于雄激素非依賴性前列腺癌的治療，目前沒有一個行之有效的方法，是臨床上最棘手的問題之一。如何有效治療雄激素非依賴性前列腺癌成為目前醫(yī)學研究的重點之一。端粒酶是目前發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤特異性標志，與腫瘤細胞的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切［1］。人類端粒酶主要由3部分組成：人類端粒酶RNA成分（hTR）、人類端粒酶相關(guān)蛋白（TEP1）和人類端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶催化亞單位 （hTERT）。hTR的功能是為染色體端粒延伸起模板作用，hTERT是其活性表達的關(guān)鍵組分和限速因子［2］。Yoo等［3］克隆了hTERT核酸序列，并發(fā)現(xiàn)針對模板序列（5'-CUAACCCUAAC-3'）的反義寡核苷酸可抑制其模板作用，從而抑制端粒酶活性。研究表明，良性前列腺增生組織中未發(fā)現(xiàn)端粒酶活性表達，而雄激素非依賴性前列腺癌表現(xiàn)出高水平的端粒酶活性，表明端粒酶激活與雄激素非依賴型前列腺癌發(fā)生過程關(guān)系密切，是雄激素非依賴性前列腺癌治療的新靶點［3］。近年來有研究表明，抑制hTERT的表達活性會破壞腫瘤細胞對DNA雙鍵斷裂的反應(yīng)，影響整個染色體的形態(tài)［4］，達到對腫瘤細胞增生的抑制作用。我們曾經(jīng)通過研究hTERT基因的全硫代修飾反義寡核苷酸（AS PS-ODN）對膀胱癌細胞T24端粒酶活性的影響。本實驗通過研究hTERT基因的兩端各三個堿基硫代修飾反義寡核苷酸（AS PS-ODN）對氟他胺耐受性前列腺癌細胞LNCaP端粒酶活性的影響，探討端粒酶活性的抑制機理，為氟他胺耐受性前列腺癌尋找新的基因治療方法提供體外實驗依據(jù)。

材料與方法

一、材料

（一）主要試劑

PMBI-1640培養(yǎng)粉為北京天為時代科技有限公司產(chǎn)品，胎小牛血清為蘭州民海生物制品公司產(chǎn)品，端粒酶檢測試劑盒購自南京凱基生物公司，Trizol RNA提取試劑盒及RT-PCR試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)公司，hTERT蛋白抗體和異硫氰酸熒光素標記的兔抗羊免疫球蛋白為北京中山生物制品公司產(chǎn)品。

（二）引物合成

根據(jù)hTERT基因mRNA的序列分析，設(shè)計出互補于起始密碼子的反義片段共20個堿基長度作用的靶序列。hTERT AS PS-ODN的序列為5'-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3'，S PS-ODN的序列為5'-CCCGCGATGCCGCGCGCTCC-3'，每一條鏈進行兩端各三個堿基硫代修飾，由北京賽百勝生物制品公司合成，純化，分裝。hTERT上游引物為5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3'；下游引物為5'-GGATGAAGCGCAGTCTGGA-3'。內(nèi)對照β-肌動蛋白（β-actin）基因上游引物為5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'；下游引物為5'-GTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，均由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。

（三）細胞培養(yǎng)

LNCaP細胞株由蘭州大學第二醫(yī)院泌尿研究所惠贈。采用含100mL/L胎小牛血清（60℃滅活3 min）、100 u/mL青霉素和100 u/mL鏈霉素的PMBI-1640培養(yǎng)基，在37℃、50mL/LCO2飽和濕度條件下，LNCaP細胞含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。氟他胺用無水乙醇溶解后加入磷酸鹽緩沖液（PBS，常規(guī)培養(yǎng)于pH7.2）至氟他胺終濃度為10-4mol/L儲存。LNCaP加入氟他胺至終濃度為10-7mol/L后連續(xù)培養(yǎng)80代，使之成為氟他胺耐受性前列腺癌細胞LNCaP-flu［5］，實驗選用對數(shù)生長期細胞。

二、方法

（一）hTERT

AS PS-ODN 最適作用濃度的選擇 實驗分為AS PS-ODN組（實驗組）、S PS-ODN組及空白對照組。采用24孔培養(yǎng)板，每組接種3孔，每孔接種1×105細胞。寡核苷酸濃度分為4組，第1天向培養(yǎng)液中分別加入5，10，15，20μmol/L，第2，3天追加原劑量的一半；空白對照組加入相同量的培養(yǎng)液。觀察時間為24，48，72h。采用臺盼藍拒染法計數(shù)細胞，并收集細胞進行端粒酶活性檢測，得出最適作用濃度（SPS-ODN作用濃度與之相同）。

（二）端粒酶活性檢測

實驗分為AS PS-ODN組、S PS-ODN組及空白對照組。采用24孔培養(yǎng)板，每組接種3孔，每孔接種1×105細胞。采用TRAP-PCR-ELISA法檢測端粒酶活性，按試劑盒說明書操作。用最適濃度10μmol/L的ODN處理后，收集寡核苷酸處理不同時間的LNCaP細胞（24 h，48 h，72 h），用PBS洗滌細胞2次，加入1mL冰冷的Wash buffer，置冰上5 min，4℃離心（19 000×g， 5 min）；棄上清后加入40 μL冰冷的Lysis buffer，置冰上30 min 4℃離心（19 000×g， 30 min）；離心后上清測定其蛋白濃度至5～10 μg/mL。取5μL PCR擴增產(chǎn)物，加入20μL變性試劑，置室溫孵育10 min，加入225 混合液，（含地高辛標記的檢測抗體），混勻后轉(zhuǎn)100μL混合液于抗生物素包被的微孔板上，37℃雜交2h，加入過氧化物酶偶聯(lián)的地高辛抗體（anti-DIG-POD）100μL，室溫孵育30 min。最后加入過氧化物酶底物四甲基對氨基聯(lián)苯（TMB）孵育10min，加入終止液終止反應(yīng)。測定450nm和655nm吸光度（A）值。

（三）采用RT-PCR方法檢測hTERT基因mRNA的表達水平

實驗分為AS PS-ODN組、S PS-ODN組及空白對照組。用最適濃度10μmol//L的ODN處理后，收集寡核苷酸處理不同時間的LNCaP細胞（24 h，48 h），用Trizol RNA提取試劑盒提取總RNA，按照MMLV一步法RT-PCR試劑盒的操作步驟進行RT-PCR檢測。EP管中加入RT-PCR buffer 25μL，模板RNA 1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，M-MuLV RT1μL，加入無菌雙蒸水至50μL。以β-actin 作為內(nèi)對照進行PCR擴增。PCR條件：1循環(huán)：37～40℃ cDNA 合成30min；38循環(huán)：94℃變形15s，60℃退火30s，72℃延伸1min；1循環(huán)： 72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物在15g/L瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠分析儀分析結(jié)果。

（四）流式細胞儀測定hTERT基因蛋白的表達水平

收集寡核苷酸處理不同時間的LNCaP細胞（24 h，48 h，72 h）1×105，在4℃、70mL/L的乙醇液中固定15 min，加入含10ml/L的吐溫-20穿透緩沖液洗2次，加入hTERT基因抗體50μL，4℃孵育1h， 緩沖液洗2次，加入異硫氰酸熒光素標記的兔抗羊免疫球蛋白50μL，4℃孵育30min， 緩沖液洗2次，置流式細胞儀上檢測。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、AS PS-ODN對氟他胺耐受性前列腺癌LNCaP細胞端粒酶活性的影響

TRAP-PCR-ELISA法結(jié)果顯示，與S PS-ODN組及空白對照組相比，實驗組加入AS PS-ODN 48 h后，LNCaP細胞端粒酶活性明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 3組對氟它胺耐受性前列腺癌LNCaP細胞端粒酶活性的影響比較

二、AS PS-ODN對氟他胺耐受性前列腺癌LNCaP細胞hTERT基因mRNA的影響

RT-PCR法結(jié)果顯示，AS PS-ODN作用于LNCaP細胞24， 48h， hTERT基因mRNA 相對表達量分別與S PS-ODN組及空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 3組對氟它胺耐受性前列腺癌LNCaP細胞hTERT基因mRNA的影響比較（）

表1 3組對氟它胺耐受性前列腺癌LNCaP細胞hTERT基因mRNA的影響比較（）

與AS PS-ODN組相比，*為P＜0.05

時間（h）24 48空白對照組 0.68±0.16* 0.75±0.28* AS PS-ODN組 0.60±0.10 0.58±0.12 S PS-ODN組 0.27±0.0* 0.05±0.0*

三、AS PS-ODN對氟他胺耐受性前列腺癌LNCaP細胞hTERT基因蛋白表達水平的影響

流式細胞儀測定結(jié)果顯示，AS PS-ODN作用于LNCaP細胞24， 48h，72h后， hTERT基因蛋白表達的陽性細胞的百分率分別與S PS-ODN組及空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2，圖2）。

圖2 AS PS-ODN作用于氟它胺耐受性前列腺癌LNCaP細胞48h，72h后，熒光顯微鏡下hTERT基因蛋白表達水平A： AS PS-ODN作用48 h（40×）； B： AS PS-ODN作用72 h（40×）

表2 3組對氟它胺耐受性前列腺癌LNCaP細胞hTERT基因蛋白表達水平的影響比

表2 3組對氟它胺耐受性前列腺癌LNCaP細胞hTERT基因蛋白表達水平的影響比

與AS PS-ODN組比較，*為P＜0.05

時間（h）24 48 72空白對照組 85.30±4.60 86.65±5.0 84.85±2.25 AS PS-ODN組 86.80±5.10 85.50±2.88 85.40±4.72 _S PS-ODN組 82.41±2.34 70.25±4.55* 43.15±5.20*

討 論

有關(guān)文獻報道，90%以上的氟他胺耐受性前列腺癌表達端粒酶活性［6］，因而抑制端粒酶活性具有對氟他胺耐受性前列腺癌基因治療的應(yīng)用前景［7］。目前研究報道［8］，hTERT基因mRNA在氟他胺耐受性前列腺癌各種癌細胞株及腫瘤組織中表現(xiàn)出高水平的表達，與本實驗結(jié)果相符。

反義技術(shù)的基本原理就是根據(jù)堿基互補原則，用人工合成或生物體表達的特定互補的DNA或RNA片段（反義核酸）以抑制或封閉專一靶基因表達的技術(shù)。本實驗采用兩端各三個堿基硫代修飾反義核酸。硫代是指硫元素代替磷酸基團自由氧，是目前反義核酸應(yīng)用研究最多的一種修飾，可以增強反義核酸的穩(wěn)定性，提高反義核酸對核酸酶的耐受性，使其藥物半衰期增加10倍，同時增強反義核酸對腫瘤細胞的親核性，從而使反義核酸更容易進入腫瘤細胞核內(nèi)發(fā)揮其抗腫瘤作用。

本實驗端粒酶活性檢測結(jié)果表明，hTERT AS PSODN 作用48 h 后， LNCaP細胞端粒酶活性明顯下降，作用48 h 后， LNCaP細胞端粒酶活性明顯受到抑制。S PS-ODN處理24h， 48h， 72h，LNCaP細胞端粒酶活性無明顯變化。RT-PCR結(jié)果顯示，hTERT AS PS-ODN 作用24 h 后， hTERT基因mRNA表達水平下降，作用48h 后，hTERT基因mRNA表達水平明顯下降。S PS-ODN處理24h，48h，LNCaP細胞hTERT基因mRNA表達水平無變化。流式細胞儀測定結(jié)果顯示，AS PS-ODN作用于LNCaP細胞24， 48h，72h后，hTERT基因蛋白表達的陽性細胞的百分率明顯下降，S PS-ODN作用于LNCaP細胞24， 48h，72h后， hTERT基因蛋白表達的陽性細胞的百分率無變化。以上結(jié)果表明，hTERT AS PS-ODN可在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上影響hTERT基因的表達。

AS PS-ODN與目的基因mRNA通過堿基互補結(jié)合，從而與處于不同時期的mRNA雜交，阻止RNA加工，成熟，出核，影響核糖體結(jié)合或沿mRNA移動，同時激活RNase H，剪切雜交鏈中未配對堿基，特異性分解RNA-DNA雜交鏈中的RNA鏈。本實驗采用Antisense原理，這與文獻報道的有關(guān)反義核酸作用的研究一致［9，10］。實驗還證明，兩端各三個堿基部分硫代堿基穩(wěn)定性已很理想，與hTERT基因的全硫代修飾反義寡核苷酸實驗結(jié)果一致。

總之，hTERT AS PS-ODN通過降低hTERT mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達抑制氟他胺耐受性前列腺癌LNCaP細胞端粒酶的活性，從而為氟他胺耐受性前列腺腫瘤的基因治療提供了新的思路。

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（2014-07-07收稿）

Effects of hTERT mRNA antisense on telomerase activity in utamide insensistive prostate cancer cells LNCaP in vitro

Gao Xiaodong
The Traditional Chinese Medicine Hospital of Gansu Province， Lanzhou 730050， China

Objective To investigate the effects of hTERT antisense oligodeoxynucleotide on telomerase activity in utamide insensistive prostate cancer cells （LNCaP）. Methods Telomerase activity was measured by Telomerase PCR ELISA kit. hTERT mRNA expression was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） assay，and hTERT protein expression by immunohistochemistry and flow cytometry. Results The telomerase activity was decreased after LNCaP cells were treated with AS PS-ODN for 48 h， and it was evidently inhibited after 72 h intervention. Conclusion AS PS-ODN could signi cantly inhibit the telomerase activity in utamide insensistive prostate cancer cells.

telomerase； oligodeoxynucleotide， antisense； human telomerase reverse transcriptase； prostatic neoplasms

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.07.004

R 737.25