譚力力，劉麗敏，李 潞，趙紅麗

(沈陽醫(yī)學(xué)院 沈洲醫(yī)院 1.心血管一科， 遼寧 沈陽 110035； 2.干診二科， 遼寧 沈陽 110000)

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研究論文

曲美他嗪和/或瑞舒伐他汀改善心肌梗死大鼠的心功能損傷

譚力力1，劉麗敏2*，李 潞1，趙紅麗1

(沈陽醫(yī)學(xué)院 沈洲醫(yī)院 1.心血管一科， 遼寧 沈陽 110035； 2.干診二科， 遼寧 沈陽 110000)

目的探討曲美他嗪和瑞舒伐他汀對(duì)心肌梗死(MI)的心臟保護(hù)作用。方法結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支建立大鼠MI模型。大鼠分為假手術(shù)組、MI組、曲美他嗪+MI組、瑞舒伐他汀+MI組、聯(lián)合用藥+MI組。MI之后每天給予藥物治療14 d。測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。TUNEL染色檢測(cè)凋亡指數(shù)。Evans/TTC雙染色測(cè)定心肌梗死面積。Western blot測(cè)定Bcl-2和Bax表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)比較，MI大鼠LVSP、dP/dTmax及dP/dTmin均顯著降低(P<0.01)，LVEDP顯著性升高(P<0.01)。與MI組比較，曲美他嗪+ MI組、瑞舒伐他汀+ MI組和聯(lián)合用藥+ MI組的LVSP、dP/dTmax及dP/dTmin均顯著增加，LVEDP呈顯著性下降(P<0.05)。假手術(shù)組心肌中未見明顯心肌細(xì)胞凋亡。MI組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著上升，且Bcl-2和Bax表達(dá)也有顯著增加，以Bax表達(dá)增加為主。藥物干預(yù)后，與MI組相比，心肌細(xì)胞凋亡顯著下降，Bcl-2與Bax表達(dá)均明顯下降，以Bax下降為主(P<0.05)，上述變化以聯(lián)合用藥組+ MI最明顯。結(jié)論心肌梗死后曲美他嗪和瑞舒伐他汀治療可以改善心功能，可能與抑制心肌細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2表達(dá)有關(guān)。兩者聯(lián)合給藥療效更佳。

心肌梗死；凋亡；曲美他嗪；瑞舒伐他汀

心肌梗死指由于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成或冠狀動(dòng)脈痙攣等導(dǎo)致心肌血供下降，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的過程，是臨床心內(nèi)科常見病、多發(fā)病。

他汀類藥物又稱為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A(HMG-COA)還原酶抑制劑。HMG-COA 還原酶是膽固醇合成代謝中的關(guān)鍵限速酶，瑞舒伐他汀可競(jìng)爭(zhēng)性抑制該酶的作用，使膽固醇合成減少，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)清除增加，并有降三酰甘油作用[1]。他汀類藥物目前已經(jīng)成為心梗患者治療的常用藥。曲美他嗪是第一個(gè)臨床用于治療冠心病的代謝藥物，具有抗缺血和抗心絞痛作用[2]。

本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠心肌IPC模型，觀察心肌IPC對(duì)梗死面積及凋亡相關(guān)基因Bcl-2/Bax表達(dá)的影響，以及曲美他嗪和瑞舒伐他汀對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量200 g，3～4月齡[北京維通麗華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證編號(hào)SCXK(京2012-0001)]。曲美他嗪[施維雅(天津)制藥有限公司]；瑞舒伐他汀(阿斯利康制藥有限公司)；Bax 試劑盒、Bcl-2試劑盒和TUNEL試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組：大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、MI組、MI+曲美他嗪(T)組、MI+瑞舒伐他汀(R)組和MI+T+R組，每組10只。假手術(shù)組大鼠行開胸術(shù)，分離冠狀動(dòng)脈但不阻斷。MI組大鼠同時(shí)行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎。MI+T組和MI+R組分別每天給予曲美他嗪20和10 mg/kg瑞舒伐他汀；MI+T+R組劑量減半，灌胃給藥，共14 d。

1.2.2 MI模型的建立：常規(guī)方法建立MI模型。

1.2.3 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定：常規(guī)記錄左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(dP/dTmax)及左室內(nèi)壓最大下降速率(dP/dTmin)。

1.2.4 心肌缺血面積及梗死面積測(cè)定：采用Evans/TTC雙染色法。切片顯示3種顏色，鉆紅色為正常心肌，藍(lán)色為梗死危險(xiǎn)區(qū)心肌，灰白色為梗死心肌。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，原位結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，80 mmHg壓力下經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌注1%的伊文思藍(lán) (2～3 mL)。摘除大血管、心房及右心室，沿左心室長(zhǎng)軸橫切心室為6～8片(厚約2mm)，然后仔細(xì)分離非缺血區(qū)和缺血區(qū)。將缺血區(qū)置于1% TTC磷酸緩沖液中，于37℃孵育15 min，此時(shí)壞死區(qū)呈灰白色，以此將壞死區(qū)從缺血區(qū)中分離，心肌梗死面積以壞死區(qū)心肌重量/缺血區(qū)心肌重量(AN/AAR)表示。

1.2.5 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotoc index,AI)：取適量全層心肌組織，按常規(guī)病理組織學(xué)方法制備心肌石蠟標(biāo)本，采用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL)檢測(cè)凋亡心肌細(xì)胞，按說明書操作。細(xì)胞系呈棕褐色或棕黃色顆粒且具備凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征判定為凋亡細(xì)胞。光鏡下根據(jù)凋亡陽性細(xì)胞分布情況，每張切片拍攝5個(gè)陽性視野，每視野計(jì)數(shù)300個(gè)心肌細(xì)胞中的凋亡陽性細(xì)胞數(shù)，以陽性細(xì)胞數(shù)所占觀察心肌細(xì)胞的比例作為凋亡指數(shù)，即心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(%)=(凋亡心肌細(xì)胞系數(shù)/正常心肌細(xì)胞系數(shù))×100%。每組計(jì)數(shù)25個(gè)陽性視野(每組5張切片，各取5個(gè)陽性視野)，取平均值。

1.2.6 HE染色觀察心肌細(xì)胞：將剩余梗死心肌組織置于40 g/L中性甲醛液中固定，經(jīng)石蠟包埋后，取心臟冠狀面最大橫徑處切片，連續(xù)切片3張(厚4 μm)，用于HE染色，以觀察組織的大致形態(tài)、心肌細(xì)胞走向及心肌纖維化程度、細(xì)胞形態(tài)學(xué)及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.2.7 Western blot測(cè)定Bcl-2和Bax表達(dá)：提取總蛋白質(zhì)并進(jìn)行定量。制膠，制備蛋白質(zhì)樣品并加樣，免疫印跡顯色，烤干保存硝酸纖維素濾膜或攝影，圖像分析儀測(cè)定條帶的吸光度值，并作定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況

大鼠在造模的過程中有一定的死亡，存活率為87.5%，主要死因?yàn)槁樽磉^量、大出血、惡性心律失常。

2.2 血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果

與假手術(shù)組比較，MI大鼠 LVSP、dP/dTmax及dP/dTmin均顯著降低，LVEDP顯著升高。與MI組比較，3個(gè)藥物干預(yù)組LVSP、dP/dTmax及 dP/dTmin均顯著提高，LVEDP顯著降低；上述指標(biāo)的改善以 MI+T+R組更明顯(表1)。

2.3 各組大鼠心肌缺血重量及梗死重量的變化

心肌梗死后，大鼠缺血心肌重量(AAR)、梗死心肌重量(AN)以及AAR/LV均顯著增加(與假手術(shù)組組比：P<0.01)。藥物干預(yù)后，AAR、AN、AAR/LV和AN/AAR均顯著降低(與MI組比：P<0.05)。此外，與MI+R組和MI+T組相比，MI+T+R組AAR、AN、AAR/LV和AN/AAR改善更顯著(P<0.05)(表2)。

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)

與假手術(shù)組相比，MI大鼠的心肌凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.01)，且陽性細(xì)胞呈灶性分布，尤其以MI組最多。當(dāng)給予不同藥物干預(yù)后，與MI組相比，凋亡細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，以MI+R+T組減少最為明顯(圖1，表3)。

2.5 HE染色檢測(cè)心肌纖維化

假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常，肌纖維排列致密、整齊，間質(zhì)成纖維細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)正常(圖2A)。MI組大鼠心肌纖維排列疏松，間質(zhì)成纖維細(xì)胞顯著增生，膠原纖維增生、變粗，并且將心肌細(xì)胞分割呈網(wǎng)篩狀，可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2B)。與MI組相比， MI+T組大鼠心肌纖維化程度顯著減輕，心肌細(xì)胞排列較為規(guī)整(圖2C)。與MI組相比，MI+R組大鼠心肌膠原成分顯明減少，排列較為規(guī)則(圖2D)。與MI組相比，MI+T+R組大鼠心肌膠原成分減少，但與假手術(shù)組大鼠相比仍存在纖維化改變(圖2E)。

表1 各組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Hemodynamic parameters of all groups

*P<0.01 compared with sham group；#P<0.01 compared with MI+R group or MI+T group(1 mmHg=0.133 kPa).

表2 各組大鼠心肌缺血重量和梗死重量比較Table 2 Myocardial ischemia weight and infarction weight of all groups

*P<0.01 compared with sham group；#P<0.01 compared with MI+R group or MI+T group.

A.sham; B.MI; C.MI+T; D.MI+R; E.MI+R+T圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞的TUNEL染色Fig 1 TUNEL stains in all groups (×400)

A.Sham; B.MI; C.MI+T; D.MI+R; E.MI+R+T圖2 各組大鼠治療后的心肌細(xì)胞HE染色Fig 2 HE stains after treatment in all groups (×400)

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)Table 3 Apoptosis index of all groups

*P<0.01 compared with sham group；#P<0.01 compared with MI+R group or MI+T group.

2.6 Western blot檢測(cè)Bcl-2和Bax表達(dá)

正常大鼠心肌中Bcl-2和Bax低表達(dá)或不表達(dá)。MI能顯著增加Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)(P<0.01)，以Bax蛋白表達(dá)增加為主，且MI組表達(dá)增加最明顯。給予大鼠藥物干預(yù)后，與MI組相比，Bcl-2與Bax表達(dá)均相應(yīng)降低(P<0.01)，以Bax減少為主。MI+R+T組與MI+R組和MI+T組相比，Bcl-2與Bax表達(dá)明顯下降(P<0.01)(圖3)。

3 討論

冠狀動(dòng)脈栓塞后的急性期，局部心肌出現(xiàn)微梗死灶，心肌細(xì)胞出現(xiàn)壞死和凋亡，凋亡相關(guān)基因Bcl-2/Bax表達(dá)也相應(yīng)增加，心功能呈進(jìn)行性下降[3]。

1.sham; 2.MI; 3.MI+T; 4.MI+R; 5.MI+R+T圖3 各組大鼠心肌中的Bcl-2和Bax表達(dá)Fig 3 Expression of Bcl-2 and Bax in all groups

表4 各組大鼠心肌中的Bcl-2和Bax表達(dá)Table 4 Expression of Bcl-2 and Bax in all groups

*P<0.01 compared with sham group；#P<0.01 compared with MI+R group or MI+T group.

本研究結(jié)果顯示，光鏡下，心肌梗死大鼠心肌梗死灶周圍區(qū)域可見凋亡細(xì)胞。給予藥物治療后，心肌梗死面積顯著縮小，凋亡細(xì)胞也明顯減少。血流動(dòng)力學(xué)方面，藥物治療后，大鼠反應(yīng)心臟收縮功能和左室收縮速率的指標(biāo)有所提高，而反應(yīng)心臟舒張功能的指標(biāo)有所下降，說明藥物治療可以減輕心臟的僵硬度。

目前，心肌梗死的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，通常認(rèn)為與氧自由基增加﹑鈣超載﹑中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、微血管損傷、細(xì)胞凋亡以及能量代謝障礙等有關(guān)[4]。離體和在體實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞凋亡是心肌梗死發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞凋亡的發(fā)生是由基因控制的，Bcl-2 家族[5]在細(xì)胞凋亡中起重要作用，其成員構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。Bcl-2在各種正常細(xì)胞發(fā)育過程中存在表達(dá)，而成熟和凋亡的細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)。Bax基因可能通過與Bcl-2基因本身或Bcl-2基因產(chǎn)物相互作用而發(fā)揮功能[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常大鼠心肌中Bcl-2和Bax低表達(dá)或不表達(dá)，而心肌梗死大鼠Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，以Bax蛋白表達(dá)增加為主。Bcl-2蛋白上調(diào)，從而其抑制心肌細(xì)胞凋亡的能力增加。給予藥物干預(yù)后，Bcl-2與Bax表達(dá)均相應(yīng)降低，以Bax減少為主，說明干預(yù)細(xì)胞凋亡主要以抑制Bax表達(dá)為主。

他汀類藥物又稱 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A(HMG-COA)還原酶抑制劑。HMG-COA 還原酶是膽固醇合成代謝中的關(guān)鍵限速酶，瑞舒伐他汀可競(jìng)爭(zhēng)性抑制該酶的作用，使膽固醇合成減少，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)清除增加，并有降三酰甘油作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，短期應(yīng)用瑞舒伐他汀對(duì)大鼠缺血心肌有保護(hù)作用，主要是通過激活磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B,Akt)信號(hào)通路，提高內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的活性，增加 NO來實(shí)現(xiàn)的[4]。

曲美他嗪[2,6]是第一個(gè)臨床用于治療冠心病的代謝藥物，具有抗缺血和抗心絞痛作用。曲美他嗪能抑制β-脂肪酸氧化，抑制心肌對(duì)脂肪酸的攝取，并增加葡萄糖的氧化，導(dǎo)致游離脂肪酸向葡萄糖氧化的心臟代謝轉(zhuǎn)換，從而改善心肌能量利用，增加線粒體氧化代謝，減輕細(xì)胞內(nèi)酸中毒及鈉、鈣堆積，預(yù)防氧自由基引起的心肌細(xì)胞損傷。

本實(shí)驗(yàn)顯示，給予瑞舒伐他汀和曲美他嗪干預(yù)后，心肌細(xì)胞AI、心肌血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及心肌纖維化程度均有一定的改善。同時(shí)，Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)減少，而以Bax表達(dá)減少為主。需指出的是，瑞舒伐他汀與曲美他嗪聯(lián)合用藥組效果最好。說明瑞舒伐他汀與曲美他嗪干預(yù)在抑制心肌細(xì)胞凋亡、抑制心肌纖維化、改善血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)等方面有協(xié)同作用。

綜上所述，心肌細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因Bcl-2和Bax的表達(dá)介導(dǎo)了心肌缺血再灌注損傷，瑞舒伐他汀和曲美他嗪治療減少了心肌細(xì)胞的凋亡，而曲美他嗪與瑞舒伐他汀的聯(lián)合應(yīng)用可顯著抑制Bax的表達(dá)，從而抑制心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡和改善血流動(dòng)力學(xué)。本研究的結(jié)果將為臨床防治心肌缺血再灌注損傷提供新的治療靶點(diǎn)。

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The effect of trimetazidine and/or rosuvastatin on improving the cardiac function damage of rats with myocardial infarction

TAN Li-li1,LIU Li-min2*,LI Lu1,ZHAO Hong-li1

(1.Dept.of Cardiology,the Shenzhou Hospital Affilicated to Shenyang Medical College,Shenyang 110035;2.Cadres Clinics,Shenyang Medical College,Shenyang 110000,China)

Objective To investigate the cardioprotection of trimetazidine and/or rosuvastatin in rats with myocardial infarction (MI).Methods MI was introduced to SD rats by ligating the left anterior descending coronary.Rats were randomly assigned into following groups:sham group,Mi group,trimetazidine (T)+ MI group,rosuvastatin (R)+ MI group and T+ R+ MI group.After treatment for 14 days,all groups’ hemodynamic parameters were measured.Apoptosis index (AI) was detected by TUNEL staining.The myocardial infarction area was measured by Evans/TTC staining.The expression of Bcl-2 and bax was determined by Western blot assay.Results When compared with sham group,the LVSP,dP/dTmax and dP/dTmin of MI rats significantly reduced (P<0.01),but LVEDP markedly increased (P<0.01).When compared with the MI group,the LVSP,dP/dTmax and dP/dTmin in the T+MI group,R+MI group and T+R+MI group significantly increased,and the LVEDP dramatically reduced (P<0.05).The apoptosis index in the MI group significantly increased accompanied by marked increase in the expression of Bcl-2 and Bax,especially the Bax when compared with sham group.After treatment with T and R,the apoptosis index reduced and the expression of Bcl-2 and Bax decreased significantly,mainly the Bax.The above changes were the most evident in the T+R+MI group.Conclusions Treatment with T and/or R can improve the heart function of MI rats,which may be attributed to the reduction in the apoptosis index and decrease in the expression of Bax and Bcl-2 in the myocardium.The cardioprotection is the most obvious after treatment with T and R suggesting the synergistic effect.

myocardial infarction; apoptosis; trimetazidine; rosuvastatin

2014-04-28

2014-12-03

沈陽市科技局科技支撐項(xiàng)目(2011F11-264-1-48)

*通信作者(corresponding author)：lmliu@126.com

1001-6325(2015)03-0355-05

R542.2

A