鄭 潔，羅 浩，王瑞輝，寇久社

(陜西中醫(yī)學(xué)院1.針灸推拿系;2.醫(yī)學(xué)技術(shù)系;3.第二附屬醫(yī)院 康復(fù)針灸科，陜西 咸陽712046)

近年發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素(aAdiponectin)在炎性反應(yīng)、軟骨退變以及軟骨下骨重塑等多個(gè)骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)病理過程中發(fā)揮了重要作用。青藤堿是從傳統(tǒng)治療風(fēng)濕性疾病中藥清風(fēng)藤中提取的一種生物堿，具有鎮(zhèn)痛、抗感染、調(diào)節(jié)免疫、降血壓、抗心律失常等藥理作用。我們前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿關(guān)節(jié)腔注射可緩解兔膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)滑膜炎性反應(yīng)、降低關(guān)節(jié)液內(nèi)脂素和抵抗素水平，對軟骨具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過觀察鹽酸青藤堿關(guān)節(jié)腔注射對木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的兔KOA 模型血清及關(guān)節(jié)液中脂聯(lián)素水平以及軟骨中脂聯(lián)素受體-1(Adipo-R1)和脂聯(lián)素受體-2 (Adipo-R1)的mRNA 和蛋白表達(dá)的影響，探討青藤堿治療KOA的部分作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑:新西蘭大白兔35 只(1.8～2.2 kg)，雌雄各半[西安交大醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號:SCXK(陜)2008-008]。脂聯(lián)素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(北京諾博萊科技有限公司)，Adipo-R1 和Adipo-R2 多克隆抗體(Abcam 公司)，RNA 提取和qPCR 反應(yīng)試劑盒(北京全式金公司)，正清風(fēng)痛寧注射液(湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組:實(shí)驗(yàn)分為對照組(control)、模型組(model)、透明質(zhì)酸鈉組(HA)和青藤堿組(SIN)，除空白組所有兔均采用木瓜蛋白酶注射法復(fù)制KOA 模型。根據(jù)成人用藥劑量按Meeh-Rubner 公式計(jì)算人兔等效劑量。除對照組外，對各組動(dòng)物造模側(cè)膝關(guān)節(jié)行關(guān)節(jié)腔注射，SIN 組膝關(guān)節(jié)腔注射鹽酸青藤堿注射液0.2 mL(5 mg)，每3 天1次，10次1療程，共給藥10次;HA組膝關(guān)節(jié)腔注射透明質(zhì)酸鈉注射液0.2 mL，每6 天1次，5次1 療程，共5次;模型組膝關(guān)節(jié)腔注射0.9%氯化鈉溶液0.2 mL，注射次數(shù)同HA組。干預(yù)時(shí)間共計(jì)30 d。

1.2.2 ELISA法檢測兔血清及關(guān)節(jié)液脂聯(lián)素含量:操作方法嚴(yán)格按著試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.3 qPCR 法檢測膝關(guān)節(jié)軟骨Adipo-R1 和Adipo-R2的mRNA表達(dá):按試劑盒說明提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。結(jié)果以2－ΔΔCT表示。

1.2.4 Western blot 法檢測膝關(guān)節(jié)軟骨Adipo-R1 和Adipo-R2的蛋白表達(dá):用RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA法測定其濃度和純度，取適量樣品進(jìn)行SDA-PAGE。Image J 軟件進(jìn)行灰度掃描。

2 結(jié)果

2.1 血清及關(guān)節(jié)沖洗液中脂聯(lián)素水平:模型組和HA組顯著高于空白組(P＜0.01);SIN 組明顯低于模型組(P＜0.01，P＜0.05)(表1)。

表1 血清及關(guān)節(jié)液脂聯(lián)素濃度Table1 Concentration of adiponectin in serum and synovium(μg/L)(±s)

表1 血清及關(guān)節(jié)液脂聯(lián)素濃度Table1 Concentration of adiponectin in serum and synovium(μg/L)(±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control;#P＜0.05，##P＜0.01 compared with model;ΔP＜0.05 compared with HA.

group n serum synovium fluid control 8 7.333±0.492 7.333±0.492 model 9 10.249±1.373＊＊ 10.249±1.373＊＊HA 9 9.889±0.673＊＊ 9.889±0.673＊＊SIN 9 8.593±0.793* ##Δ 8.593±0.793* #Δ

2.2 軟骨Adipo-R1 和Adipo-R2的mRNA 及蛋白表達(dá)情況:model 組Adipo-R1 顯著高于對照組(P＜0.05)，SIN 組和HA組明顯低于模型組(P＜0.05);模型組、HA組和SIN 組Adipo-R2 均顯著高于對照組(P＜0.01)(表2，圖1)。

表2 軟骨Adipo-R1、Adipo-R2 mRNA 及蛋白表達(dá)水平Table2 Expression of Adipo-R1 and Adipo-R2 in cartilage (±s，n=3)

表2 軟骨Adipo-R1、Adipo-R2 mRNA 及蛋白表達(dá)水平Table2 Expression of Adipo-R1 and Adipo-R2 in cartilage (±s，n=3)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control;#P＜0.05，##P＜0.01 compared with model.

group Adipo-R1 Adipo-R2 mRNA protein mRNA protein control 1.000±0.000 0.103±0.006 1.000±0.0000.293±0.007 model 2.709±0.883* 0.744±0.036* 5.795±0.225＊＊ 0.463±0.030＊＊HA 1.663±0.100# 0.397±0.005* ## 5.014±0.885＊＊ 0.431±0.010＊＊SIN 1.427±0.024# 0.350±0.006* ## 4.952±0.820＊＊ 0.458±0.009＊＊

圖1 軟骨Adipo-R1 和Adipo-R2的蛋白表達(dá)Fig1 Expression of Adipo-R1 and Adipo-R2 protein in cartilage

3 討論

脂聯(lián)素在OA 發(fā)病過程中不僅扮演了促炎因子的角色，還在后期軟骨基質(zhì)的降解中發(fā)揮了重要作用。OA 患者關(guān)節(jié)液脂聯(lián)素含量顯著升高，與白介素-6(interleukin-6，IL-6)水平呈正相關(guān)[1]。脂聯(lián)素主要是通過其受體Adipo-R1 和Adipo-R2 發(fā)揮作用，OA 患者軟骨損傷區(qū)Adipo-R1 和Adipo-R2表達(dá)顯著高于非損傷區(qū)[2]。青藤堿膝關(guān)節(jié)腔注射可降低KOA 兔關(guān)節(jié)液IL-1β 及PGE2 含量，對OA 軟骨具有保護(hù)作用[3]。

本實(shí)驗(yàn)ELISA 結(jié)果表明，青藤堿關(guān)節(jié)腔注射可顯著降低KOA 兔血清及關(guān)節(jié)液中升高的脂聯(lián)素水平。軟骨Adipo-R1和Adipo-R2 基因和蛋白表達(dá)檢測結(jié)果顯示，KOA 兔軟骨Adipo-R1 和Adipo-R2 均呈高表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，青藤堿關(guān)節(jié)腔注射可明顯下調(diào)Adipo-R1 在軟骨的表達(dá)，但對Adipo-R2的高表達(dá)無抑制作用。提示降低血清及關(guān)節(jié)液脂聯(lián)素含量以及下調(diào)Adipo-R1 在軟骨的表達(dá)可能是青藤堿關(guān)節(jié)腔注射治療OA的機(jī)制之一。

[1]Gross JB，Guillaume C，Gégout-Pottie P，et al.Synovial fluid levels of adipokines in osteoarthritis:Association with local factors of inflammation and cartilage maintenance[J].Biomed Mater Eng，2014，24:17-25.

[2]Kang EH，Lee YJ，Kim TK.et al.Adiponectin is a potential catabolic mediator in osteoarthritis cartilage[J].Arthritis Res Ther，2010，12:R231.

[3]吳紅娟，孫必強(qiáng)，朱傳湘，等.鹽酸青藤堿對家兔骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液IL-1β、PGE2 生成與關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30:84-86.