魏建峰

(徐州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)教研室，徐州 221004)

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研究論文

肌肽減輕H2O2誘導(dǎo)的N2a細胞損傷

魏建峰*

(徐州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)教研室，徐州 221004)

目的探究肌肽對H2O2誘導(dǎo)的N2a細胞損傷的保護作用及其機制。方法將N2a細胞分為對照組、損傷組(給予H2O2)和肌肽保護組(預(yù)先加入肌肽)。用相差顯微鏡觀察了細胞形態(tài)，用免疫熒光染色和免疫印跡實驗檢測細胞AKT1和FAS-L的蛋白表達。結(jié)果肌肽顯著增加了N2a細胞增殖能力(P<0.05)；與對照組比較，H2O2損傷組細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細胞皺縮，胞膜變厚并出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象；而肌肽保護組細胞形態(tài)較損傷組明顯改善；免疫熒光染色和免疫印跡實驗顯示，損傷組AKT1的表達顯著低于對照組，F(xiàn)AS-L的表達顯著高于對照組。 而肌肽保護組AKT1的表達顯著高于對照組，F(xiàn)AS-L的表達顯著低于對照組(P<0.05)。結(jié)論肌肽能夠減輕N2a細胞對H2O2誘導(dǎo)的細胞損傷。

N2a細胞; 肌肽; 氧化應(yīng)激損傷；AKT1；FAS-L

隨著對自由基研究的不斷深入，氧化應(yīng)激損傷和抗氧化保護作用理論越加受到關(guān)注，如Alzheimer’s病和衰老等均被公認是與氧化應(yīng)激損傷及自由基代謝異常有關(guān)[1]。肌肽是一種存在于動物體內(nèi)的具有抗衰老功能的肽類物質(zhì)[2]，它參與機體清除自由基和膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[3- 4]， 能抑制在神經(jīng)退行性紊亂和心血管缺血性損害中由醛誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)，DNA與DNA的交聯(lián)[5]。肌肽作為自然存在于機體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)，它能夠抑制細胞膜的過氧化過程，清除自由基，減輕有害物質(zhì)對DNA和蛋白質(zhì)等的損害。

小鼠神經(jīng)瘤母細胞(N2a細胞)在形態(tài)及結(jié)構(gòu)功能上與神經(jīng)元極其相似, 具有典型的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞特性，因此在國內(nèi)外廣為用作研究神經(jīng)細胞的模型。本研究以H2O2損傷的N2a細胞為氧化應(yīng)激模型, 探究肌肽對N2a細胞的保護作用, 為深入研究肌肽的抗氧化、神經(jīng)保護作用及其機制提供生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

N2a細胞(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院姜玉峰博士贈予)，多聚甲醛(Fluka公司)，鼠抗AKT1單克隆抗體(Santa Cruz公司)，兔抗FAS-L單克隆抗體、FITC-標記的山羊抗小鼠IgG和IIRP-標記的羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，β-actin單克隆抗體(Sigma公司)，ECL顯色液(Perbio公司)，DMEM、OPTI-MEM和胎牛血清(Gibco公司)，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組處理:細胞培養(yǎng)基為50% DMEM、50% OPTI-MEM、含5%熱滅活FBS。細胞于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。細胞增殖至70%～80%匯合時傳代或用于實驗。將增殖旺盛細胞重新懸浮鋪板，H2O2損傷組加入終濃度為0.68 mg/L H2O2；肌肽保護組制備同損傷組，提前1 h加入肌肽，終濃度0.45×103mg/L。在加入細胞前在多孔板中放入預(yù)先消毒的載玻片，用以制作細胞爬片。

1.2.2 細胞計數(shù):細胞接種12～24 h后加入肌肽，終濃度為0.45×103mg/L，對照組加入稀釋肌肽工作液。在加入肌肽后分別于12、24、36、48、60和72 h對細胞進行計數(shù)統(tǒng)計。

1.2.3 免疫熒光染色觀察AKT1和FAS-L表達:細胞爬片經(jīng)0.01 mol/L PBS清洗2～3次； 2% TritonX-100 15 min ；300 mg/L H2O220 min； 4%牛血清白蛋白37 ℃封閉30 min；鼠抗AKT1單克隆抗體/兔抗FAS-L單克隆抗體1∶200 4 ℃ 18 h，室溫6 h； 0.01 mol/L PBS清洗2～3次；FITC-標記的山羊抗小鼠IgG或IIRP-標記的羊抗兔IgG 1∶300, 室溫避光孵育2 h; 0.01 mol/L PBS清洗3次，每次15 min。甘油封片，熒光顯微鏡下觀察、攝片，用image J軟件對熒光圖片進行半定量分析。

1.2.4 Western-blot檢測AKT1和FAS-L表達:細胞蛋白提?。簵壟囵B(yǎng)液，用冷PBS洗細胞2次；置冰上；加4 ℃細胞裂解液，置冰上10～30 min；收集上清并轉(zhuǎn)入離心管，微波振蕩；4 ℃，20 000×g離心10 min；取上清-20 ℃保存待用。

蛋白印跡：取細胞總蛋白經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，蛋白恒壓轉(zhuǎn)入硝酸纖維膜上；5%牛奶封閉45 min，4% BSA封閉5 min；鼠抗AKT1單克隆抗體，1∶800/兔抗FAS-L單克隆抗體，1∶500，4 ℃，18 h；0.02 mol/L TBS(pH 7.4，含1% Tween- 20)洗膜3次，每次10 min；HRP標記的羊抗小鼠IgG/羊抗兔IgG，1∶3 000，室溫孵育2 h；同上洗膜3次；ECL顯色曝光后沖洗膠片。β-actin為內(nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 肌肽對N2a細胞增殖的影響2.1.1 肌肽加入后的細胞數(shù)量在不同檢測時間點均高于對照組：前期細胞增殖能力檢測發(fā)現(xiàn)在加入20 mmol/L濃度肌肽處增殖曲線出現(xiàn)了明顯的峰值，從而確定了肌肽的最佳加藥濃度。在檢測的各個不同時間點，加入20 mmol/L肌肽組的細胞數(shù)量均明顯高于對照組(P<0.05)(圖1)。

2.1.2 各組細胞的形態(tài)變化：H2O2損傷組與對照組相比較，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變：細胞皺縮變圓，變小，細胞膜變厚，出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，且細胞反光度差；而在肌肽保護組，細胞形態(tài)較損傷組明顯改善，發(fā)泡現(xiàn)象明顯減少，細胞反光度也較好(圖2)。

2.2 免疫熒光細胞染色

H2O2損傷組AKT1免疫反應(yīng)的綠色熒光強度顯著低于對照組，F(xiàn)AS-L的紅色熒光強度顯著高于對照組；而肌肽保護組AKT1免疫反應(yīng)的綠色熒光強度顯著高于H2O2損傷組，F(xiàn)AS-L的紅色熒光強度顯著低于H2O2損傷組(P<0.05)(圖3，4)。

*P<0.05 compared with control group圖1 肌肽加入后細胞數(shù)量隨時間變化曲線Fig 1 The number of cells change over time afteradding carnosine

2.3 Western blot

H2O2損傷組中AKT1的蛋白表達較與對照組明顯減少，F(xiàn)AS-L的蛋白表達較與對照組明顯增加；而肌肽保護組中AKT1的蛋白表達較與對照組明顯增加，F(xiàn)AS-L的蛋白表達較與對照組明顯減少(P<0.05)(圖5)。

3 討論

肌肽和其相關(guān)化合物是繼SOD, CAT, VE后體內(nèi)又一新的活躍自由基的清除劑。肌肽和相關(guān)多肽是肌肉和神經(jīng)組織的正常組份[6]，但是它們的生理功能仍然不是十分明確。據(jù)報道肌肽和相關(guān)多肽的抗氧化機制是抑制活性氧(ROS)，清除自由基和螯合金屬前氧化物[7]。肌肽和其相關(guān)化合物的生物活性，使這些多肽的潛在醫(yī)學(xué)用途倍受人們關(guān)注，例如在胃潰瘍，關(guān)節(jié)炎，腦卒中和活性氧引起的一些疾病中的可能治療作用[8]。

A. normal; B. H2O2; C. carnosine+H2O2圖2 各組細胞的形態(tài)變化Fig 2 Morphology of N2a cells in each group(×400)

圖3 AKT1和FAS-L的免疫細胞化學(xué)染色Fig 3 The expression of AKT1 and FAS-L shown by immunofluorescence(×200)

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05, compared with H2O2 group圖4 AKT1和FAS-L的免疫熒光吸光度半定量分析Fig 4 Immunofluorescence semi-quantitative analysisof the expression of AKT1 and FAS-L

AKT1和FAS-L是國際慣用評價細胞存活，生長狀態(tài)與損傷凋亡常用的檢測指標?；罨腁KT通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白, 進而調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等[9]。FAS受體與FAS配體(FAS-L)的交聯(lián)與信號傳導(dǎo)在誘發(fā)細胞凋亡、維持機體自身穩(wěn)定和保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用[10]。

H2O2是體內(nèi)氧化代謝的中間產(chǎn)物，是一種危害性很大的氧自由基，可以穿透細胞膜到達細胞內(nèi)，當(dāng)積累到一定程度時就會造成細胞的損傷[11]。預(yù)先加入肌肽的保護組，AKT1的表達較損傷組明顯增加， 而FAS-L較損傷組減少, 推測在胞外肌肽緩沖中和了一部分氧自由基，在胞內(nèi)肌肽除清除了一些進入細胞內(nèi)的氧自由基外，還可能使受損傷細胞有一定程度恢復(fù)。在損傷組，在沒有肌肽的保護下，自由基對細胞產(chǎn)生損害作用后，抑制AKT的磷酸化，同時增加了FAS-L的表達。

β-actin為內(nèi)對照;*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with H2O2 group圖5 AKT1和FAS-L在3組細胞中表達的Westernblot結(jié)果及其吸光度定量分析Fig 5 The expression and quantitative analysis ofAKT1 and FAS-L by Western blot

本實驗證明了肌肽對N2a細胞氧化應(yīng)激損傷具有明確的保護作用, 證實了肌肽對活性氧損害的神經(jīng)細胞具有保護作用，但除抗氧化作用外是否還有其他機制? 肌肽的生物學(xué)功能及其抗氧化衰老及對多種疾病的療效和作用機制還需要更深入的研究和探討。

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Carnosine Reduces H2O2-induced cellular injury of N2a Cells

WEI Jian-feng*

(Dept. of Histology and Embryology, Basic medical College of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, China)

Objective To investigate the protective effect of carnosine in oxidative stress induced by H2O2by N2a cells. Methods The N2a cells were divided into three groups: control; H2O2group; carnosine group: carnosine was used in advance. Cell morphology was observed by phase-contrast microscope; immunohistochemistry and Western blot were applied to detect expression of AKT1 and FAS-L. Results Carnosine significantly promoted cell proliferation. Compared with control group，cell morphology changed significantly, cell shrinkage, membrane thickened, foaming phenomenon in H2O2injury group; In the carnosine protection group, carnosine significantly inhibited the H2O2-induced cellular injury, cell morphology obviously better than H2O2group. Compared with the control group, the expression of the AKT1 down-regulated and FAS-L up-regulated in H2O2group, but in the carnosine protection group, the expression of the AKT1 was up-regulated and FAS-L down-regulated than H2O2group (P<0.05). Conclusions Carnosine obviously reduced H2O2-induced cellular injury of N2a cells.

N2a cell; carnosine; oxidative stress; AKT1; FAS-L

2015- 06- 11

2015- 09- 22

1001-6325(2015)11-1535-05

R741.02

A

*通信作者(corresponding author)：wjf@xzmc.edu.cn