劉清發(fā)，陳方方，劉 粉，李鴻佳，許文娟，孫啟晶，宮 冰，張才擎*

(1.山東大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 附屬千佛山醫(yī)院 呼吸內(nèi)科， 山東 濟(jì)南 250014； 2.泰山醫(yī)學(xué)院， 山東 泰安 271000；3.濰坊醫(yī)學(xué)院， 山東 濰坊 261053)

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研究論文

IL- 25在小鼠哮喘中通過Nuocyte細(xì)胞誘導(dǎo)Th2炎性細(xì)胞因子的表達(dá)

劉清發(fā)1，陳方方1，劉 粉1，李鴻佳1，許文娟2，孫啟晶1，宮 冰3，張才擎1*

(1.山東大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 附屬千佛山醫(yī)院 呼吸內(nèi)科， 山東 濟(jì)南 250014； 2.泰山醫(yī)學(xué)院， 山東 泰安 271000；3.濰坊醫(yī)學(xué)院， 山東 濰坊 261053)

目的研究哮喘氣道炎性因子IL- 25通過nuocyte細(xì)胞對Th2炎性細(xì)胞因子的影響。方法建立小鼠哮喘模型，分離并培養(yǎng)nuocyte細(xì)胞，將nuocyte細(xì)胞分為PBS對照組、IL- 25處理組、抗IL- 25組，體外給予IL- 25和抗IL- 25處理。ELISA方法檢測細(xì)胞上清液IL- 5和IL- 13的含量；Western blot檢測細(xì)胞IL- 5和IL- 13蛋白表達(dá)；RT-PCR檢測IL- 5和IL- 13 mRNA表達(dá)；流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測定nuocyte細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果IL- 25處理組nuocyte細(xì)胞IL- 5及IL- 13在蛋白和基因水平的表達(dá)均比對照組和抗IL- 25組IL- 5及IL- 13表達(dá)水平高(P<0.05)；IL- 25處理組nuocyte細(xì)胞數(shù)量高于對照組及抗IL- 25組(P<0.05)。結(jié)論IL- 25在小鼠哮喘中可通過nuocyte細(xì)胞誘導(dǎo)IL- 5和IL- 13的表達(dá)，促進(jìn)哮喘的發(fā)生和發(fā)展。

IL- 25；哮喘；nuocyte細(xì)胞；IL- 5；IL- 13

哮喘(asthma)使小氣道痙攣和黏液大量分泌，引起氣道狹窄和氣道高反應(yīng)。發(fā)病機(jī)制以Th1/Th2細(xì)胞比例失衡，激活CD4+TH2細(xì)胞釋放IL- 5和IL- 13為主的Th2型免疫應(yīng)答， 促使B細(xì)胞轉(zhuǎn)換為IgE分泌型細(xì)胞[1]。固有免疫細(xì)胞也可生成IL- 5和IL- 13等TH2型細(xì)胞因子，在Th2型免疫應(yīng)答的啟動可能發(fā)揮著重要作用[2]。IL- 25刺激小鼠引起IL- 5和IL- 13等細(xì)胞因子升高，引發(fā)強(qiáng)烈的Th2型免疫應(yīng)答[3]。

Nuocyte細(xì)胞是主要的固有免疫細(xì)胞之一，在細(xì)胞免疫應(yīng)答中起重要作用，近年來發(fā)現(xiàn) nuocyte細(xì)胞在細(xì)胞免疫應(yīng)答中能促使TH2型細(xì)胞因子的表達(dá)。在哮喘動物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)大量的nuocyte細(xì)胞的存在，該細(xì)胞表面IL- 25受體高表達(dá)。IL- 25與nuocyte在哮喘中作用機(jī)制如何？本研究旨在探討IL- 25和nuocyte對TH2型炎癥因子表達(dá)的影響，為哮喘治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1材料

雞清卵蛋白(OVA)(Sigma公司)；IL- 5抗體和IL- 13抗體(Abcam HongKong 公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗(北京中杉金橋生物科技公司)；蛋白內(nèi)參GAPDH(Ptglab公司)；GAPDH mRNA內(nèi)參(康偉世紀(jì)公司)；ICOS-FITC和ST1/ST2-PE流式細(xì)胞術(shù)用兔抗小鼠抗體(BD公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(中國碧云天生物技術(shù)研究所)；Trizol總RNA提取試劑、SuperQuickRT cDNA第一鏈合成試劑盒(For Real-time PCR)和UltraSYBR Mixture(with ROX)(康為世紀(jì)公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基和FCS(Gibco公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物:SPF級BALB/c雌性小鼠20只,6～8周，體質(zhì)量15～25 g[山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，動物合格證號：SCXR(魯)20090001號]，隨機(jī)雙盲將動物分為對照組及哮喘組，每組為10只。哮喘模型制備參照HONDA[4]方法制作。1.2.2 肺功能檢測:用5%的水合氯醛麻醉小鼠，氣管切開，套管針置入、固定，將小鼠放入密閉的箱子中，連接管道，機(jī)械通氣參數(shù)：呼吸頻率為90次/min,潮氣量5.6 mL/kg。呼吸壓力為-8 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)，記錄跨肺壓、流速，潮氣量容積的變化，用計(jì)算機(jī)計(jì)算用力最大流速(PEF)、FEV0.45/FVC時用5倍潮氣量進(jìn)行機(jī)械通氣，-8 cmH2O負(fù)壓輔助呼氣，氣道反應(yīng)性以肺阻力(RL)表示。

1.2.3 標(biāo)本處理:末次激發(fā)后24 h，解剖小鼠胸腔及腹腔，氣管中注入0.3 mL的0.9%氯化鈉溶液行肺泡灌洗3次，收集肺泡灌洗液離心，棄上清液，加入PBS、ICOS-FITC及ST1/ST2-PE抗體，流式細(xì)胞術(shù)測定nuocyte細(xì)胞數(shù)；取小鼠脾臟，分離nuocyte細(xì)胞，原代細(xì)胞培養(yǎng)；肺組織HE染色，顯微鏡下觀察。

1.2.4 流式細(xì)胞測定nuocyte的數(shù)量:末次激發(fā)小鼠24 h之內(nèi)，收集小鼠肺泡灌洗液，1 500 r/min，離心6 min，棄上清，沉淀中加入PBS重懸細(xì)胞，將流式抗體ICOS-FITC和ST1/ST2-PE加入重懸液中，4 ℃靜置30 min，測定小鼠肺泡灌洗液中nuocyte細(xì)胞數(shù)，ICOS和ST1/ST2雙陽性細(xì)胞為nuocyte細(xì)胞。

1.2.5 Nuocyte細(xì)胞分離、分組及處理:用水合氯醛麻醉后，無菌條件下取出小鼠脾臟，用RPMI-1640反復(fù)沖洗脾組織，用研缽將脾臟研磨碎，收集液體，后加入含淋巴分離液的無菌離心管中，2 000 r/min，離心15 min，吸取單個核細(xì)胞層接種于培養(yǎng)瓶中，加入RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)細(xì)胞。24 h更換培養(yǎng)液。細(xì)胞貼壁增殖到90%以上時，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，均勻?qū)⒓?xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，按時換液體。待細(xì)胞傳代及增殖狀態(tài)較好時，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，取1×106個細(xì)胞，用抗ICOS-FITC和ST1/ST2-PE抗體，避光孵育30 min，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析nuocyte細(xì)胞表面標(biāo)志，ICOS和ST1/ST2雙陽性細(xì)胞為nuocyte細(xì)胞。將nuocyte細(xì)胞分組并進(jìn)行培養(yǎng)，以1×105/mL個細(xì)胞密度分別種植于6孔板中，每孔2.5 mL，加入含20%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。實(shí)驗(yàn)分為PBS對照組、IL- 25處理組(50 μg/L)、抗IL- 25組(50 μg/L)。保留細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用ELISA、Western blot及RT-PCR方法，檢測IL- 5和IL- 13蛋白及基因的表達(dá)，每個組設(shè)置3個復(fù)孔，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 ELISA方法檢測:Nuocyte細(xì)胞在溫箱中孵育24 h，收集培養(yǎng)液于1.5 mL離心管中，2 500 r/min，離心3 min，收集上清液，按ELISA試劑盒說明書操作，依次加入收集的上清液、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗、底物及終止液等，測定細(xì)胞培養(yǎng)液中IL- 5及IL- 13含量。

1.2.7 Western blot檢測nuocyte 中IL- 5及IL- 13的表達(dá):將細(xì)胞37 ℃溫箱孵育24 h，胰蛋白酶消化細(xì)胞后，1 500 r/min，離心5 min，棄上清液，細(xì)胞沉淀中加50 μL細(xì)胞裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，冰上裂解10 min，4 ℃，12 000 r/min，離心15 min。收集上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。配制12%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行蛋白電泳、凝膠上蛋白轉(zhuǎn)到0.22 μm 的PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉，IL- 5及IL- 13抗體、內(nèi)參(山羊抗兔GAPDH抗體)(1∶3 500)4 ℃孵育過夜，TBST清洗，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶6000)37 ℃孵育1 h，TBST清洗，ECL發(fā)光試劑盒顯影。

1.2.8 RT-PCR檢測IL- 5及IL- 13 mRNA在不同nuocyte細(xì)胞組中的表達(dá):RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)nuocyte細(xì)胞，按照Trizol試劑盒的步驟提取細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計(jì)檢測mRNA純度及濃度。cDNA合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作；再按照DNA擴(kuò)增試劑盒的說明分別加入IL- 5及IL- 13引物(表1)和反轉(zhuǎn)錄的cDNA，反應(yīng)體系20 μL，ABI7900RT-PCR擴(kuò)增儀95 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，65 ℃ 32 s進(jìn)行40個循環(huán)擴(kuò)增，以GAPDH mRNA(小鼠的GAPDH引物)為內(nèi)參，根據(jù)2-△△CT公式計(jì)算IL- 5 mRNA及IL- 13 mRNA的表達(dá)量。

表1 擴(kuò)增基因引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification gene

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

2.1 小鼠造模成功的評估

2.1.1 小鼠哮喘癥狀:OVA誘導(dǎo)組小鼠出現(xiàn)全身毛發(fā)豎立，易激惹，性情暴躁不安，呼吸頻率急促，腹肌抽動甚至出現(xiàn)點(diǎn)頭呼吸等癥狀。

2.1.2 小鼠肺組織病理學(xué)改變:對照組小鼠氣道黏膜正常，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，無黏液分泌，無炎性細(xì)胞浸潤；哮喘組小鼠氣道黏膜充血水腫，肺泡壁結(jié)構(gòu)殘缺，有大量黏液分泌，支氣管壁及血管周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(圖1)。

2.1.3 肺功能變化及RL的變化:OVA小鼠組反應(yīng)氣道高反應(yīng)性的肺阻力RL明顯升高(P<0.05)；OVA組肺功能指標(biāo)PEF、FEV0.4/FVC均高于對照組(P<0.05) (圖2)。

2.2 流式細(xì)胞測定nuocyte的數(shù)量

與對照組(圖3A)相比較，哮喘組(圖3B)小鼠肺泡灌洗液中nuocyte細(xì)胞數(shù)量為(2 890±432)明顯增高于對照組(832±65)(P<0.05)。

2.3 ELISA檢測nuocyte細(xì)胞中IL- 5及IL- 13的濃度

與對照組比較，IL- 25處理組nuocyte細(xì)胞中分泌的IL- 5及IL- 13均明顯升高(P<0.05)(圖4)。

2.4 Western blot檢測nuocyte中IL- 5和IL- 13的表達(dá)

與對照組比較，IL- 25處理組nuocyte細(xì)胞中分泌的IL- 5和IL- 13均明顯升高(P<0.05)(圖5和表2)。

A.control; B.asthma圖1 小鼠肺組織HE染色Fig 1 Hematoxylin-eosin staining of mouse lung tissues (HE×200)

A.pulmonary function of PEF; B.pulmonary function of FEV0.4/FVC; C.airway hyperresponsiveness;#P<0.05 compared with control

A.the number of nuocyte in control； B.the number of nuocyte in asthma; Q1.ST1/ST2 Single positive； Q2.ST1/ST2 and ICOS double positive； Q3.ST1/ST2 and ICOS double negative； Q4.ICOS single positive

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠肺泡灌洗液中nuocyte的數(shù)量
Fig 3 The number of nuocyte detection in mouse alveolar lavage fluid by flow cytometry

2.5 RT-PCR測定結(jié)果

與對照組相比，IL- 25處理組nuocyte細(xì)胞中IL- 5 mRNA及IL- 13 mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.05)(圖6)。

*P<0.05 compared with control group圖4 ELISA檢測nuocyte細(xì)胞中IL- 5及IL- 13的濃度Fig 4 The expresstion of IL- 5 and IL- 13 in nuocyte detected by ELISA(±s, n=10)

圖5 Western blot 檢測nuocyte細(xì)胞中IL- 5和IL- 13蛋白表達(dá)Fig 5 The expresstion of IL- 5 and IL- 13 in nuocytedetected by Western blot (±s, n=3)

groupIL-5IL-13control1.001.00 anti-IL-250.92±0.230.89±0.25IL-251.98±0.47*1.64±0.52*

*P<0.05 compared with control group.

*P<0.05 compared with control group圖6 RT-PCR檢測nuocyte細(xì)胞中IL- 5mRNA及IL- 13 mRNA的表達(dá)Fig 6 The expresstion of IL- 5mRNA and IL- 13 mRNAin nuocyte detected by RT-PCR(±s, n=3)

3 討論

哮喘反應(yīng)核心是TH2型炎癥因子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。研究表明，固有免疫細(xì)胞nuocyte及IL- 25均參與TH2型免疫應(yīng)答[5- 6]。IL- 25可在肺、上皮細(xì)胞[5- 7]，Th2細(xì)胞[5]等表達(dá)，與受體IL- 17BR結(jié)合介導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)。IL- 25引起哮喘的作用已有報道[8- 10]。nuocyte細(xì)胞在免疫反應(yīng)中的作用雖還不明確，但在啟動某些疾病Th2型免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[2]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察nuocyte細(xì)胞及IL- 25對TH2型細(xì)胞因子的影響，結(jié)果顯示IL- 25通過nuocyte細(xì)胞促進(jìn)TH2型細(xì)胞因子表達(dá)。

本文對造模小鼠肺功能及肺組織進(jìn)行病理學(xué)檢測，證實(shí)了哮喘造模的成功。流式細(xì)胞術(shù)檢測肺泡灌洗液中nuocyte細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)哮喘組中明顯增多。有文獻(xiàn)研究報道，在寄生蟲感染和過敏性肺部炎癥引起的Th2型免疫應(yīng)答中，也發(fā)現(xiàn)了大量nuocyte細(xì)胞產(chǎn)生[11]，提示其可能參與哮喘的發(fā)生過程。然而具體機(jī)制還有待闡明。

本研究將IL- 25和抗IL- 25抗體分別加入nuocyte細(xì)胞中進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)IL- 25組大量分泌IL- 5和IL- 13細(xì)胞因子，比其他組明顯增高；并且IL- 25組IL- 5和IL- 13mRNA的表達(dá)也較另兩組明顯上調(diào)，與Min B等研究相符[12]，IL- 25是Th2型免疫應(yīng)答的強(qiáng)效激活劑[13]，其作用于nuocyte細(xì)胞后產(chǎn)生大量IL- 5和IL- 13細(xì)胞因子[6]，表明IL- 25能促進(jìn)TH2炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，可能機(jī)制與以下因素有關(guān)：1)IL- 25和nuocyte細(xì)胞參與了哮喘的發(fā)生發(fā)展，nuocyte細(xì)胞表面有ICOS、T1/ST2及IL- 17BR受體表達(dá)[11]，而IL- 25可能與其表面IL- 17BR受體結(jié)合，促使nuocyte分泌IL- 5及IL- 13等細(xì)胞因子，加重哮喘疾病進(jìn)展。2)IL- 25與nuocyte細(xì)胞表面的IL- 17BR結(jié)合，使nuocyte細(xì)胞增生[13],可能促使本身分泌大量IL- 5及IL- 13等細(xì)胞因子，但具體機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步探討。

總之，IL- 25可能通過nuocyte細(xì)胞促進(jìn)IL- 5和IL- 13等TH2型細(xì)胞因子的表達(dá)，誘發(fā)哮喘的發(fā)生發(fā)展，在哮喘研究和治療方面提供新的方向和治療靶點(diǎn)，然而IL- 25與nuocyte之間的確切作用機(jī)制及在哮喘中發(fā)揮的具體作用還有待進(jìn)一步研究。

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IL- 25 induces expression of Th2inflammatory factor by nuocyte in asthma of mouse

LIU Qing-fa1, CHEN Fang-fang1, LIU Fen1, LI Hong-jia1, XU Wen-juan2, SUN Qi-jing1,GONG Bing3, ZHANG Cai-qing1*

(1.Dept. of Respiratory，Qianfoshan Hospital，Shandong University，Jinan 250014； 2.Taishan Medical College，Taian 271000； 3.Weifang Medical College，Weifang 261053，China)

Objective To study the effect of Interleukin- 25 on expressing Th2 inflammatory factor in mouse asthma by nuocyte cells. Methods Nuocytes were collected from mouse spleen of OVA-induced asthma model by density gradient centrifugation. Samples were divided into 3 groups according to different intervention conditions: Interleukin-25 group; control group; anti-Interleukin- 25 group. The expression of Interleukin- 5 and Interleukin- 13 proteins in nuocyte cells supernatant was detected by ELISA. The expression of Interleukin- 5 and Interleukin- 13 in nuocyte cells was detected by Western blot. The expression of Interleukin- 5 and Interleukin- 13 mRNA was detected by RT-PCR. The number of nuocyte cells was detected by flow cytometry. Results The expression of Interleukin- 5 and Interleukin- 13 protein and related gene in Interleukin- 25 group was higer than that in the control group or anti-Interleukin- 25 group (P<0.05). The number of nuocyte cells in Interleukin- 25 group was more than that in control group or anti-interleukin- 25(P<0.05). Conclusions Interleukin- 25 can promote the expressing Interleukin- 5 and Interleukin- 13 in asthma by nuocyte cells and promote the occurrence and development of asthma.

interleukin- 25；asthma；nuocyte；interleukin- 5；interleukin- 13

2015- 02- 01

2015- 07- 01

山東省科技攻關(guān)基金(2012ZSF11830)

1001-6325(2015)11-1508-06

R562.25

A

*通信作者(corresponding author)：freezcq66@163.com