郝晉齊 莫春林

核受體依賴的膽汁酸信號(hào)調(diào)控硬化肝肝再生的研究

郝晉齊 莫春林

目的 探討核受體依賴的膽汁酸信號(hào)在硬化肝肝再生中的作用。方法 根據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)制備60只肝硬化SD大鼠肝部分切除模型，將其平均分為3組（n=20），A組使用普通飼料喂養(yǎng)，B組使用0.2%膽酸飼料喂養(yǎng)，C組使用2%消膽胺飼料喂養(yǎng)，持續(xù)喂養(yǎng)5d后，檢測(cè)比較3組大鼠膽汁分泌速度、肝功能指標(biāo)、肝細(xì)胞有絲分裂指數(shù)、肝細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原和細(xì)胞核DNA含量，比較分析3組大鼠肝組織核受體的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果 B組膽汁分泌速度、總膽汁酸含量、血清白蛋白、肝細(xì)胞有絲分裂指數(shù)、細(xì)胞核DNA含量均顯著高于A組，C組的上述各項(xiàng)指標(biāo)顯著低于A組和B組，上述差異比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B組的肝組織核受體mRNA表達(dá)量顯著高于A組，C組的肝組織核受體mRNA表達(dá)量顯著低于A組和B組，差異比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 核受體依賴的膽汁酸信號(hào)對(duì)硬化肝肝再生的調(diào)控作用非常關(guān)鍵，膽汁酸的增加利于肝組織再生。

核受體依賴；膽汁酸；肝硬化；肝再生

肝癌是致死率較高的惡性腫瘤，僅次于胃癌和食道癌，臨床研究指出我國(guó)的肝癌患者4/5以上存在肝硬化[1]，為了延長(zhǎng)生存周期，患者選擇肝切除手術(shù)，但術(shù)后肝組織的再生能力受阻，肝臟功能代償問題成為目前研究的臨床熱點(diǎn)。若代償良好，患者會(huì)逐漸恢復(fù)，但如果代償不佳，肝功能會(huì)隨之衰竭，最終死亡。如何避免肝切除術(shù)后肝組織再生的缺失、促進(jìn)肝功能恢復(fù)，對(duì)術(shù)后生存有著重要臨床意義。肝再生是細(xì)胞、基因、信號(hào)等眾因素作用調(diào)控過程，核受體參與編碼轉(zhuǎn)錄因子的超基因家族，參與生理活動(dòng)調(diào)節(jié)[2]。本研究探討核受體依賴的膽汁酸新號(hào)在硬化肝肝再生中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物模型的制備 選用雄性60只SD大鼠，體質(zhì)量100～180g，平均體質(zhì)量（152.6±26.8）g，根據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行動(dòng)物模型制作，飲用0.03%硫代乙酰胺（thioacetamide,TAA）溶液12周來復(fù)制肝硬化模型。肝硬化大鼠肝部分切除術(shù)模型制備：肝硬化大鼠8%水合氯醛腹腔麻醉(40μg/g)后，切除大鼠肝左葉。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 60只肝硬化部分切除術(shù)模型完成后進(jìn)行數(shù)字隨機(jī)化平均分為3組，3組大鼠的體質(zhì)量比較無顯著差異。A組20只使用普通飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，B組20只使用0.2%膽酸飼料喂養(yǎng)，C組20只使用2%消膽胺飼料喂養(yǎng)，連續(xù)喂養(yǎng)5d。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法 膽汁分泌速度：SD大鼠麻醉后嚴(yán)格無菌條件下實(shí)施剖腹術(shù)，分離膽總管后用1小聚乙烯導(dǎo)管(22G)插管，收集膽汁30min以測(cè)定膽汁分泌的速度。

膽汁酸含量：取一定量肝，80℃烘干后，研磨成粉末。用無水乙醇70℃提取3次，提取液80℃蒸干，用石油醚去除脂肪和中性膽固醇，剩余沉淀用含2% Triton X-100的乙醇溶解，再80℃蒸干，最后用蒸餾水溶解沉淀，此液即為提取的肝膽汁酸溶液。用全自動(dòng)生化分析儀酶法測(cè)定總膽汁酸，以每克肝中含有膽汁酸的微摩爾數(shù)表示肝膽汁酸含量(μmol/g)。

肝功能：全自動(dòng)生化分析儀酶法測(cè)定白蛋白和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。

肝細(xì)胞有絲分裂指數(shù)：病理切片行常規(guī)染色，有絲分裂肝細(xì)胞在1000個(gè)干細(xì)胞中的比例。

細(xì)胞核DNA含量：將大鼠肝臟組織切片行Feulgen法染色后，應(yīng)用全自動(dòng)圖像分析儀，隨機(jī)選擇3～4個(gè)視野，每張切片測(cè)定肝細(xì)胞150個(gè)左右，定位待測(cè)肝細(xì)胞核，由電視攝像系統(tǒng)提取數(shù)字化的細(xì)胞核圖像，測(cè)定細(xì)胞核面積，積分光密度，計(jì)算出肝細(xì)胞U值(DNA相對(duì)含量)，經(jīng)微機(jī)處理后，確定DNA倍型。

核受體mRNA：采用異硫氰酸胍一步法提取總RNA。瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，紫外分光光度法鑒定RNA的量和純度，以逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptasepolymerase chain reaction,RT-PCR)法對(duì)mRNA進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對(duì)本組研究的數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。正態(tài)計(jì)量資料采用“±s”表示；2組正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)的組間比較采用t檢驗(yàn)以；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝再生相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 B組膽汁分泌速度、總膽汁酸含量、血清白蛋白、肝細(xì)胞有絲分裂指數(shù)、細(xì)胞核DNA含量均顯著高于A組（tB-A=15.7，14.8，10.5，27.3，14.5，P＜0.01），C組的上述各項(xiàng)指標(biāo)顯著低于A組和B組，上述差異比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tC-A=7.2，6.7，7.3，3.2，5.0，P＜0.01；tC-B=31.5，21.6，19.9，29.8，20.9，P＜0.01）。見表1。

表1 3組的肝再生相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（±s，n=20）

表1 3組的肝再生相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（±s，n=20）

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2.2 肝組織核受體mRNA檢測(cè)結(jié)果 B組的肝組織核受體FXR表達(dá)量（0.67±0.03）mRNA，顯著高于A組（0.53±0.02）mRNA，C組的肝組織核受體表達(dá)量（0.45±0.05）mRNA，顯著低于A組和B組，差異比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tB-A=17.36,tC-A=6.64，tC-B=16.87，P＜0.01）。

3 討論

部分肝臟切除后多數(shù)患者的肝組織均難以再生，剩余肝葉恢復(fù)至原處水平的所占比例較少[3]。肝再生是由細(xì)胞、基因、信號(hào)分子等多因素相互作用調(diào)整的過程，核受體屬于轉(zhuǎn)錄因子編碼的超基因家族，可參與多種生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)。已有報(bào)道指出核受體激動(dòng)劑對(duì)肝有絲分裂原的促進(jìn)效果良好，膽汁酸是與該類受體關(guān)系較為密切的信號(hào)分子，可以借此來調(diào)節(jié)多支生理學(xué)通路，從而維持膽汁酸和膽固醇內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[4]。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)核受體依賴膽汁酸信號(hào)是肝再生的重要物質(zhì)，該受體是核受體超家族一員，膽汁酸水平降低和相關(guān)核受體缺失均會(huì)對(duì)肝再生造成影響[5]。

膽汁酸、肝內(nèi)脂肪堆積、肝炎病毒等因子均會(huì)損傷干細(xì)胞，在上述肝損傷因子持續(xù)作用，肝細(xì)胞被細(xì)胞外基質(zhì)替代，進(jìn)而發(fā)展成肝纖維化，最終成為肝硬化。本次研究選擇SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行選擇性處理，使其轉(zhuǎn)化為肝硬化大鼠，通過科學(xué)方法將其分組研究，結(jié)果提示喂養(yǎng)膽酸的B組大鼠的各項(xiàng)肝再生指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果明顯好于喂養(yǎng)普通飼料及消膽胺，該組的肝組織核受體FXRmRNA的表達(dá)量均顯著高于A組和C組(P＜0.01)，C組大鼠的mRNA表達(dá)量最低。消膽胺是一種較為強(qiáng)效的降膽固醇藥物，它可同腸內(nèi)膽酸結(jié)合，抑制膽汁酸的重吸收，增加其排泄，減少肝臟中的膽酸積累，因此C組膽汁酸分泌速度、總膽汁酸量低于A組、B組(P＜0.01)。研究指出FXR可被膽汁酸激活，對(duì)肝臟代謝具有重要作用，F(xiàn)XR可同膽汁酸直接結(jié)合，作為受體來調(diào)控參與膽汁酸代謝基因表達(dá)，從而維持膽汁酸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[6-7]。FXR調(diào)節(jié)膽汁酸的具體過程如下：抑制膽汁酸合成的限速酶膽固醇7α羥化酶基因表達(dá)，減少膽汁酸的合成；激活肝細(xì)胞膜膽鹽輸出泵轉(zhuǎn)錄，促使膽汁酸向膽小管轉(zhuǎn)運(yùn)；調(diào)節(jié)肝臟?；撬徕c協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，減少肝臟對(duì)膽汁重吸收；上調(diào)回腸膽汁酸結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄，增加腸道對(duì)膽汁酸重吸收[8]。由此可以分析得出膽汁酸分泌量對(duì)肝再生的影響效果顯著，對(duì)臨床治療肝硬化具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。FXR在膽汁酸、脂類新陳代謝發(fā)揮重要作用，其對(duì)肝臟毒性損傷所致肝纖維化提供治療新思路，如合成FXR配體來活化FXR就可能逆轉(zhuǎn)肝纖維化，緩解肝纖維化癥狀。

綜上所述，核受體依賴的膽汁酸信號(hào)對(duì)硬化肝肝再生的調(diào)控作用非常關(guān)鍵，膽汁酸的增加利于肝組織再生。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2015.6.009

項(xiàng)目資助：佛山市科學(xué)技術(shù)局（ 201208309）

廣東 528100 廣東省佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院普外科 （郝晉齊莫春林）