李勇輝

(遼寧省錦州市義縣稍戶營子小荒地牧場,遼寧義縣 121100)

茶多酚抗金黃色葡萄球菌alpha溶血素和腸毒素A和B活性影響研究

李勇輝

(遼寧省錦州市義縣稍戶營子小荒地牧場,遼寧義縣 121100)

金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus,簡稱金葡菌)是引起食物中毒的主要病原菌之一。也是能引起嚴重危害人類健康的一類人獸共患傳染病的病原,近年在我國的流行呈愈演愈烈的態(tài)勢,而且由于其不可控制的流行性和不斷發(fā)展的耐藥性,開發(fā)新的藥物或治療方法顯得尤為重要。本研究是在原有的藥物和治療方法下考察了茶多酚針對食源性病原菌金黃色葡萄球菌在浮游態(tài)與生物被膜態(tài)的條件下,研究茶多酚對金黃色葡萄球菌浮游菌alpha溶血素和腸毒素A和B活性影響研究成及茶多酚針對食源性病相關(guān)基因的影響。

茶多酚;金黃色葡萄球菌

1 金黃色葡萄球菌

1.1 金黃色葡萄球菌的危害

金黃色葡萄球菌在浮游態(tài)與生物被膜態(tài)的條件下，研究茶多酚對金黃色葡萄球菌浮游菌生物被膜合成及相關(guān)基因的影響。方法倍比稀釋法測定茶多酚對金黃色葡萄球菌浮游菌的最小抑菌濃度（MIC），對羥基聯(lián)苯溶液顯色法測定茶多酚干擾金黃色葡萄球菌浮游菌生物被膜生長過程中藻酸鹽的產(chǎn)生量；掃描電鏡觀察腸毒素和溶血；熒光顯微鏡下觀察膜分散后死活細菌。目前茶多酚有片劑、注射液等劑型，近年人們對茶多酚進行了廣泛深入的研究，其臨床應(yīng)用范圍不斷擴大，因此，本實驗研制茶多酚的Western Blot，改變給藥途徑，方便更廣大的患者，提高患者用藥的安全性。

1.2 金黃色葡萄球菌的致病機理

金黃色葡萄球菌有原發(fā)性和繼發(fā)性之分。人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌的致病力強弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶。無論病理變化如復(fù)雜何復(fù)雜，它只標志著滲出與增生病變之間的量的區(qū)別，其實質(zhì)則是機體在不同部位、不同器官所呈現(xiàn)的不同程度的干酪樣壞死和肉芽腫性變化。金黃色葡萄球菌病理變化發(fā)生的特點有兩個：①原發(fā)一病灶不一定出現(xiàn)在原始的門戶；②病灶內(nèi)明顯出現(xiàn)肉芽腫變化，在金黃色葡萄球菌灶內(nèi)有大量體細胞增生，構(gòu)成特殊性乳業(yè)。奶牛的牛金黃色葡萄球菌潛伏期長短不一，短者十幾天。

1.3 金黃色葡萄球菌易發(fā)生耐藥性

近年來世界各地金黃色葡萄球菌的多耐菌株逐漸增多，甚至引起暴發(fā)流行。金黃色葡萄球菌的耐藥可由自發(fā)突變產(chǎn)生（原發(fā)性耐藥）或由用藥不當經(jīng)突變選擇產(chǎn)生（繼發(fā)性耐藥）。但多耐的產(chǎn)生主要可能由于后者。耐藥基因在染色體上，對不同藥物的耐藥不相連接基因，所以用藥治療有效。

2 實驗測定

2.1 材料和方法

材料：患金黃色葡萄球菌乳房炎的奶牛乳汁，發(fā)霉的食物，一抗和二抗。電泳液相關(guān)溶液的配制

（1）1.5M的Tris（PH8.8）：18.17g+100ml（五蒸水）。

（2）1.0M的Tris（PH6.8）：12.11g+100ml（五蒸水），用HCl調(diào)pH至6.8。

（3）30%丙烯酰胺的混合液（100ml），取29g丙烯酰胺和1gbis丙烯酰胺用水定容到100ml過濾（0.22um），4℃保存1個月。

（4）2X樣品緩沖液（10ml）：甘油2ml、溴酚藍0.0202g、1MTris（ph6.8）1ml、硫基乙醇0.4ml、10%的SDS4ml。

（5）10%的分離膠（5ml）：五蒸水1.9ml、4℃的30%Acrylovmidemix1.7ml、室溫1.5MTris（PH8.8）1.3ml、室溫10%SDS（100gSDS定容至1L）0.05ml、4℃的APS（過硫酸銨）0.05ml、4℃TEMED（四甲基二乙胺）0.002ml。

（6）12%的分離膠（5ml）：五蒸水1.6ml、4℃的30%Acrylovmidemix2.0ml、室溫1.5MTris（PH8.8）1.3ml、室溫10%SDS（100gSDS定容至1L）0.05ml、4℃的APS（過硫酸銨）0.05ml、4℃TEMED（四甲基二乙胺）0.002ml。

（7）濃縮膠（3 m l）：五蒸水2.1 m l、4℃的3 0%Acrylovmidemix0.5ml、室溫1.0MTris（PH6.8）0.38ml、室溫10%SDS（100gSDS定容至1L）0.03ml、4℃的APS（過硫酸銨）0.03ml、4℃TEMED（四甲基二乙胺）0.003ml。

方法：通過westernblot的方法測定茶多酚抗金黃色葡萄球菌最適宜的濃度，并測定茶多酚用藥的最小濃度（MIC）。

2.2 茶多酚抗金黃色葡萄球菌的腸毒素濃度的測定

通過比較分析獲取有用的知識和信息是生物學常用的方法，而序列分析最常用的比較方法就是序列比對，將未知序列同整個數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行比較分析已經(jīng)成為分子生物學領(lǐng)域中一個強有力的研究手段。通過序列比對，人們能夠判斷出兩個序列之間是否具有足夠的相似性，進而判斷兩者之間是否具有同源性，通過同源性可以推斷兩個基因在進化上是否有共同祖先的結(jié)論。通過訪問NCBI主頁進行Blast同源性比對是常用的分析方法，然而在很多場合需要在脫機狀態(tài)下使用Blast進行同源性比對，另外，公共數(shù)據(jù)庫的比對由于缺乏針對性，使得比對結(jié)果復(fù)雜，不利于分析。所以，Blast本地化對科研工作的開展是十分有意義的。本數(shù)據(jù)庫的建立為本地化Blast打下了前期基礎(chǔ)，為實驗室進行乳房炎病毒分子流行病學的研究提供了一個有力的工具。

3 結(jié)論

茶多酚抗金黃色葡萄球菌alpha溶血素和腸毒素A和B活性影響研究

實驗結(jié)果

（1）茶多酚對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）為64μg/ml。

（2）茶多酚對金黃色葡萄球菌alpha溶血素抑制westernblot分析結(jié)果：

從左到右依次為：空白，8μg/ml，16μg/ml，32μg/ml。

（3）茶多酚對金黃色葡萄球菌腸毒素A抑制westernblot分析結(jié)果：

從左到右依次為：空白，8μg/ml，16μg/ml，32μg/ml。

（4）茶多酚對金黃色葡萄球菌腸毒素B抑制westernblot分析結(jié)果：

從左到右依次為：空白，8μg/ml，16μg/ml，32μg/ml。

從以上結(jié)果我們可以得到：

①茶多酚對金黃色葡萄球菌有一定的抗菌活性；

②8μg/ml茶多酚能顯著抑制金黃色葡萄球菌alpha溶血素活性；

③8μg/ml茶多酚能顯著抑制金黃色葡萄球菌腸毒素A活性；

④32μg/ml茶多酚能顯著抑制金黃色葡萄球菌腸毒素B活性

以上結(jié)果提示：茶多酚可以作為抗金黃色葡萄球菌毒素的潛在藥物進行探索。

[1]王曉紅.桃柁酚對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響及其分子機制研究[D].西北農(nóng)林科技大學，2012.