付曉平 李嘉彬 蔣紅霞

(廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院,廣東廣州 510430)

RamR突變協(xié)同靶位基因突變對(duì)沙門氏菌耐藥性影響的研究

付曉平 李嘉彬 蔣紅霞

(廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院,廣東廣州 510430)

從實(shí)驗(yàn)室保存的沙門菌中篩選出33株對(duì)環(huán)丙沙星呈現(xiàn)不同敏感程度的分離株,采用PCR方法檢測(cè)喹諾酮類作用靶位基因突變和外排泵調(diào)控基因ramA的負(fù)調(diào)控蛋白編碼基因ramR的突變。結(jié)果表明,33株沙門菌中,凡是高水平耐藥菌和環(huán)丙沙星耐藥菌株都發(fā)生GyrA和ParC的多位點(diǎn)突變,突變主要在gyrA和parC基因的QRDR,即GyrA發(fā)生83和87位的雙突變(S83F/D87G,8株; S83F/D87N,5株;S83L/D87N,1株),ParC發(fā)生57和80位的雙突變(T57S/S80R)。15株對(duì)環(huán)丙沙星敏感性下降的菌株中,有5株在gyrA83位發(fā)生單位點(diǎn)突變,有5株在87位發(fā)生氨基酸的取代(3株D87Y,2株D87N),其余4株在4個(gè)靶位基因的QRDR都沒有發(fā)生任何突變。對(duì)33株沙門菌ramR擴(kuò)增測(cè)序后發(fā)現(xiàn),15株菌的ramR發(fā)生突變,共有4種突變類型,M83T(n=6),A37S(n=3),T18P (n=3)和氨基酸的缺失(n=3)。剩下的18株,無(wú)論對(duì)環(huán)丙沙星敏感/敏感性降低還是耐藥,ramR沒有檢測(cè)到任何突變。

沙門氏菌;ramR;PCR;外排泵

沙門氏菌是引起人類食源性感染疾病最主要也是最常見的病原菌，而且沙門氏菌也是重要的人畜共患病病原體[1]，而在臨床上治療由沙門氏菌引起的感染時(shí)，氟喹諾酮類一般是首選藥物，但由于臨床藥物的濫用或不合理添加使得沙門氏菌對(duì)抗生素的敏感性在不斷下降[2]。沙門氏菌對(duì)喹諾酮類的耐藥主要?dú)w因于喹諾酮決定區(qū)基因的突變，GyrA的突變是最常見的，而且突變通常發(fā)生在83位和87位，GyrA單位點(diǎn)的突變通常能夠引起沙門氏菌對(duì)喹諾酮的敏感性下降，而ParC的突變通常伴隨著GyrA的突變，且能夠?qū)е律抽T氏菌對(duì)喹諾酮類藥高水平耐藥[3]。

除了由于氨基酸的替代導(dǎo)致突變引起沙門氏菌對(duì)藥物的敏感性降低外，外排泵的作用機(jī)制也是也是一個(gè)不容忽視的重要原因[4，5]。在沙門氏菌中至少存在9種多重耐藥外排泵，AcrABTolC是其中最重要的一種，它能夠主動(dòng)外排多種底物，包括抗生素、染料和洗滌劑等[6，7]。有研究報(bào)道，AcrAB-TolC對(duì)氟喹諾酮藥物的主動(dòng)外排作用是導(dǎo)致S.typhimurium DT204高水平耐藥的主要原因，也是導(dǎo)致S.typhimuriumDT104多重耐藥的主要作用機(jī)制[8]，RamA是沙門氏菌中誘導(dǎo)AcrAB-TolC表達(dá)的重要控制蛋白[9]。RamA表達(dá)受到負(fù)調(diào)控蛋白R(shí)amR的調(diào)控[10]。有研究報(bào)道當(dāng)ramR基因發(fā)生突變或有插入序列時(shí)，RamR的功能發(fā)生改變，引起ramA的過(guò)表達(dá)或者表達(dá)量減少[8]，從而改變菌株的耐藥表型。

本研究篩選了臨床分離的對(duì)環(huán)丙沙星呈現(xiàn)不同耐藥水平的沙門菌，探討耐氟喹諾酮類沙門菌靶位突變類型與RamR突變類型之間的關(guān)聯(lián)。

1 材料和方法

1.1 菌株

從實(shí)驗(yàn)保存的沙門氏菌中篩選了33株對(duì)環(huán)丙沙星呈現(xiàn)不同耐藥水平的菌株，其中15株耐藥株（MIC，4～128μg/ml），16株敏感性降低菌株（MIC，0.06～1μg/ml），敏感株2株，質(zhì)控菌ATCC25922。各菌株耐藥分子表型特征見表1。

1.2 靶位基因和ramR基因的突變檢測(cè)

首先對(duì)菌株進(jìn)行復(fù)蘇，然后采用水煮法提取細(xì)菌的總DNA，備用，參考已發(fā)表相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)、合成引物，對(duì)所有不同程度耐藥水平的菌株采用PCR方法擴(kuò)增靶位基因（gyrA、gyrB、parC和parE）和ramR基因。陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送北京華大公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提呈NCBI進(jìn)行序列比對(duì)，分析靶位基因和ramR的突變情況。

2 結(jié)果

2.1 33株食品動(dòng)物源沙門氏菌靶位基因QRDR突變檢測(cè)

33株對(duì)環(huán)丙沙星呈現(xiàn)不同敏感性的沙門菌，靶位基因的突變主要發(fā)生在gyrA和parC基因。凡是對(duì)環(huán)丙沙星耐藥的菌株（16株）都發(fā)生GyrA和ParC雙靶位的多重突變，即GyrA發(fā)生83和87位的雙突變（S83F/D87G，8株；S83F/D87N，5株；S83L/D87N，1株），ParC發(fā)生57和80位的雙突變（T57S/S80R，11株）。而15株對(duì)環(huán)丙沙星敏感性下降的菌株中，有10株發(fā)生gyrA的單位點(diǎn)突變，其中有5株在83位發(fā)生S83Y（4株）和S83F（1株）突變，有5株在87位發(fā)生突變（3株D87Y，2株D87N）。有一株發(fā)生parCT57S的突變。4株在靶位基因的QRDR都沒有發(fā)生任何突變，這些沒有發(fā)生任何突變的菌株中，有三株攜帶PMQR基因。而2株對(duì)環(huán)丙沙星敏感的菌株，有一株發(fā)生gyrA靶位基因S83T的突變，且攜帶PMQR基因，一株在靶位基因未發(fā)生任何突變，也未攜帶PMQR基因。結(jié)果見表1。

2.2 ramR基因突變檢測(cè)

分析33株不同程度耐藥菌株ramR的突變情況發(fā)現(xiàn)，有15株菌ramR發(fā)生突變（8株高水平耐藥，7株敏感性下降），共4種突變類型，M83T（n=6），A37S（n=3），T18P（n=3）和氨基酸的缺失（n=3）。剩下19株，無(wú)論對(duì)環(huán)丙沙星敏感/敏感性降低還是耐藥，ramR沒有檢測(cè)到任何突變。結(jié)果見表1。

3 討論

喹諾酮類藥物為一類廣譜高效的化學(xué)合成抗菌藥，具有較強(qiáng)的抗菌活性，現(xiàn)已廣泛用于人醫(yī)臨床和獸醫(yī)治療感染性疾病。近幾年來(lái)，喹諾酮類藥耐藥株迅速增多，其臨床療效受到了嚴(yán)重的影響，喹諾酮類耐藥機(jī)制復(fù)雜，主要有靶位改變和主動(dòng)外排兩個(gè)機(jī)制所致，這兩者均有染色體突變引起[11]。與喹諾酮類耐藥有關(guān)的gyrA的突變發(fā)生在QRDR第199-318個(gè)堿基，主要有4個(gè)突變位點(diǎn)，按照突變頻率分別是83位，87位，81位和84位。且有研究已經(jīng)證實(shí)QRDR的突變與細(xì)菌的耐藥有直接的關(guān)系[12]。有研究證實(shí)gyrA的基本突變位點(diǎn)是Ser83，且此位點(diǎn)的突變常常造成細(xì)菌對(duì)喹諾酮類耐藥[13]，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的亞單位基因的突變也是造成耐藥的一方面，其亞單位最主要的parC基因，parC和gyrA的N-末端都有與QRDR有關(guān)的區(qū)域，當(dāng)發(fā)生氨基酸替代后影響藥物與酶的結(jié)合，從而使得耐藥性增加，但拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ只是藥物的從屬靶位，parC的突變發(fā)生在Ser-80/Glu-84，并且gyrA的突變是引起細(xì)菌對(duì)喹諾酮類耐藥的主要原因，而parC的突變則可引起菌株對(duì)氟喹諾酮類藥的高水平耐藥[14]）。

本研究對(duì)33株沙門菌的靶位基因突變檢測(cè)證實(shí)了以前的研究結(jié)果，即gyrA是藥物作用的首要靶位，也是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的第一步。在本研究中，有10株菌株發(fā)生gyrA單位點(diǎn)突變，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)環(huán)丙沙星的敏感性降低（MIC 0.06～1μg/ml），而gyrA和parC同時(shí)發(fā)生突變的菌株則對(duì)環(huán)丙沙星呈現(xiàn)高水平耐藥。

本研究進(jìn)一步分析RamR四種突變類型與靶位基因突變機(jī)制之間的關(guān)系。RamR發(fā)生A37S突變的菌株，GyrA和ParC都發(fā)生多位點(diǎn)雙突變，對(duì)環(huán)丙沙星高水平耐藥；而M83T類型的突變株的大多表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的外排泵活性，其中5株在GyrA發(fā)生單位點(diǎn)的突變（2株在83位突變，3株在87位突變），只對(duì)環(huán)丙沙星表現(xiàn)出敏感性降低；另外有一株在GyrA和ParC都發(fā)生突變，對(duì)環(huán)丙沙星卻表現(xiàn)高水平耐藥（MIC 32μg/ml）。進(jìn)一步檢查6株M83T突變類型的菌株，當(dāng)靶位基因發(fā)生雙位點(diǎn)突變時(shí)，導(dǎo)致該菌株對(duì)環(huán)丙沙星高水平耐藥。T18P類型的突變株中，2株GyrA和ParC均未發(fā)生突變，對(duì)環(huán)丙沙星敏感性下降。而RamR發(fā)生氨基酸缺失的菌株，其靶位都發(fā)生雙位點(diǎn)突變，對(duì)環(huán)丙沙星高水平耐藥。從我們的研究結(jié)果可以看出，細(xì)菌獲得對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥性，主要以雙靶位基因突變?yōu)橹?；然而不同ramR突變類型可能與靶位基因突變有協(xié)同作用。如M83T突變類型，當(dāng)gyrA只發(fā)生單位點(diǎn)突變時(shí)菌株對(duì)環(huán)丙沙星僅表現(xiàn)敏感性降低，而當(dāng)存在雙靶位突變時(shí)，ramR發(fā)生M83T突變，使得菌株對(duì)環(huán)丙沙星高水平耐藥。孫亞偉分析了實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)的靶位基因首次突變的誘導(dǎo)株其ramA表達(dá)的情況，結(jié)果顯示ramA表達(dá)增高能促進(jìn)靶位基因的突變，使細(xì)菌獲得高水平耐藥。因此細(xì)菌獲得環(huán)丙沙星的耐藥性應(yīng)該是兩種機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果。

表1 各菌株耐藥分子表型特征及靶位基因和ramR基因的突變情況

[1]AlVAREZ-FEMANDEZ，E.，et al.，Prevalence and antimicrobial resistance of Salmonella serotypes isolated from poultry in Spain：comparison between 1993 and 2006[J].Int J Food Microbiol，2012，153（3）：281-287.

[2] SHIN，H.，et al.，Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar typhimurium bacteriophage SPN1S[J].J Virol，2012，86（2）：1284-1285.

[3] HOPKINS，K.L.，R.H. DAVIES，and E.J. Threlfall，Mechanisms of quinolone resistance in Escherichia coli and Salmonella：recent developments[J].Int J Antimicrob Agents，2005，25（5）：358-373.

[4] BAUCHERON ，S . ，E . ChASLUS - DANCLA ， and A . ClOECKAERT，Role of TolC and parC mutation in highlevel fluoroquinolone resistance in Salmonella enterica serotype Typhimurium DT204[J].J Antimicrob Chemother，2004，53（4）：657-659.

[5] GIRAUD，E.，et al.，Evidence for Active Efflux as the Primary Mechanism of Resistance to Ciprofloxacin in Salmonella enterica Serovar Typhimurium[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2000，44（5）：1223-1228.

[6] ASAKO，H.，et al.，Organic solvent tolerance and antibiotic resistance increased by overexpression of marA in Escherichia coli[J]. Appl Environ Microbiol，1997，63（4）：1428-1433.

[7] NIKAIDO，H. and J.M. PAGES，Broad-specificity efflux pumps and their role in multidrug resistance of Gram-negative bacteria[J]. FEMS Microbiol Rev，2012，36（2）：340-363.

[8] ABOUZEED，Y.M.，S. BAUCHERON，and A. CLOECKAERTl，ramR mutations involved in efflux-mediated multidrug resistance in Salmonella enterica serovar Typhimurium[J].Antimicrob Agents Chemother，2008，52（7）：2428-2434.

[9] NIKAIDO，E.，A. YAMAGUCHIi，and K. NISHION，AcrAB multidrug efflux pump regulation in Salmonella enterica serovar Typhimurium by RamA in response to environmental signals[J].J Biol Chem，2008，283（35）：24245-24253.

[10] ZhENG，J.，S. CUI，and J. MENG，Effect of transcriptional activators RamA and SoxS on expression of multidrug efflux pumps AcrAB and AcrEF in fluoroquinolone-resistant Salmonella Typhimurium[J].J Antimicrob Chemother，2009，63（1）：95-102.

[11] 趙倩. 質(zhì)粒介導(dǎo)aac（6’）-Ib-cr基因檢測(cè)與喹諾酮類耐藥[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2013，28（3）：199-203.

[12] Matrat，S，Petrella，S，Cambau，E，et al. Expression and purification of an active form of the Mycobacterium leprae DNA gyrase and its inhibition by quinolones[J].Antimicrob Agents Chemother，2007，51（5）：1643-1648.

[13] 蔣萍，陳恒屹，張堅(jiān)磊，等.耐喹諾酮類大腸埃希菌耐藥機(jī)制的研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2007，17（6）：635-638.

[14] Chenia，H Y，Pillay，B，Pillay，D. Analysis of the mechanisms of fluoroquinolone resistance in urinary tract pathogens[J].J Antimicrob Chemother，2006，58（6）：1274-1278.