孟 利，劉 峰，付海燕，雷 虹，李秀涼，韓德權(quán)，平文祥

(1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心黑龍江省微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080;2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，哈爾濱150086)

甜高粱(Sorghum bicolor L.Moench)是雙色高粱的一種，由于莖稈多汁且富含糖分，又稱糖高粱或蘆粟、蘆穄、蘆黍，具有抗旱，耐澇，耐貧瘠，耐鹽堿、節(jié)水、節(jié)能等特性，而且抗逆性強(qiáng)，生物學(xué)產(chǎn)量高，適應(yīng)性廣等，在中國、美國、俄羅斯等國家廣泛種植[1－3].甜高粱秸稈精華主要在富含糖分的莖稈，單產(chǎn)可達(dá)每畝5 000～10 000 kg.可用于制糖、釀酒、制酒精燃料、造紙和飼料等可做為生物燃料，釀酒的原料.甜高粱秸稈中糖的有效提取及組分分析，對(duì)其品種的篩選及產(chǎn)業(yè)化利用至關(guān)重要.以往糖含量測(cè)定多以總糖含量計(jì)測(cè)定來表示，不能適應(yīng)分析需求.隨著儀器分析的發(fā)展，由于高效陰離子交換色譜－積分脈沖安培法(HPAEC－PAD)在強(qiáng)堿性條件下具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、有機(jī)溶劑兼容以及無需衍生，直接分離測(cè)定等優(yōu)勢(shì)，在對(duì)樣品中碳水化合物、氨基酸和其他生物大分子、小分子以及抗生素等的分析方面已有廣泛的應(yīng)用[4－7].目前采用HPAEC－PAD法同時(shí)測(cè)定秸稈中單糖、二糖的分析研究還少見報(bào)道.

本試驗(yàn)以糖高粱秸稈為原料，建立了甜高粱秸稈中糖的提取工藝，分別考察了料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間3個(gè)因素對(duì)甜高粱秸稈中可溶性糖提取的影響.對(duì)其中的可溶性糖采用蒽酮法對(duì)其中的總糖含量進(jìn)行分析，用HPAEC－PAD法對(duì)其可溶性糖的種類進(jìn)行分析，旨在考察甜高粱秸稈中可溶性糖的比例，為甜高粱秸稈中可溶性糖的開發(fā)、利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜高粱(黑龍江省五常市);3，5－二硝基水楊酸國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純;蒽酮國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純;葡萄糖果糖蔗糖純度99%AMRESCO進(jìn)口分裝.

1.2 主要儀器與設(shè)備

ICS3000多功能色譜裝置(美國 Dionex公司)，包括雙泵(DP)模塊、檢測(cè)器/色譜(DC)模塊、自動(dòng)進(jìn)樣器(AS)模塊.雙泵模塊中包含一個(gè)單元泵和一個(gè)四元梯度泵，其中四元梯度泵用于糖的分離;檢測(cè)器/色譜模塊中配置進(jìn)樣閥、分析柱和安培檢測(cè)器;溫度均設(shè)為30℃;安培檢測(cè)器用金工作電極、pH－Ag/AgCl復(fù)合參比電極、鈦對(duì)電極.Chromeleon 6.8色譜工作站;TU－1810紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);超純水設(shè)備(韓國 Human up 900).

1.3 甜秸稈中糖的提取及組分分析

提取工藝流程:甜秸稈→去葉、去鞘→粗壓榨→粗秸稈渣→高效粉碎機(jī)粉碎→均勻的秸稈粉末→混合均勻取樣→料液比(1∶4)混勻→蒸餾提取(60℃，2.0 h)→過濾→反復(fù)洗滌殘?jiān)鼛状巍喜V液→冷卻至室溫→定容到錐形瓶→吸取1 mL→定容到100 mL容量瓶→還原糖、總糖及組分測(cè)定.

1.3.1 可溶性糖質(zhì)量濃度的測(cè)定

蒽酮法測(cè)定總糖質(zhì)量濃度:取7支比色管內(nèi)加入500 μg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.00 、0.10 、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，補(bǔ)加蒸餾水至 1 mL，各加入蒽酮試劑5 mL，搖勻.沸水浴l0 min，冷卻至室溫，620 nm測(cè)定吸光值.以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線.試樣取1 mL，重復(fù)上述操作.

1.3.2 可溶性糖組分分析色譜條件

色譜柱:配有Dionex CarboPac MA1分離柱(4×250 mm)和保護(hù)柱(2 ×50 mm)，250 mmol/L NaOH為淋洗液，溫度為30℃，流速為1.0 mL/min.pH－Ag/AgCl復(fù)合參比電極、安培檢測(cè)器(Au工作電極).進(jìn)樣體積 25.0 μL.

為使葡萄糖和果糖在一次進(jìn)樣時(shí)有較好的分離度，經(jīng)過試驗(yàn)，采用純水和250 mmol/LNaOH兩種淋洗液以梯度淋洗方式洗脫，梯度淋洗程序見表1.

表1 分離葡萄糖、果糖、蔗糖的梯度淋洗程序

分析物的檢測(cè)采用如表2所示的四電位波形以積分脈沖安培檢測(cè)方式進(jìn)行.

表2 分離葡萄糖、果糖、蔗糖的檢測(cè)波形

2 結(jié)果與分析

2.1 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

可溶性總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定在20～200 mg/L含糖范圍內(nèi)呈良好的線性，線性方程為y=1.884 2x－0.004 6，相關(guān)系數(shù)為0.999 4.見圖1.

圖1 蒽酮法測(cè)定總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 料液比對(duì)甜高粱秸稈中可溶性糖提取的影響

圖2為料液比對(duì)甜秸稈中可溶性糖提取的影響，試驗(yàn)分別以料液比 1∶2、1∶4、1∶6、1∶8 浸提甜高粱秸稈粉末，分別在60℃浸提2 h，定容，測(cè)定總糖、還原糖，重復(fù)3次.當(dāng)料液比為1∶2時(shí)加水量太小，秸稈粉末不能完全溶掉，浸提率較小，料液比為1∶4時(shí)，甜秸稈中可溶性糖的浸提率最高為18.6%，當(dāng)料液比為1∶6時(shí)可溶性糖的浸提率開始減小，同時(shí)料液比過大，體積增大，能耗加大.因此選擇料液比為1∶4為最佳料液比.

圖2 料液比對(duì)甜高粱秸稈中可溶性糖提取的影響

2.3 浸提溫度對(duì)甜高粱秸稈糖提取率的影響

圖3為浸提溫度對(duì)甜高粱秸稈提取效果的影響，當(dāng)料液比 1∶4，浸提時(shí)間 2 h，分別在 20、60、70、80、90℃下浸提，重復(fù)3次，蒽酮法測(cè)定總糖百分.結(jié)果表明，在相同浸提時(shí)間(2 h)條件下，溫度對(duì)甜秸稈中可溶性糖的影響在20～60℃時(shí)糖的浸提率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，在60～80℃之間相差不大且浸提率有下降趨勢(shì)，而在90℃時(shí)浸提率有一定程度的下降.原因可能是在60℃以下，隨著溫度的升高，糖的溶出率增加，而在90℃，還原糖可能與其他組分發(fā)生反應(yīng)，造成浸提率的下降.綜合考慮能耗及浸出率，浸提溫度宜選擇60℃，該條件下浸提率為19.01%.

圖3 浸提溫度對(duì)甜高粱秸稈提取效果的影響

2.4 時(shí)間對(duì)甜高粱秸稈中可溶性糖提取的影響

圖4為提取時(shí)間對(duì)甜高粱秸稈中可溶性糖提取的影響，當(dāng)料液比1∶4，水浴60℃條件下，分別提取 0.5、1、1.5、2、2.5 h，重復(fù) 3 次，蒽酮法測(cè)定總糖百分含量.結(jié)果表明，0.5 h與1 h，2 h的浸提率相差較大，隨著時(shí)間的增加浸提率不斷提升，而在2.5 h時(shí)，與2 h時(shí)的浸提率相差不大，甚至還有所下降，綜合考慮，選擇2 h時(shí)浸提為最佳提取條件.

料液比1∶4，60℃提取2 h，該條件處理后的樣品可溶性糖提取率較好，甜秸稈浸提后總糖百分含量為19.01%.

圖4 時(shí)間對(duì)甜高粱秸稈中可溶性糖提取的影響

2.5 離子色譜法測(cè)定秸稈中糖的種類

將上述最佳條件下提取得到的可溶性糖樣品，采用250 mmol/L NaOH等度淋洗23 min，分離測(cè)定可溶性糖，結(jié)果如圖5、6所示.甜高粱秸稈中主要含有葡萄糖、果糖、蔗糖，見表3，其質(zhì)量濃度分別為 51.53、42.808、7.544 mg/L.

圖5 葡萄糖、果糖、蔗糖混標(biāo)離子色譜圖

圖6 甜高粱可溶性糖離子色譜分析

表3 甜秸稈中可溶性糖離子色譜分析結(jié)果

3 結(jié)語

在試驗(yàn)范圍內(nèi)，甜高粱秸稈的最佳提取工藝條件為:料液比1∶4，60 ℃浸提，浸提2 h.在此條件下，甜秸稈可提取出總糖19.01%(以葡萄糖當(dāng)量計(jì))，其中蔗糖占43.35%，還原糖占25.6%，葡萄糖14.2%，果糖占11.36%.甜高粱秸稈中可溶性糖含量較高，如將其進(jìn)一步開發(fā)利用，并作為天然甜味汁液用于飲料的開發(fā)等產(chǎn)品上，發(fā)展前景可觀.

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