張鐵輝等

[摘要] 目的 探討垂體瘤轉(zhuǎn)化基因（PTTG）在垂體細(xì)胞衰老和垂體瘤中表達(dá)規(guī)律。 方法 構(gòu)建F344大鼠D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型和雌激素誘導(dǎo)泌乳素腺瘤模型。觀察大鼠的衰老表型及成瘤情況，對大鼠垂體進(jìn)行病理學(xué)檢測，分子生物學(xué)方法檢測垂體PTTG、P53、P21、P16蛋白表達(dá)。 結(jié)果 ①D-半乳糖成功誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)明顯衰老特征，雌激素誘導(dǎo)大鼠成功生成泌乳素腺瘤；②衰老大鼠垂體胞質(zhì)內(nèi)有空泡和異染色質(zhì)生成，腫瘤大鼠垂體PRL免疫組化為強陽性；③RT-PCR顯示雌激素誘導(dǎo)組PTTG mRNA表達(dá)為（12.99±1.86），D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組PTTG表達(dá)為（2.10±0.23），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組P53、P16、P21 mRNA表達(dá)為（113.51±23.87）、（29.26±4.44）、（67.21±10.08），在雌激素誘導(dǎo)垂體瘤組中表達(dá)為（83.26±8.06）、（9.83±2.13）、（28.19±2.01），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。④Western-blot條帶積分灰度值顯示D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組PTTG、P21、P16蛋白表達(dá)為（0.198 ±0.032）、（1.239±0.051）、（1.673±0.055），雌激素誘導(dǎo)垂體瘤中表達(dá)為（1.002±0.041）、（0.202±0.055）、（0.409 ±0.059），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 PTTG基因過表達(dá)導(dǎo)致衰老繞過，垂體瘤形成。PTTG表達(dá)減弱，誘導(dǎo)衰老。P16、P21是垂體細(xì)胞衰老重要的調(diào)控因子。

[關(guān)鍵詞] 垂體瘤轉(zhuǎn)化基因；垂體瘤；衰老

[中圖分類號] R736.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）05（c）-0007-05

[Abstract] Objective To investigate the pituitary tumor transforming gene （PTTG） expression pattern in pituitary cell senescence and pituitary adenoma tumorigenesis. Methods D-galactose induced F344 rats aging model. The rats aging expression and tumor generation condition were observed through pathological detection， molecular biology method was used to measure the expression of PTTG， P53， P21， P16 in pituitary tissue. Results ①D-galactose induced F344 rats showed significant characteristics of aging and oestrogen induced rats successfully generated prolactin adenoma； ②aging Rats visible cytoplasmic vacuoles occurred， heterochromatin exists in the pituitary cell， pituitary PRL immunohistochemical was strong positive in tumor group rats； ③RT-PCR showed that PTTG mRNA expression in estrogen induced pituitary adenoma group was （12.99±1.86）， PTTG expression of D-galactose induced aging group was （2.10±0.23）， the difference was statistically significant （P < 0.01）； P53， P16， P21 mRNA expression of D-galactose induced aging group was （113.51±23.87）， （29.26±4.44）， （67.21±10.08）， P53， P16， P21 mRNA expressed in estrogen induction of pituitary adenoma group was （83.26±8.06）， （9.83±2.13）， （28.19±2.01）， the differences were statistically significant （P < 0.05）； ④Western-blot strip integral grey value showed PTTG， P21 and P16 protein expression of D-galactose induced aging group was （0.198±0.032）， （1.239±0.051）， （1.673±0.055） and expressed in estrogen induced pituitary adenoma group was （1.002±0.041）， （0.202±0.055）， （0.409±0.059）， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion PTTG over-expression leads to senescence bypassed pituitary adenoma formation， PTTG weak expression leads to senescence. P16， P21 are important regulatory factors in pituitary cell senescence.

[Key words] Pituitary tumor transforming gene； Pituitary adenoma； Senescence

垂體瘤轉(zhuǎn)化基因（pituitary tumor transforming gene，PTTG）是1997年P(guān)ei等[1]首次從大鼠垂體瘤組織中發(fā)現(xiàn)的新癌基因，PTTG在垂體腺瘤及其他腫瘤中均有較高水平的表達(dá)，與腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移、血管形成、復(fù)發(fā)、預(yù)后密切相關(guān)[2-3]。近期Chesnokova等[4]研究發(fā)現(xiàn)垂體細(xì)胞內(nèi)PTTG水平表達(dá)降低和缺失會誘發(fā)DNA損傷調(diào)控反應(yīng)（DNA damage checkpoint response，DDR）導(dǎo)致衰老產(chǎn)生，進(jìn)而阻止腫瘤發(fā)生及惡變，說明垂體瘤增殖過程存在衰老。提出癌基因的活化既可以導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生，又可以誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，稱作癌基因誘導(dǎo)細(xì)胞衰老（oncogene-induced senescence，OIS）[5]。癌基因具有誘導(dǎo)腫瘤衰老和腫瘤增殖惡變的能力，設(shè)想通過調(diào)控癌基因誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老，可以作為治療腫瘤的新方向。本研究擬通過建立F344 大鼠D-半乳糖亞急性衰老模型，同時通過雌激素誘導(dǎo)大鼠泌乳素腺瘤形成，探討PTTG及衰老通路中相關(guān)因子在垂體細(xì)胞衰老和垂體瘤生長過程中的表達(dá)，初步闡明癌基因誘導(dǎo)衰老在垂體瘤發(fā)生過程中作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

100 g左右4周齡雌性F344大鼠18只[購自北京維通利華實驗動物中心，許可證號SCXK（京）2012-0001]。隨機分為三組，正常對照組、D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組和雌激素誘導(dǎo)垂體瘤組，每組各6只。本研究經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，嚴(yán)格按照NIH實驗動物倫理原則進(jìn)行操作。

1.2 主要試劑及設(shè)備

≥98%的β-雌二醇（Sigma公司），≥98%的D-半乳糖（Sigma公司），醫(yī)用硅膠管（內(nèi)經(jīng)2 mm，外徑3 mm，濟南晨生醫(yī)用導(dǎo)管公司），鼠抗鼠單克隆PTTG抗體（abcam公司），鼠抗鼠單克隆P16抗體（abcam公司）。SYBR green master rox（Roche公司），transcriptor first strand cDNA Synthesis Kit（Roche公司）。

1.3 構(gòu)建大鼠衰老模型及垂體泌乳素腺瘤模型

10%水合氯醛按0.2 mL/100g腹腔注射麻醉，將含有10 mg E2無菌硅膠管植入雌激素誘導(dǎo)垂體瘤組大鼠背部皮下，正常對照組及D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組植入含有生理鹽水的硅膠管。D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組于術(shù)后7 d連續(xù)腹腔內(nèi)注射D-半乳糖200 mg/（kg·d），造成亞急性衰老；正常對照組、雌激素誘導(dǎo)垂體瘤組術(shù)后7 d腹腔內(nèi)注射同等量生理鹽水對照。觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、體重、進(jìn)食及尿量、肌肉是否有萎縮、毛發(fā)光澤度及有無脫毛等。術(shù)后第8周，斷頭處死全部大鼠。解剖垂體，觀察垂體形狀、大小、質(zhì)地及顏色，同視神經(jīng)及頸內(nèi)動脈比鄰關(guān)系，觀察垂體窩鞍底形狀，骨質(zhì)是否破壞。

1.4 垂體病理學(xué)檢測

垂體標(biāo)本常規(guī)HE染色，采用S-P法進(jìn)行免疫組化染色，一抗為大鼠PRL單克隆抗體（murine，Dako公司，美國）。用PBS代替一抗平行染體做陰性對照。

1.5 RT-PCR檢測垂體組織中PTTG、P53、P21、P16 mRNA表達(dá)

PTTG、P53、P21、P16基因的引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。按照93℃，3 min；95℃，1 min，60℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 4 min；30 cycle擴增目的基因，對每個基因設(shè)β-actin做內(nèi)參，內(nèi)參基因為Rps16。

1.6 Western-blot檢測垂體組織中PTTG、P16、P21表達(dá)

每組取3只大鼠垂體組織，提取垂體組織總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，滴加稀釋的Anti-p16 antibody、Anti-p21 antibody，Anti-PTTG antibody，DAB顯色。照相記錄圖像，蛋白感光條帶用Kodak Carestream Molecular Imagine 軟件測量積分灰度值，以各組蛋白表達(dá)量與β-Action比值進(jìn)行半定量分析，顯示目的基因的蛋白表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物一般狀態(tài)

6周后，D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、毛色晦暗，背部及面頰部脫毛；與正常對照組比較，尿量有所增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與正常對照組比較，雌激素誘導(dǎo)垂體瘤組大鼠尿量明顯增加，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表1。

2.2 解剖學(xué)觀察

雌激素誘導(dǎo)垂體瘤組大鼠垂體重量高于正常對照組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組大鼠垂體重量小于正常對照組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組大鼠垂體重量明顯小于雌激素誘導(dǎo)垂體瘤組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表1。正常對照組垂體粉紅色，位于鞍內(nèi)，雙側(cè)視神經(jīng)之間，其上覆蓋鞍隔。D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組垂體明顯縮小，表面皺縮，質(zhì)地較韌。雌激素誘導(dǎo)垂體瘤組垂體窩明顯擴大，形成大于正常對照組數(shù)倍體積的腫瘤，鞍底骨質(zhì)受壓變薄，視神經(jīng)移位，鞍隔上抬，腫瘤有假包膜存在，質(zhì)地軟，分離腫瘤易出血。

2.3 垂體組織學(xué)觀察

雌激素誘導(dǎo)垂體瘤組細(xì)胞排列紊亂，正常垂體腺管樣結(jié)構(gòu)消失，核大小不一致，可見不典型性增生呈腫瘤樣改變；D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組垂體細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞間隙擴大，血管網(wǎng)稀疏，部分細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡樣改變，細(xì)胞膜皺縮，異染色質(zhì)形成存在于細(xì)胞內(nèi)。D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組內(nèi)PRL基本沒有表達(dá)，無明顯細(xì)胞內(nèi)顆粒染色，正常對照組有PRL低表達(dá)，鏡下陽性細(xì)胞占比例很少，雌激素誘導(dǎo)垂體瘤組大于80%細(xì)胞內(nèi)表達(dá)陽性。見圖1（封三）。

2.4 RT- PCR檢測垂體組織內(nèi)PTTG、P53、P16、P21 mRNA表達(dá)

RT-PCR顯示雌激素誘導(dǎo)組PTTG mRNA表達(dá)最高為（12.99±1.86），D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組PTTG表達(dá)最低為（2.10±0.23），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組P53、P16、P21 mRNA表達(dá)最高為（113.51±23.87）、（29.26±4.44）、（67.21±10.08），在雌激素誘導(dǎo)垂體瘤組中表達(dá)略升高，分別為（83.26±8.06）、（9.83±2.13）、（28.19±2.01），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2。

2.5 Western-blot檢測垂體組織中PTTG、P16、P21蛋白表達(dá)

Western-blot條帶積分灰度值顯示D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組PTTG、P21、P16蛋白表達(dá)為（0.198±0.032）、（1.239±0.051）、（1.673±0.055），雌激素誘導(dǎo)垂體瘤中表達(dá)為（1.002±0.041）、（0.202±0.055）、（0.409 ±0.059），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其中雌激素誘導(dǎo)垂體瘤組PTTG表達(dá)最高，D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組垂體中表達(dá)最低。P16、P21在D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組垂體表達(dá)最高，在雌激素誘導(dǎo)垂體瘤組中表達(dá)最低。見圖3。

3 討論

組織學(xué)上大多數(shù)垂體腺瘤是良性腫瘤，雖然部分垂體瘤表現(xiàn)侵襲性生長，但很少有惡變和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。部分垂體微腺瘤表現(xiàn)為停止生長，微小泌乳素腺瘤能夠進(jìn)行自我消除，說明在垂體瘤發(fā)生中存在內(nèi)在的衰老機制[6]。不可逆的生長抑制和具有代謝活性是細(xì)胞衰的老兩個標(biāo)志性特征，表現(xiàn)為半乳糖苷酶（β-galactosidase，SA-β-GAL）活性增加和異染色質(zhì)凝聚（senescence-associated heterochromatic foci，SAHF），研究發(fā)現(xiàn)DNA損傷和癌基因活化均可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老[5，7]。癌基因誘導(dǎo)衰老是癌基因突變所產(chǎn)生的異常增殖信號，通過P16INK4A-Rb，ARF-P53-P21信號通路激活衰老，造成癌基因不穩(wěn)定性增加，恢復(fù)和提升腫瘤抑制基因活性，使細(xì)胞處于生長停滯狀態(tài)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，是預(yù)防腫瘤發(fā)生及惡變的重要保護屏障[7-9]。所以對垂體泌乳素腺瘤的癌基因——PTTG進(jìn)行研究，探討其是否參與垂體細(xì)胞的早熟及增殖衰老中，有助于重新認(rèn)識垂體瘤的發(fā)生機制，為垂體瘤治療提供新的思路和方法。

PTTG是有絲分裂中的安全素樣蛋白具有分離蛋白抑制酶活性，能阻斷有絲分裂過程中姐妹染色體的分離，引起非整倍體出現(xiàn)，導(dǎo)致基因不穩(wěn)定和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，同時PTTG有效調(diào)控下游目標(biāo)靶基因，如成纖維細(xì)胞生長因子2（bFGF-2）及C-myc、P21、MMP2、cyclinD3等表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤血管形成、轉(zhuǎn)移、侵襲力增強等，與腫瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)[10-12]。近期研究發(fā)現(xiàn)PTTG能夠干擾P53與DNA的結(jié)合能力，抑制P53下游基因P21的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白表達(dá)，從而抑制P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤增殖，在垂體腺瘤的形成和生長過程中起重要的作用。PTTG發(fā)揮調(diào)節(jié)衰老和凋亡主要通過蛋白-蛋白之間相互作用、細(xì)胞因子旁分泌-自分泌刺激和激活靶基因三條途徑完成[13-15]。本次實驗結(jié)果顯示在雌激素誘導(dǎo)垂體瘤組大鼠中PTTG mRNA表達(dá)水平較其他組明顯增高，在D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組垂體中PTTG表達(dá)明顯降低，所以PTTG可以看作垂體瘤的癌基因，PTTG的持續(xù)作用可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。

癌基因誘導(dǎo)衰老能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，主要是通過P16INK4A-pRb和ARF-P53這兩條信號通路發(fā)揮作用，P16和P21-P53是衰老信號通路網(wǎng)絡(luò)中的兩個重要的控制節(jié)點[13，16]。對垂體瘤細(xì)胞衰老的研究發(fā)現(xiàn)，敲除PTTG的垂體細(xì)胞啟動了依賴P53-P21的衰老途徑，抑制了細(xì)胞周期進(jìn)展所需的CDK2活性、Rb基因磷酸化等，從而抑制腫瘤增殖[4，17]。研究發(fā)現(xiàn)PTTG基因缺失裸鼠中表現(xiàn)明顯垂體衰老特點，觸發(fā)ARF-P53-P21衰老信號通路，使凋亡阻滯，誘導(dǎo)衰老產(chǎn)生，阻止垂體瘤產(chǎn)生。PTTG主要通過調(diào)控P21的表達(dá)而影響細(xì)胞衰老的進(jìn)程。但是奇怪的是，在GH3細(xì)胞系中，過表達(dá)PTTG反而會上調(diào)P21的表達(dá)，從而促進(jìn)衰老的發(fā)生。PTTG表達(dá)與P21呈負(fù)相關(guān)，調(diào)節(jié)P21會減弱PTTG表達(dá)，抑制腫瘤增殖。此研究同時指出PTTG表達(dá)水平過低誘發(fā)垂體細(xì)胞衰老，PTTG表達(dá)過高，繞過衰老，形成腫瘤。說明PTTG的表達(dá)失衡，誘發(fā)和繞過衰老，本實驗也證實垂體內(nèi)PTTG表達(dá)失衡導(dǎo)致垂體瘤生成[15，17]。

細(xì)胞衰老及凋亡都是通過激活P53下游靶基因P21而觸發(fā)。本實驗發(fā)現(xiàn)亞急性衰老大鼠垂體P53蛋白表達(dá)明顯增高，研究也指出P53僅僅在腫瘤生長早期（未成熟衰老）表達(dá)升高[13，18]，本實驗也發(fā)現(xiàn)P53在雌激素誘導(dǎo)垂體瘤中表達(dá)比正常對照組高，說明垂體細(xì)胞在經(jīng)歷了癌基因刺激后，產(chǎn)生DNA損傷突變，腫瘤生成過程中存在P53蛋白參與的細(xì)胞衰老，引進(jìn)并保持垂體腫瘤細(xì)胞一定程度的衰老，抑制垂體瘤細(xì)胞進(jìn)一步增殖，說明在垂體衰老中P53蛋白參與調(diào)控衰老和維持衰老。

P21是P53的一個經(jīng)典靶基因，同時也是細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，與細(xì)胞凋亡和衰老密切相關(guān)[19]。本實驗發(fā)現(xiàn)P21在衰老組垂體細(xì)胞中的表達(dá)是腫瘤細(xì)胞組的3倍，提示垂體細(xì)胞衰老與P21的誘導(dǎo)密切相關(guān)。衰老組PTTG表達(dá)水平降低，癌基因表達(dá)失衡能激活P53使P21表達(dá)增加，引起細(xì)胞衰老，表明P21參與誘發(fā)垂體細(xì)胞衰老與癌基因刺激的喪失密切相關(guān)。當(dāng)癌基因表達(dá)水平下降的時候，P21由于失去癌基因刺激產(chǎn)生早熟衰老，引起細(xì)胞生長停滯，設(shè)想提高P21表達(dá)能夠誘導(dǎo)衰老和限制垂體瘤細(xì)胞增殖和惡變[13]。

P16基因是細(xì)胞周期依賴性激酶CDK4抑制劑，P16INK4A同CDK4結(jié)合調(diào)控視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Rb蛋白磷酸化水平，使Rb基因與轉(zhuǎn)錄因子E2F相結(jié)合，處于非磷酸化狀態(tài)，進(jìn)而抑制細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯，產(chǎn)生衰老，因此又稱為衰老相關(guān)基因[20]。P16有特異的自我更新功能，能夠持續(xù)的表達(dá)，維持衰老通路的完整性[19-20]。本實驗發(fā)現(xiàn)正常對照組內(nèi)P16水平也較垂體瘤組內(nèi)升高，也行正常垂體內(nèi)存在一定程度的衰老，正常的垂體衰老是抑制內(nèi)分泌細(xì)胞過度增殖導(dǎo)致分泌激素過量，是機體的一種平衡和保護機制。垂體瘤內(nèi)P16水平下降并與P21表達(dá)正相關(guān)，說明大鼠在雌激素及癌基因的持續(xù)刺激下，P16表達(dá)下降，早熟衰老消失，腫瘤增殖。所以如何提高腫瘤進(jìn)展期衰老相關(guān)基因表達(dá)，誘導(dǎo)衰老限制腫瘤增殖和惡性變，是將來研究的重點。

本實驗證實在衰老垂體呈中PTTG表達(dá)水平明顯下降，與P53、P21、P16表達(dá)負(fù)相關(guān)，說明D-半乳糖激活垂體細(xì)胞ARF-P53-P21/PRb-P16衰老通路，P53、P21表達(dá)提升，抑制PTTG的表達(dá)，引起細(xì)胞生長停滯。而雌激素作用引起PTTG表達(dá)增高，導(dǎo)致姐妹染色體分離受限，細(xì)胞周期停滯，非整倍體形成，發(fā)生了癌基因表達(dá)水平失衡誘發(fā)的早熟衰老，但是由于雌激素持續(xù)釋放，PTTG明顯升高產(chǎn)生衰老繞過，進(jìn)一步引起細(xì)胞損傷，產(chǎn)生垂體瘤細(xì)胞增殖。設(shè)想通過調(diào)控PTTG誘發(fā)衰老，使垂體瘤細(xì)胞增殖停滯、侵襲性降低、激素異常分泌，有較大臨床應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2015-02-10 本文編輯：蘇 暢）