鄭浩　李占魯　孔旭鋼　沈嘯華　傅國(guó)勝

[摘要]目的觀察香煙煙霧提取物（CSE）對(duì)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）衰老的影響，探討其司能機(jī)制。方法 密度梯度離心法獲取人外周血單核細(xì)胞，培養(yǎng)4d后，收集貼壁細(xì)胞，分別加入2.5%，5%，10%和15%的CSE干預(yù)。采用SA-β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測(cè)衰老細(xì)胞；MIT比色法檢測(cè)EPC的增殖能力；端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法（TRAP）.ELIsA定量檢測(cè)EPC端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性；逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄因子（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）mRNA水平；Western蛋白印跡檢測(cè)EPC Akt Ser磷酸化水平。結(jié)果CSE能顯著增加SA-β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞數(shù)量，15%CSE影響最為明顯，同時(shí)顯著抑制EPC增殖能力；CSE能顯著抑制端粒酶活性及hTERT mRNA表達(dá)；另外，CSE能抑制EPCAkt磷酸化。結(jié)論CSE誘導(dǎo)EPC衰老，伴隨EPC增殖能力的損害，提示細(xì)胞衰老也許是CSE影響EPC功能的機(jī)制之一；CSE誘導(dǎo)EPC衰老可能與抑制EPC端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性、減少hTERT mRNA表達(dá)及抑制Akt磷酸化有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]香煙煙霧提取物；內(nèi)皮祖細(xì)胞；衰老；端粒末端轉(zhuǎn)移酶

中圖分類號(hào)：R446.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-816X（2016）05-0348-03

自1977年Asahara及其同事第一次提出內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell，EPC）以來，越來越多的證據(jù)顯示EPC在缺血組織的血管新生中扮演的重要作用。香煙煙霧中含有超過4000多種有毒物質(zhì)。香煙煙霧提取物（cigarette smoking extract，CSE）幾乎包含了香煙中所有的成分，如尼古丁、焦油等。研究顯示，長(zhǎng)期吸煙可以明顯下降外周血EPC的數(shù)量及功能，后者與心血管危險(xiǎn)因素的發(fā)生有密切關(guān)系，甚至發(fā)現(xiàn)吸煙者的EPC在培養(yǎng)早期就出現(xiàn)大量死亡。但是吸煙致EPC功能損傷的具體機(jī)制尚不明確。細(xì)胞的增殖能力受細(xì)胞分化及衰老所調(diào)控。最近的研究表明，EPC數(shù)量減少、功能減退與細(xì)胞衰老有關(guān)。細(xì)胞衰老的機(jī)制尚不十分清楚，目前認(rèn)為端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性與細(xì)胞衰老關(guān)系密切。本研究利用體外培養(yǎng)人外周血單核細(xì)胞源的EPC，觀察不同濃度的CSE對(duì)EPC增殖功能的影響，進(jìn)一步探討CSE對(duì)EPC衰老的影響及其可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑：人纖維連接蛋白（human fi-bronectin，HFN）購自Chemicon公司；淋巴細(xì)胞分離液購自Cedarlane公司；EGM-2MV購自Clonetic公司；二苯基四氮唑溴鹽（MTT）購自華美生物工程公司，進(jìn)口分裝；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒（Senescenceβ-Galactesidase Staining Kit）購自Biovision公司；TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA試劑盒購自Roche公司；Trizol購自Invitrogen公司；抗phospho-Akt-Ser473單克隆抗體、抗Akt單克隆抗體購自Cell Signalling Technology公司。

1.2方法：

1.2.1 EPC分離、培養(yǎng)：取健康、非吸煙成人空腹外周血20ml，密度梯度離心法獲取單核細(xì)胞（MNCs）。將MNCs接種于HFN包被的培養(yǎng)板。EGM-2 MV培養(yǎng)基（含EBM-2，5%胎牛血清及VEGF-A、hFGF-2、hEGF、IGF-1、維生素、抗生素）培養(yǎng)4d，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗掉非貼壁細(xì)胞，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至7d，PBS洗掉非貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)用。貼壁細(xì)胞隨機(jī)分為5組：（1）對(duì)照組：含5%胎牛血清的EGM-2MV培養(yǎng)基（含EBM-2及VEGF-A、hFGF-2、hEGF、IGF-1、維生素、抗生素）；（2）香煙煙霧提取劑各濃度組（共4組）：加入2.5%，5%，10%及15%CSE干預(yù)。

1.2.2香煙煙霧提取物制備：參照Carp和Janoff方法并改良，將一支去過濾嘴香煙連于一個(gè)連續(xù)抽吸驅(qū)動(dòng)裝置，每支煙吸5min，一共抽吸兩支香煙。吸入的煙霧經(jīng)過真空容器的一個(gè)入口通入50ml的EBM培養(yǎng)液中制成懸液，懸液用NaOH調(diào)至pH 7.4，經(jīng)0.22um微孔濾膜（購自Millipore公司）過濾做為CSE原液。配置好的CSE于30min之內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。CSE原液加入含EPC的培養(yǎng)液中稀釋成所需濃度。10%的CSE作用大致相當(dāng)于每天吸入30支香煙。

1.2.3細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色：在EPC培養(yǎng)7d后，加入各濃度的CSE干預(yù)24h，再進(jìn)行SA-β-半乳糖苷酶染色。按照試劑盒提示說明書操作，鏡下觀察，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，確定藍(lán)色細(xì)胞百分比。

1.2.4增殖能力檢測(cè)：在培養(yǎng)第7d消化細(xì)胞、計(jì)數(shù)，采用MTF方法檢測(cè)EPC增殖能力。

1.2.5 TRAP-PCR-ELISA法檢測(cè)端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性：在EPC培養(yǎng)7d后，加入各濃度的CSE干預(yù)24h，按照TRAP-PCR-ELISA法進(jìn)行端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)采用SPSSl0.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間資料比較采用ANOVA檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 CSE對(duì)EPC衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色、抑制EPC增殖能力、EPC端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性的影響：我們之前的研究顯示，剛分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞是圓形的，體積較小，懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)7d后形成了梭形的內(nèi)皮樣細(xì)胞。用FITC-UEA.T和acLDL-Dil對(duì)細(xì)胞染色后，通過共聚焦顯微鏡鑒定，UEA.T和DiLDL雙染色陽性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPC。流式細(xì)胞儀檢測(cè)貼壁細(xì)胞表面標(biāo)志，即VEGFR2，CD34和AC133的表達(dá)以進(jìn)一步確定為分化中的EPC。結(jié)果顯示，加入CSE與EPC培養(yǎng)24h后，可以明顯增加SA-β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞數(shù)量。其作用呈明顯的劑量相關(guān)性，與對(duì)照組相比，15% CSE作用最為顯著。CSE誘導(dǎo)EPC衰老，我們進(jìn)一步觀察CSE是否能影響EPC增殖能力。MTF法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CSE在誘導(dǎo)EPC凋亡的同時(shí)可以顯著抑制EPC的增殖功能。CSE加入EPC培養(yǎng)24h后抑制EPC端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性，其作用呈明確的劑量相關(guān)性，見表1。

2.2 CSE對(duì)EPC human telomerase reverse transcriptase（hTERT）mRNA表達(dá)的影響：為了觀察CSE對(duì)EPChTERTmRNA表達(dá)的影響，將不同濃度的CSE加入EPC培養(yǎng)6h，半定量RT-PCR結(jié)果顯示，CSE能顯著抑制hTERT mRNA的表達(dá)，呈明顯的量效關(guān)系，在15%的濃度時(shí)最為明顯，見圖1。

2.3 CSE對(duì)EPC Akt活性的影響：最近研究表明Akt在調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老和端粒酶活性中扮演重要角色，因此，我們觀察了CSE對(duì)EPC活性的影響。Western蛋白印跡結(jié)果顯示，加入不同濃度CSE分別培養(yǎng)15min后，磷酸化Akt的表達(dá)隨CSE濃度的增加而顯著減少，在15%時(shí)達(dá)到最大效應(yīng)。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，CSE可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)EPC的衰老，伴隨著其增殖能力的降低。大量的研究顯示，EPC衰老與EPC數(shù)量減少和功能損害有關(guān)。長(zhǎng)期吸煙可以明顯下降外周血EPC的數(shù)量及功能，本研究為該現(xiàn)象提供了一定的分子學(xué)機(jī)制。在細(xì)胞分子水平上，染色體末端端粒的損耗是衰老的重要機(jī)制，端粒丟失最終可造成細(xì)胞衰老直至凋亡。端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，能以自身RNA為模板合成端粒DNA并添加到染色體末端，延長(zhǎng)真核細(xì)胞染色體端粒。因此端粒酶活性缺乏可造成端粒長(zhǎng)度的縮短從而誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。大量研究顯示，各種心血管危險(xiǎn)因子可以降低大鼠或人外周血EPC端粒長(zhǎng)度及端粒酶活性，同時(shí)能增加衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞比例。我們之前研究亦發(fā)規(guī)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α延緩EPC的衰老可能與端粒酶活動(dòng)增加及端粒長(zhǎng)度延長(zhǎng)有關(guān)。因此，我們推斷EPC衰老可能與端粒端粒酶有關(guān)。

hTERT mRNA的表達(dá)和端粒酶的活性具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。我們近期的研究亦顯示，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α抑制EPC衰老及促進(jìn)缺血組織再內(nèi)皮化與其促進(jìn)hTERT mRNA表達(dá)有關(guān)。本研究顯示，CSE能降低EPC端粒酶活性，同時(shí)亦能抑制EPC hTERTmRNA的表達(dá)，據(jù)此我們推測(cè)CSE誘導(dǎo)EPC衰老可能與其抑制EPC端粒酶活性及抑制hTERT mRNA的表達(dá)有關(guān)。細(xì)胞衰老機(jī)制除了端粒學(xué)說（即復(fù)制下衰老）之外，尚有非端粒學(xué)說，后者包括氧自由基學(xué)說及DNA損傷學(xué)說。香煙煙霧中包含了4000多種物質(zhì)，其中就包括大量的自由基和氧化劑。吸煙導(dǎo)致NO合成減少、EPC功能損傷與氧化應(yīng)激有關(guān)。因此，CSE誘導(dǎo)EPC衰老的相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。