李靳+鄧麗麗+周志勇+袁丁+張長城+王婷

[摘要]研究三七總皂苷（total saponins of Panax notoginseng，TPNS）聯(lián)合淫羊藿總黃酮（total flavonoids of epimedium，TFE）改善D-半乳糖（D-galactose，D-gal）致H9c2大鼠心肌細(xì)胞衰老的保護(hù)作用及可能機(jī)制。采用50 mol·L^-1D-gal處理H9c2大鼠心肌細(xì)胞，以不同濃度TPNS單藥、TFE單藥、TPNS聯(lián)合TFE預(yù)處理細(xì)胞4 h，D-gal刺激H9c2心肌細(xì)胞24 h，MTT檢測細(xì)胞活率進(jìn)而確定協(xié)同效果最佳的聯(lián)合方案；β-半乳糖苷酶染色法鑒定細(xì)胞衰老程度；DCFH-DA探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxgen species，ROS）水平；線粒體膜電位法（JC-1）檢測線粒體膜電位變化情況；Western blot檢測沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶類1（silentmating type information regulation 2 Homolog-1，SIRT1），過氧化物酶體激活物受體γ輔激活因子1α（peroxisomal proliferator-activated receptor-coactivator 1α，PGC-1α），沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶類3（silentmating type information regulation 2 homolog-3，SIRT3）蛋白表達(dá)情況。研究表明TPNS（5 mg·L^-1）聯(lián)合TFE（5 mg·L^-1）對H9c2心肌細(xì)胞增殖具有顯著的協(xié)同作用（Q=1.154），因此確定其為協(xié)同作用最佳的聯(lián)合方案；TPNS（5 mg·L^-1）聯(lián)合TFE（5 mg·L^-1）顯著降低β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞數(shù)目和ROS熒光強(qiáng)度，顯著提高線粒體膜電位和SIRT1，PGC-1α，SIRT3蛋白的表達(dá)量。TPNS（5 mg·L^-1）聯(lián)合TFE（5 mg·L^-1）可產(chǎn)生改善D-gal致H9c2大鼠心肌細(xì)胞衰老的保護(hù)作用，機(jī)制可能與調(diào)節(jié)SIRT1/PGC-1α和SIRT3信號通路，進(jìn)而調(diào)控線粒體的功能和減少氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]三七總皂苷； TFE； 衰老

[Abstract]To investigate the protective effect of Panax notoginseng saponins combined with total flavonoids of epimedium on D-gal-induced senescence of H9c2 cells and explore its underlying mechanisms. The 50 mol·L^-1D-gal was used to induce H9c2 cells senescence. Different concentrations of TPNS， TFE， and TPNS combined with TFE were used for 4 hours for pre-treatment. D-gal was used to stimulate H9c2 cardiac muscle cells for 24 h. Then in order to determine the best combined scheme， MTT was used to detect cell viability. Cell senescence was identified by β-galactosidase staining. Levels of reactive oxygen species（ROS） was observed by DCFH-DA detection. The changes of mitochondrial membrane potential were identified by JC-1 detection. Protein levels of silentmating type information regulation 2 Homolog-1（SIRT1）， peroxisomal proliferator-activated receptor-coactivator 1α（PGC-1α） and silentmating type information regulation 2 Homolog-3（SIRT3） were detected by western blot analysis. The results showed that TPNS（5 mg·L^-1） combined with TFE（5 mg·L^-1） had significant synergistic effect on H9c2 myocardial cell proliferation（Q=1.154）， so 5 mg·L^-1TPNS combined with 5 mg·L^-1 TFE was determined as the best scheme. The quantity of β-galactosidase staining and the fluorescence intensity of ROS were apparently decreased in 5 mg·L^-1TPNS combined with 5 mg·L^-1TFE scheme. Meanwhile， it markedly increased the florescence intensity of mitochondrial membrane potential and enhanced the protein expression of SIRT1， PGC-1α and SIRT3. TPNS combined with TFE could protect H9c2 cells from D-gal-induced senescence. The mechanism might be related to adjusting the signal pathways of SIRT1/PGC-1α， SIRT3， adjusting the structure and function of mitochondria and reducing oxidative stress injury.

[Key words]total saponins of Panax notoginseng； total flavonoids of epimedium； senescence

隨著年齡的增長，由心臟衰老導(dǎo)致的心血管疾病接踵而至，嚴(yán)重威脅患者的生命。心肌細(xì)胞是心臟發(fā)揮功能的主要細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞衰老可導(dǎo)致心血管疾病^[1]。心肌細(xì)胞衰老的作用機(jī)制仍不清楚，因此尋找延緩心肌細(xì)胞衰老的有效藥物對防治心血管疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

三七總皂苷（total saponins of Panax notoginseng，TPNS）具有抗氧化應(yīng)激的作用^[2]。TPNS對H9c2大鼠心肌細(xì)胞衰老具有保護(hù)作用^[3]。TFE具有消除氧自由基，抗氧化應(yīng)激等作用^[4]， 淫羊藿總黃酮（total flavonoids of epimedium，TFE）可通過減輕氧化應(yīng)激和減少細(xì)胞早期凋亡來對抗H9c2大鼠心肌細(xì)胞衰老^[5]。然而，TPNS聯(lián)合TFE對D-gal致H9c2大鼠心肌細(xì)胞衰老的保護(hù)作用及機(jī)制研究尚未見國內(nèi)（外）文獻(xiàn)報道。因此本實驗建立心肌細(xì)胞衰老模型，探討TPNS聯(lián)合TFE改善H9c2大鼠衰老心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 H9c2大鼠心肌細(xì)胞，購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

1.2 藥物與試劑 TPNS（購于成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>95%）；TFE（購于成都仁誠生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%）；D-gal（Sigma公司，1724619）；高糖DMEM（GIBCO公司，884684）；胎牛血清（GIBCO公司，10099141）；胰蛋白酶（GIBCO公司，EC2901）；細(xì)胞衰老特異性-半乳糖苷酶原位染色試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，GMS10012.1）；活性氧檢測試劑盒（普利萊基因技術(shù)有限公司，C1300）；線粒體膜電位檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，C2005）；SIRT3抗體（Millipore，2199719）；SIRT1抗體（Millipore，2465249）；β-actin（谷歌生物，GB13001）；PGC-1α（Santa Cruz，sc-13067）。

1.3 儀器 生物潔凈工作臺（蘇州安泰空氣有限公司）；NU-4750E型二氧化碳培養(yǎng)箱（NuAire公司）；DMR型多功能顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（Syngne公司）；JA2003電子分析天平（上海天平儀器廠）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥 基于前期工作基礎(chǔ)^[2，4]，H9c2大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清、青霉素100 U·mL^-1、鏈霉素100 U·mL^-1）。將培養(yǎng)瓶放于37 ℃，5%CO₂無菌培養(yǎng)箱中，當(dāng)H9c2大鼠心肌細(xì)胞長到80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，接種于24或96孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別加入不同濃度TPNS單藥、TFE單藥、TPNS聯(lián)合TFE培養(yǎng)H9c2大鼠心肌細(xì)胞4 h，再加入D-gal（50 mol·L^-1）培養(yǎng)24 h。正常對照組細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)24 h后每隔12 h換液1次，D-半乳糖組細(xì)胞在相同環(huán)境下直接加入50 mol·L^-1 D-gal刺激24 h。

2.2 MTT法檢測H9c2大鼠心肌細(xì)胞活率 H9c2大鼠心肌細(xì)胞懸液以5×103 個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，設(shè)置10個組：①正常對照組；②D-半乳糖組（50 mol·L^-1）；③TPNS單藥組（5 mg·L^-1）；④TPNS單藥組（25 mg·L^-1）；⑤TFE單藥組（5 mg·L^-1）；⑥TFE單藥組（25 mg·L^-1）；⑦TPNS（5 mg·L^-1）聯(lián)合TFE（5 mg·L^-1）組；⑧TPNS（5 mg·L^-1）聯(lián)合TFE（25 mg·L^-1）組；⑨TPNS（25 mg·L^-1）聯(lián)合TFE（5 mg·L^-1）組；⑩TPNS（25 mg·L^-1）聯(lián)合TFE（25 mg·L^-1）組。每個組設(shè)置6個復(fù)孔。藥物作用24 h后棄去上清液，每孔加入終濃度為0.5 mg·L^-1 MTT的培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)4 h后，離心棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min至結(jié)晶完全溶解，立即放置在波長于490 nm的酶標(biāo)儀中檢測其吸光度A，確定協(xié)同效果最佳的方案。

2.3 β-半乳糖苷酶染色檢測H9c2大鼠心肌細(xì)胞衰老程度 H9c2大鼠心肌細(xì)胞懸液以1×105個/mL接種于24孔板中，每孔1 mL，根據(jù)MTT法確定的最佳聯(lián)合方案，設(shè)置5個組：①正常對照組；②D-半乳糖組（50 mol·L^-1）；③TPNS單藥組（5 mg·L^-1）；④TFE單藥組（5 mg·L^-1）；⑤TPNS（5 mg·L^-1）聯(lián)合TFE（5 mg·L^-1）組，每孔設(shè)置6個復(fù)孔，作用24 h后，棄去上清液，每孔加入500 μL的清理液清理細(xì)胞表面，棄去清理液，每孔中加入500 μL的固定液，室溫孵育5 min后，棄去固定液，每孔加入500 μL的酸性液清洗細(xì)胞表面，棄去酸性液，每孔加入400 μL提前預(yù)熱的染色工作液， 37 ℃恒溫箱孵育16 h，在100倍光學(xué)顯微鏡（視野50 μm）下觀察細(xì)胞染成藍(lán)色的情況。

2.4 DCFH-DA探針法檢測H9c2大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度 H9c2大鼠心肌細(xì)胞懸液以1×105 個/mL接種于24孔板中，每孔1 mL，分組同2.3項下，每孔設(shè)置6個復(fù)孔，作用24 h后，棄去上清液，加入1 mL，10 μmol·L^-1的DCFA-DA溶液，將其放入37 ℃恒溫箱中孵育1 h，用不含F(xiàn)BS的DMEM小心地將細(xì)胞清洗3遍，倒置熒光顯微鏡（100倍，視野50 μm）下觀察熒光強(qiáng)度。

2.5 JC-1檢測H9c2大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位水平 H9c2大鼠心肌細(xì)胞懸液以1×105 個/mL接種于24孔板中，每孔1 mL，分組同2.3項下，每孔設(shè)置6個復(fù)孔，作用24 h后，棄去上清液，加入JC-1染色工作液，在37 ℃恒溫相中孵育20 min后終止孵育，棄去工作液，用JC-1染色緩沖液清洗2遍后，棄去緩沖液，第3遍加入JC-1染色緩沖液，在倒置熒光顯微鏡（100倍，視野50 μm）下觀察熒光強(qiáng)度。

2.6 蛋白免疫印跡檢測SRIT1，PGC-1，SRIT3蛋白表達(dá)情況 H9c2大鼠心肌細(xì)胞懸液以5×105 個/mL接種于6孔板中，每孔2 mL，分組同2.3項下，每孔設(shè)置6個復(fù)孔，作用24 h后，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞并提取總蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量法檢測各蛋白濃度，采用95 ℃滅活10 min，依次進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 蛋白免疫印跡圖像采用Image J軟件分析，數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件分析，以±s表示，各組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

判斷藥物聯(lián)合作用的性質(zhì)采用金正均法計算Q值。Q=Ea+b/（E_a+Eb-E_a×Eb）進(jìn)行計算，其中Ea+b為 A，B 2藥合用時對細(xì)胞的效率，E_a為A藥對細(xì)胞的效率，Eb為B藥對細(xì)胞的效率；Q值<0.55為明顯拮抗，0.55～ 0.85為拮抗，0.85～1.15為單純相加，1.15～2.0為增強(qiáng)，>2.0為明顯增強(qiáng)。

3 結(jié)果

3.1 TPNS聯(lián)合TFE對衰老H9c2大鼠心肌細(xì)胞活率的影響 與正常對照組比較，D-gal組細(xì)胞的活率顯著下降（P<0.05）；與D-gal組比較，隨著TPNS和TFE濃度的增加，細(xì)胞活率逐漸增加（P<0.05），而TPNS聯(lián)合TFE對細(xì)胞活率的增加更為明顯（P<0.05），與TPNS單藥、TFE單藥組比較，各聯(lián)合用藥組中細(xì)胞活率顯著增加（P<0.05），且各聯(lián)合用藥具有相加或者協(xié)同作用，其中TPNS 5 mg·L^-1聯(lián)合TFE 5 mg·L^-1協(xié)同效果最好（Q=1.154），因此選擇TPNS 5 mg·L^-1聯(lián)合 TFE 5 mg·L^-1組為最佳聯(lián)合方案，見表1。

3.2 TPNS聯(lián)合TFE對衰老H9c2大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶活性的影響 與正常對照組比較，D-gal組中大量的H9c2大鼠心肌細(xì)胞被染成藍(lán)色，與D-gal組比較，5 mg·L^-1 TPNS單劑量組、5 mg·L^-1TFE單劑量組中被染成藍(lán)色的H9c2大鼠心肌細(xì)胞數(shù)量減少，與D-gal 組、5 mg·L^-1TPNS單劑量組及5 mg·L^-1TFE單劑量相比，5 mg·L^-1TPNS聯(lián)合5 mg·L^-1TFE組中被染成藍(lán)色的H9c2大鼠心肌細(xì)胞數(shù)量顯著減少，見圖1。

3.3 TPNS聯(lián)合TFE對衰老H9c2大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的影響 與正常對照組比較，D-gal組中ROS的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，與D-gal組比較，5 mg·L^-1TPNS單劑量組及5 mg·L^-1TFE單劑量組中ROS的熒光強(qiáng)度均降低，與D-gal 組、5 mg·L^-1TPNS單劑量組及5 mg·L^-1TFE單劑量比較，5 mg·L^-1TPNS聯(lián)合5 mg·L^-1TFE組中ROS的熒光強(qiáng)度顯著降低。見圖2。

3.4 TPNS聯(lián)合TFE對衰老H9c2大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的影響 與正常對照組比較，D-gal組中綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，而紅色熒光微弱；與D-gal組比較，5 mg·L^-1TPNS單劑量組以及5 mg·L^-1TFE單劑量組中紅色熒光增強(qiáng)而綠色熒光減弱，與D-gal組、5 mg·L^-1TPNS單劑量組以及5 mg·L^-1TFE單劑量比較，紅色熒光顯著增強(qiáng)，綠色熒光顯著減弱。見圖3。

3.5 TPNS聯(lián)合TFE對衰老H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)SIRT1，PGC-1α，SIRT3蛋白表達(dá)量的影響 與正常對照組比較，D-gal組中，SIRT1，PGC-1α以及SIRT3蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.05）；與D-gal組比較，5 mg·L^-1TPNS單劑量組以及5 mg·L^-1TFE單劑量組中SIRT1，PGC-1α以及SIRT3蛋白表達(dá)量增加（P<0.05）；與D-半乳糖組，5 mg·L^-1TPNS單劑量組以及5 mg·L^-1TFE單劑量組相比，5 mg·L^-1TPNS聯(lián)合5 mg·L^-1TFE組中SIRT1，PGC-1α，SIRT3蛋白表達(dá)量顯著增加（P<0.05）。見圖4。

4 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為，衰老是由腎虛血瘀導(dǎo)致^[6]?！峨y經(jīng)》云：“腎者，原氣之所系”?！夺t(yī)林改錯》云：“元?dú)饧忍摚夭荒苓_(dá)于血管，血管無氣必停留而為瘀。血府，血之根本，瘀則殞命”。提示腎虛必然導(dǎo)致血瘀，血瘀是促使衰老的重要因素之一。因此將補(bǔ)腎與活血有機(jī)結(jié)合起來組成補(bǔ)腎活血方改善腎虛血瘀的狀態(tài)進(jìn)而延緩衰老。

心臟衰老是導(dǎo)致心功能衰退和各種心血管疾病的主要因素，中醫(yī)理論認(rèn)為，腎中精氣虛衰必然導(dǎo)致心臟功能衰退^[7]。因此腎虛血瘀是導(dǎo)致心臟衰老的主要原因之一，補(bǔ)腎活血方是防治心臟衰老的基本治則。現(xiàn)代研究顯示，補(bǔ)腎中藥通過調(diào)節(jié)線粒體結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)而延緩心臟衰老^[8]。

淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物，《本草綱目》云：“淫羊藿，益精氣，堅筋骨，補(bǔ)腰膝，強(qiáng)心力”。TFE是淫羊藿的主要成分?，F(xiàn)代研究表明：TFE具有補(bǔ)腎壯陽、延緩衰老的藥理作用^[9]。三七為五加科多年生草本植物，《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》云：“三七，善化瘀血，為吐衄要藥”。提示三七具有活血化瘀之功效。TPNS是三七主要成分，與三七生藥相比，藥效突出。胡志潔研究結(jié)果顯示TPNS具有抑制動脈硬化，防治心肌缺血，降血脂的功能^[10]。因此TPNS與TFE相結(jié)合組成補(bǔ)腎活血方延緩衰老。本實驗結(jié)果顯示，與D-gal 組、TPNS單劑量組以及TFE單劑量比較，5 mg·L^-1TPNS聯(lián)合5 mg·L^-1TFE細(xì)胞活率顯著且協(xié)同作用最佳。

線粒體是真核細(xì)胞生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場所，線粒體亦是產(chǎn)生活性氧（ROS）的主要場所。大部分研究者認(rèn)可 “自由基與線粒體衰老理論”。線粒體在病理條件下，電子傳遞出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致線粒體內(nèi)ROS增加，進(jìn)一步損傷線粒體膜以及mtDNA等，形成惡性循環(huán)，從而導(dǎo)致線粒體衰老^[11]。心臟是耗能最多的器官之一，因此心臟中含有大量的線粒體。新近研究表明：線粒體結(jié)構(gòu)與功能損傷及ROS增加是導(dǎo)致心臟衰老的重要原因之一^[12]。Escobales N等^[13]研究表明線粒體靶向活性氧清除劑：XJB-5-131有效降低衰老大鼠心臟線粒體中ROS含量，同時提高線粒體膜電位水平進(jìn)而改善由于衰老引起的心血管疾病。Baris O R等 [14]研究顯示老齡大鼠心肌線粒體內(nèi)膜通透性增加、線粒體腫脹、呼吸鏈功能減退及氧化磷酸化脫偶聯(lián)。前期研究表明TPNS顯著降低衰老H9c2大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度^[3]，顯著增加線粒體膜電位水平^[15]。TFE通過抗氧化應(yīng)激改善D-gal致H9c2大鼠心肌細(xì)胞衰老^[5]。本實驗結(jié)果表明TPNS聯(lián)合TFE能有效清除衰老H9c2大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)過多的ROS，顯著升高線粒體膜電位水平。提示，TPNS聯(lián)合TFE延緩H9c2大鼠心肌細(xì)胞衰老，可能與其減輕氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)線粒體結(jié)構(gòu)與功能有關(guān)。

研究表明SIRT1/PGC-1α通路與線粒體功能有密切的關(guān)系^[17-18]。SIRT1去乙酰化線粒體內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子如PGC-1α，p53等，促進(jìn)線粒體發(fā)生^[19]。PGC-1α是線粒體發(fā)生的主要調(diào)節(jié)因子，其能調(diào)控心肌氧化程度^[20]。白藜蘆醇（SIRT1激動劑）可通過誘導(dǎo)細(xì)胞激活SIRT1/PGC-1α信號通路，以促進(jìn)線粒體生物合成進(jìn)而延緩細(xì)胞衰老^[21]。衰老小鼠高表達(dá)SIRT1時，提高PGC-1α表達(dá)，能有效防治心肌肥厚，抑制心肌細(xì)胞凋亡^[22]。前期研究結(jié)果顯示TPNS^[9]、TFE可能通過調(diào)節(jié)線粒體SIRT1/PGC-1α途徑改善線粒體功能。本實驗研究結(jié)果表明TPNS聯(lián)合TFE可顯著升高SIRT1/PGC-1α蛋白表達(dá)水平。

研究表明SIRT3與線粒體結(jié)構(gòu)與功能有著密切的聯(lián)系^[23]。小分子SIRT3僅存在于心肌細(xì)胞的線粒體中，SIRT3對能量生成、代謝、細(xì)胞凋亡及線粒體自由基產(chǎn)生起到很重要作用^[24]。Chen Y等^[25]研究發(fā)現(xiàn)SIRT3可以通過上調(diào)線粒體內(nèi)Mn-SOD的表達(dá)，進(jìn)而提高線粒體清除ROS能力。Sundaresan N R等^[26]研究發(fā)現(xiàn)SIRT3表達(dá)缺陷小鼠在第8周出現(xiàn)心肌肥大、纖維化等心臟衰老表現(xiàn)。本實驗研究表明TPNS聯(lián)合TFE能顯著提高SIRT3蛋白表達(dá)水平。提示，TPNS聯(lián)合TFE可能通過調(diào)節(jié)SIRT3信號通路進(jìn)而調(diào)節(jié)線粒體結(jié)構(gòu)與功能。

綜上所述，TPNS聯(lián)合TFE對D-gal致H9c2大鼠心肌細(xì)胞衰老具有保護(hù)作用，這種作用可能與調(diào)節(jié)SIRT1/PGC-1α，SIRT3信號通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)線粒體功能和減輕氧化應(yīng)激有關(guān)。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]