王 棟，李漢忠

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 泌尿外科, 北京 100730)

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研究論文

散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤易感基因的熱點(diǎn)區(qū)域的篩選

王 棟，李漢忠*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 泌尿外科, 北京 100730)

目的篩選與散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤易感基因相關(guān)的染色體區(qū)域。 方法收集北京協(xié)和醫(yī)院2011年9月至2013年5月臨床診斷的42例散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤病例。提取嗜鉻細(xì)胞瘤及外周血的基因組DNA，用Sanger測序法檢測遺傳型嗜鉻細(xì)胞瘤的突變基因；在證實(shí)為散發(fā)型的部分病例中，用單核苷酸多態(tài)性芯片(SNP 6.0 芯片)對其腫瘤組織及外周血的基因組進(jìn)行掃描分析，精確定位可能的熱點(diǎn)區(qū)域；然后以Q-PCR技術(shù)在其余的病例中進(jìn)一步驗(yàn)證，從而最終確定散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤相關(guān)的染色體片段。結(jié)果38例散發(fā)型病例，4例遺傳型病例。通過SNP 6.0芯片掃描發(fā)現(xiàn)染色體片段的缺失較擴(kuò)增更為常見，缺失的染色體包括 1p、3q、17p、22q和11p。1p上的chr1:74 957 006～86 132 879, chr1:58 096 424～67 700 471和chr1:98 902 091～107 622 4303個(gè)片段的缺失最為常見；Q-PCR驗(yàn)證后，上述3個(gè)片段仍為最常見的缺失區(qū)域。4例Ret突變者均出現(xiàn)上述3個(gè)片段的缺失。結(jié)論1號染色體短臂的部分區(qū)域上可能存散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤相關(guān)的抑癌基因。

散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤；單核苷酸多態(tài)性芯片；基因

嗜鉻細(xì)胞瘤(pheochromocytoma, PCC)因分泌過量兒茶酚胺，可導(dǎo)致嚴(yán)重的心腦血管并發(fā)癥，同時(shí)對于惡性PCC的診斷和治療也缺乏理想的方法[1]。因而，明確PCC的發(fā)病機(jī)制，找到相關(guān)的突變基因以協(xié)助診斷及治療就顯得尤為迫切。目前發(fā)現(xiàn)NF1、RET、SDHx、TEME127以及MAX是遺傳型PCC的易感基因[2]。但對于占多數(shù)比例的散發(fā)型PCC，雖有部分病例與上述基因相關(guān)，但仍有80%左右的病例其發(fā)病機(jī)制仍不明確[3]?；蛐酒?gene chip)可在短時(shí)間內(nèi)對全基因組進(jìn)行掃描，具有快速、精確和低成本的分析檢驗(yàn)?zāi)芰Γ渲凶钚碌膯魏塑账岫鄳B(tài)性(sing1e nucleotidepolymorphism，SNP)芯片分辨率高，且能夠同時(shí)檢測DNA片斷的擴(kuò)增和缺失(copy-number variation, CNV)與等位基因的雜合性缺失(loss of heterozygosis, LOH)，在相關(guān)基因篩選中的應(yīng)用越來越廣泛[4]。

1 材料與方法

1.1 病例和腫瘤標(biāo)本

2011年9月至2013年5月共納入臨床診斷的散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤42例，所有病例均無遺傳性內(nèi)分泌腫瘤綜合征的家族史，且均未發(fā)現(xiàn)NF1、VHL綜合征、多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤病2型(MEN 2)及家族性嗜鉻細(xì)胞瘤/副節(jié)瘤綜合征伴隨的其他腫瘤的證據(jù)。其中女性18人，男性24人，中位年齡43歲(17～61歲)，單側(cè)腫瘤39例，雙側(cè)腫瘤3例，腎上腺外9例，腎上腺區(qū)33例(表1)。

組織來源于手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本和外周血。腫瘤標(biāo)本離體后立即切割成直徑1～2 mm的組織塊，經(jīng)液氮速凍后放入-80 ℃冰箱中保存。手術(shù)當(dāng)日術(shù)前取頭靜脈血2.5 mL，放入肝素抗凝管內(nèi)，置-80 ℃冰箱，作為腫瘤組織的正常配對。

表1 臨床資料

A.adrenal; EA.extra-adrenal; NE.norepinephrine; E.epinephrine; D.dopamine; B/M.benign/malignant; Bi/Mono.bilateral/monolateral.

1.2 基因組DNA的提取和質(zhì)量控制

應(yīng)用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取全血基因組DNA，應(yīng)用QIAamp DNA Mini Kit提取腫瘤組織基因組DNA，均按生產(chǎn)商的說明進(jìn)行操作。應(yīng)用于芯片實(shí)驗(yàn)的基因組DNA樣本必須符合以下質(zhì)控條件：用Nanodrop分光光度計(jì)檢測吸光度，A260/A280應(yīng)接近1.8，濃度大于500 μg/μL。用1%瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)1條明亮單1條帶，無明顯拖尾。

1.3 Sanger測序

PCR擴(kuò)增血液及腫瘤組織基因組DNA中各個(gè)PCC相關(guān)基因(RET，VHL，SDHB，SDHC和SDHD)的外顯子片段，應(yīng)用Sanger測序檢測是否存在這些基因的突變。MEM127和MAX突變在PCC患者中的比例低于1%，因而未檢測這兩種基因，而NF1因可通過特異臨床的表現(xiàn)而排除，故也未檢測NF1的突變。

1.4 SNP芯片檢測及熱點(diǎn)區(qū)域的初步定位

在證實(shí)為散發(fā)型的病例中，應(yīng)用SNP6.0芯片(Affymetrix公司提供)掃描隨機(jī)抽取的14例患者的基因組DNA(包括腫瘤組織和外周血的白細(xì)胞)。實(shí)驗(yàn)過程按照Affymetrix? Genome-Wide Human SNP Nsp/Sty 6.0 User Guide芯片實(shí)驗(yàn)操作手冊進(jìn)行。

前述程序結(jié)束后，以3000 7G掃描儀掃描芯片，將原始數(shù)據(jù)文件輸入到Partek Genomics Suite 軟件，腫瘤樣本的拷貝數(shù)以配對的外周血為基線進(jìn)行分析，拷貝數(shù)大于2.3和小于1.6分別作為擴(kuò)增和缺失的標(biāo)準(zhǔn)，其中技術(shù)參數(shù)嚴(yán)格限制：基因組marker數(shù)>10；P<0.001；信噪比>0.3。選取CNV頻率最高的染色體片段作為相關(guān)的熱點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.5 Q-PCR驗(yàn)證染色體易感區(qū)域

通過Q-PCR在其余的散發(fā)型病例中驗(yàn)證SNP6.0芯片所初步確定的熱點(diǎn)區(qū)域。首先根據(jù)NCBI Genebank及相關(guān)文獻(xiàn)，確定熱點(diǎn)區(qū)域所對應(yīng)的DNA序列，進(jìn)而設(shè)計(jì)出引物。然后配制Q-PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)。Q-PCR反應(yīng)在StepOne Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行(表2，表3)。以全部血液基因組DNA的混合物為拷貝數(shù)正常對照樣本。以C2基因片段作為標(biāo)化序列，應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算相對拷貝數(shù)。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。相對拷貝數(shù)小于1.4認(rèn)定為發(fā)生缺失。為使Q-PCR產(chǎn)物能代表所檢測的DNA片段，為每個(gè)片段分別設(shè)計(jì)3組引物。同一樣本3組引物的結(jié)果一致可認(rèn)定為發(fā)生缺失。

表2 配制的Q-PCR反應(yīng)體系

表3 Q-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

使用StepOneTM軟件(熒光定量操作及數(shù)據(jù)分析軟件)對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。將超過全部散發(fā)型病例數(shù)50%的區(qū)域確定為散發(fā)型PCC相關(guān)的染色體區(qū)域。臨床數(shù)據(jù)與CNV片段之間的關(guān)聯(lián)通過χ2檢驗(yàn)來驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA提取結(jié)果

腫瘤及外周血白細(xì)胞DNA的凝膠電泳顯示DNA條帶清晰單一，吸光度A260/280比值均在1.7～1.9之間，證實(shí)提取的基因組DNA為高純度、無降解(圖1)。

2.2 Sanger測序的結(jié)果

42例病例中，4例外周血的突變檢測為陽性，其中1例為VHL突變，3例為RET突變(圖2)。其余38例外周血突變檢測的結(jié)果均為陰性，證實(shí)為散發(fā)型PCC，其中1例(41號)腫瘤組織的RET基因顯示為陽性。

圖1 部分病例中腫瘤組織與外周血的基因組DNA凝膠電泳結(jié)果

A,B,C. Sequencing consequences of DNA products from blood tissues indicated a heterozygous G/A mutation at codon 634, which was consistent with the results of DNA from tumor tissues sequencing; D. Sequencing consequences of DNA products from tumor tissues indicated a heterozygous C/A mutation at codon 618, which was not conformed in the results of DNA from blood tissues sequencing

圖2 Sanger測序的結(jié)果(ret基因)

Fig 2 The result of Sanger sequence mutation in ret gene

2.3 染色體熱點(diǎn)區(qū)域的初步確定

經(jīng)SNP6.0芯片掃描，在14例散發(fā)型PCC中均發(fā)現(xiàn)了CNV。其中，缺失的染色體包括1p(12/14)、3q(8/14)、17p(4/14)、22q(4/14)和11p(4/14)，擴(kuò)增的包括22q(2/14)、17q(3/14)和9q(2/14)(表4，圖3)。CNV頻率最高的染色體為1p，其上的3段DNA片段chr1:74 957 006～86 132 879, chr1:58 096 424～67 700 471和chr1:98 902 091～107 622 430的缺失頻率均超過50%(表4，圖4)。另外4例遺傳型病例的SNP芯片掃描結(jié)果顯示， RET基因突變的3例均發(fā)生了1p中片段的缺失(表4)。

2.4 Q-PCR 結(jié)果

根據(jù)NCBI Genbank 及相關(guān)文獻(xiàn)，為上述3各片段對應(yīng)的DNA序列分別設(shè)計(jì)3組引物(表5)。熔解曲線顯示Q-PCR產(chǎn)物均為單一擴(kuò)增(圖5)。經(jīng)Q-PCR驗(yàn)證，chr1:74 957 006～86 132 879, chr1:58 096 424～67 700 471及 chr1:98 902 091～107 622 430這3個(gè)片段發(fā)生的頻率分別為28/38、27/38及23/38，均超過50%(表4)。

3 討論

目前通過比較基因組雜交技術(shù)(comparative genomic hybridization，CGH)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)散發(fā)型PCC中CNV很常見，拷貝數(shù)缺失是CNV最常見的表現(xiàn)形式[5]?？截悢?shù)缺失常導(dǎo)致等位基因雜合性的缺失(LOH)，而LOH的區(qū)域往往是抑癌基因所在的位置[6]。這些研究結(jié)果高度提示在缺失的染色體片段中可能存在著散發(fā)型PCC的抑癌基因。但CGH只能得出CNV的位置，而無法確定是否存在LOH，因而無法確定相關(guān)基因的位置。而SNP芯片可以在確定CNV區(qū)域的同時(shí)驗(yàn)證是否存在LOH[4]。本研究通過SNP6.0芯片共掃描的14例散發(fā)型PCC均發(fā)生了CNV。其中擴(kuò)增的7例，而全部14例均出現(xiàn)了缺失，這表明拷貝數(shù)缺失是散發(fā)型PCC發(fā)病過程的重要事件，也提示抑癌基因的失活可能在散發(fā)型PCC的發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用[7]。另外本研究發(fā)現(xiàn)缺失的染色體包括1p，3q，11p，13q，17p和22q，這與既往的研究結(jié)果類似[7- 8]。

表4 SNP芯片及Q-PCR結(jié)果

grey area.result of SNP chip；*inherited cases；×.finding the deletion；-.no foundong the deletion；blank.no data.

表5 以3段熱點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)的Q-PCR引物

region1.chr1.74 957 006-86 132 879；region2.chr1:58 096 424-67 700 471；region3.chr1:98 902 091-107 622 430.

Green lines on left side indicate loss of DNA copies situated in that area; Red lines on right side indicate gains of DNA copies situated in that area

圖3 散發(fā)型PCC中CNV的頻率

Fig 3 The frequency of CNV in sporadic PCC

Blue regions indicate deletion area圖4 SNP6.0芯片顯示的14例散發(fā)型PCC中1p上CNV的頻率Fig 4 The frequency of CNV of 1p in sporadic PCC

The single peak indicates single product圖5 Q-PCR產(chǎn)物的熔解曲線Fig 5 Melt curve of Q-PCR

目前認(rèn)為1p是散發(fā)型PCC最常見的缺失片段[5]，1p的缺失與多種腫瘤相關(guān),如少突膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[9- 10]。本研究中最常見的缺失片段也是1p(12/14)，并且發(fā)現(xiàn)了其上3段最常見的缺失區(qū)域，結(jié)合Q-PCR的驗(yàn)證結(jié)果，提示這3段區(qū)域存在散發(fā)型PCC的相關(guān)基因。

另有研究發(fā)現(xiàn)RET基因突變的遺傳型PCC中，1p的缺失比率高達(dá)80%～100%，而MEN2中PCC的外顯率卻僅有5%[11]，這提示除RET基因突變外，尚需其他DNA的異常事件才能最終導(dǎo)致PCC。本研究中4例RET突變的病例(3例遺傳型，1例散發(fā)型)均發(fā)生了1p片段的缺失，這提示RET突變的散發(fā)型和遺傳型PCC具有類似的發(fā)病機(jī)制，除了已知的RET基因突變外，還可能與1p部分區(qū)域的缺失相關(guān)。

本研究為初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過深入研究散發(fā)型與遺傳型PCC以及良惡性PCC之間有表達(dá)差異的基因, 可以進(jìn)一步探索PCC的分子病因?qū)W基礎(chǔ),從而為PCC的早期診斷、良惡性鑒別以及治療提供新的途徑。

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Screen of the tumor-related regions of sporadic pheochromacytoma

WANG Dong, LI Han-zhong*

(Dept. of Urology, PUMC Hospital, CAMS & PUMC, Beijing 100730, China)

Objective To identify candidate regions of sporadic pheochromacytoma(PCC). Methods Totally 42 patients who were clinically diagnosed as sporadic PCC from 2011-9 to 2013-5 in PUMCH were enrolled. To extract whole genome DNA from their tumors as well as peripheral blood leukocytes and to exclude inherited cases by Sanger sequence mutation. Within 14 verified cases of sporadic PCC, we applyed single nucleotide polymorphism (SNP) chip to detect whole genome DNA copy number variations (CNV) and loss of heterozygosity (LOH) to initially locate the hot regions. Finally apply Q-PCR to confirm the hot regions in left cases. Results 38 cases were identified as sporadic PCC, and 4 as inherited cases. CNV were found in 14/14 tumors, of which deletions were more common. Missing regions occurred in 1p,3q,17p,22q,11p. On the other hand, of the 3 inherited cases, deletion was also detected. The loss of parts of arm 1p is the most common, including chr1:74 957 006～86 132 879, chr1:58 096 424～67 700 471, and chr1:98 902 091～107 622 430. The result of Q-PCR confirmed the above-mentioned three regions, and the three segments are final candidate regions. Conclusions Partially deletion of 1p in most cases is the most striking phenomenon, we believe that the deletion of 1p may occur with PCC development, and there may be some tumor suppressor gene(s) within these areas.

sporadic pheochromacytomas; single nucleotide polymorphism chip; genes

2014- 07- 03

2014- 10- 08

1001-6325(2015)01-079-07

R699.3

A

*通信作者(corresponding author)：jellowaaa7@163.com