劉麗莎，朱純亮，韓 勍，殷絲雨，談 誠，韓晶晶，陳紅兵

(南京醫(yī)科大學(xué) 附屬南京兒童醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 江蘇 南京 210008)

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川崎病急性期患兒血清活化HUVECs NF-κB并促進(jìn)MMP- 9分泌

劉麗莎，朱純亮，韓 勍，殷絲雨，談 誠，韓晶晶，陳紅兵*

(南京醫(yī)科大學(xué) 附屬南京兒童醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 江蘇 南京 210008)

川崎病(Kawasaki disease，KD)，又稱皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征(mucocutaneous lymph node syndrome, MCLS)，是一種好發(fā)于5歲以下兒童和嬰幼兒的急性全身性血管炎性疾病。 病變可累及動脈、靜脈和毛細(xì)血管，尤以冠狀動脈為明顯，成為小兒后天性心臟病的主要病因[1]。目前，KD病因與發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚, 本實(shí)驗(yàn)觀察川崎病患兒急性期血清對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)NF-κB P65表達(dá)及MMP- 9分泌的影響，及NF-κB抑制劑四氫化吡咯二硫代氨基甲酸脂(PDTC)對上述過程的影響。

1 材料與方法

1.1 材料：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)系；RPMI1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶；胎牛血清；MMP- 9試劑盒。

1.2 血清制備：40例在本院明確診斷為典型川崎病急性期(發(fā)熱10 d 內(nèi)，IVIG使用前)患兒(年齡2～5歲)、23例急性上呼吸道感染的患兒及20例同年齡段健康兒童，各組年齡無差異，采集各組兒童靜脈血3 mL，分離血清，-80 ℃ 凍存。標(biāo)本的收集均獲得患兒家屬知情同意和醫(yī)學(xué)倫理委員會的同意。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)：1)正常血清組(control)1.0×106個HUVECs細(xì)胞于含10%正常血清的RPMI1640 完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，棄上清液，加入無血清培養(yǎng)液；2)發(fā)熱血清組(F)：用含10%急性發(fā)熱患兒血清培養(yǎng)液，余同control組；3)急性期血清組(KD)：用含10%急性期血清培養(yǎng)液，余同control組；4)PDTC+急性期血清組(PDTC)：用含10%急性期血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，棄上清液，加入含PDTC(20 μmol/L)的無血清培養(yǎng)液。

1.5 MMP- 9活性測定：ELISA 法檢測細(xì)胞上清液中MMP- 9水平，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB P65蛋白表達(dá)水平：與對照組相比，KD組NF-κB P65蛋白表達(dá)水平明顯增高，PDTC可抑制NF-κB P65蛋白表達(dá)(圖1)。

圖1 各組HUVECs NF-κB P65蛋白表達(dá)Fig 1 The NF-κB P65 protein expression in HUVECs of various groups

2.2 MMP- 9蛋白水平：KD組血清可使MMP- 9蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01)；PDTC可降低其表達(dá)(P<0.01)，與NF-κB P65蛋白表達(dá)水平相一致。

表1 各組NF-κB P65和MMP- 9 蛋白表達(dá)水平

groupnNF?κBP65MMP?9(ng/L)control20 015±004 30±13F23 023±005 120±20KD40 076±006?657±87?PDTC+KD40 027±007#234±56#

*P<0.01 compared with control and F groups;#P<0.01comparedwithKDgroups.

3 討論

NF-κB是由Rel家族蛋白構(gòu)成的二聚體蛋白質(zhì)，能與多種基因的啟動子和增強(qiáng)子特異性結(jié)合，在機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)及細(xì)胞生長調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用，促炎性細(xì)胞因子、T細(xì)胞和B細(xì)胞激活抗原、紫外線照射、電離輻射、病毒感染和各種集落刺激因子等均能激活NF-κB信號通路[2]。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs) 是一組參與細(xì)胞外基質(zhì)降解過程的鈣、鋅離子依賴性內(nèi)源蛋白水解酶家族。MMP- 9主要由上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，是一種促炎蛋白酶，其啟動子區(qū)含有AP-1 和NF-κB位點(diǎn)，可對多種促炎刺激發(fā)生反應(yīng)[3]。

本研究發(fā)現(xiàn)用KD急性期患兒血清處理HUVECs，可上調(diào)NF-κBP65的表達(dá)，并使其分泌MMP- 9增加，用NF-κB抑制劑PDTC可降低二者表達(dá)，表明NF-κB可能作為始發(fā)炎性反應(yīng)的上游環(huán)節(jié)在川崎病血管免疫炎性損傷中起重要作用，這為進(jìn)一步揭示KD急性期病理損傷機(jī)制以及KD的治療靶點(diǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。此外，MMP- 9啟動子區(qū)域含有NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，二者在KD急性期特別是合并冠脈損傷時具體的作用機(jī)制將在后續(xù)研究中探討。

[1]KowalczykM,Turska-Kmie?A,ZiókowskaL,etal.Symptoms,diagnosis and characteristic abnormalities in the coronary arteries in Kawasaki disease in children[J]. Med Wieku Rozwoj, 2010,14: 344- 349.

[2] DiDonato JA, Mercurio F, Karin M. NF-κB and the link between inflammation and cancer[J]. Immunol Rev,2012,246:379- 400.

[3] Sakata K, Hamaoka K, Ozawa S,etal. Matrix metalloproteinase- 9 in vascular lesions and endothelial regulation in Kawasaki disease[J]. Circ J, 2010, 74: 1670- 1675.

新聞點(diǎn)擊

睡前一杯熱可可有助您遠(yuǎn)離糖尿病

據(jù)英國《BBC新聞》(BBC NEWS)2013-06-28報(bào)道，還在擔(dān)心熱可可帶來的負(fù)面影響嗎？一項(xiàng)新的研究顛覆過去熱可可會導(dǎo)致肥胖的傳統(tǒng)思維，認(rèn)為睡前一杯熱可可有助于預(yù)防糖尿病。

在研究的10周期間里，受試?yán)鲜髷z取大約人類1/10湯匙的可可粉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅攝取少量可可粉，就可以減少發(fā)炎以及脂肪肝病(fatty liver disease)。

在幾個與二型糖尿病(type 2 diabetes)表現(xiàn)的數(shù)據(jù)上，服用可可的老鼠組別都明顯低于他組，舉例來說：這些服用過可可的老鼠比起僅吃高熱量食物的老鼠，血漿中的胰島素濃度低于27%(該比例是糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo))。此外，可可也幫助降低了體內(nèi)三酰甘油(triglycerides)濃度，減少產(chǎn)生脂肪肝危機(jī)。

可可被拿來作用藥材使用的時間已超過2 000年?，斞排c阿茲提克文明(The Mayans and Aztecs)確信其有減輕病痛(如發(fā)燒、心痛以及腸道不適)之功效。

可可中的類黃酮(flavonoid)是協(xié)助對抗心血管疾病的關(guān)鍵。它能改善發(fā)炎，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的修復(fù)功能；還能強(qiáng)化舒張血管，提高腦中血清素濃度，進(jìn)而穩(wěn)定情緒、控制食欲。

研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為這項(xiàng)結(jié)論可類推至人身上，并希望未來的研究能夠持續(xù)確認(rèn)可可對治療炎性反應(yīng)有效的原因及在人類身上是否也能有相同的功效。

此研究結(jié)果發(fā)表于《歐洲營養(yǎng)學(xué)雜志》(European Journal of Nutrition)中。

2014- 03- 07

2014- 05- 27

南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展基金(YKK13131)

1001-6325(2015)01-0099-02

R392.7；R34

A

*通信作者(corresponding author)：etyy001@sina.com