陳怡　陳爍　鄭娟紅等

[摘要] 目的 探討索拉非尼對體外培養(yǎng)人胃癌MGC80-3細(xì)胞增殖和凋亡的作用以及作用機(jī)制。 方法 采用二苯基四氮唑溴鹽比色法（MTT法）檢測不同濃度索拉非尼作用人胃癌MGC80-3 細(xì)胞的抑制作用；AnnexinV/PI 雙染法觀察藥物處理后細(xì)胞凋亡率變化。 結(jié)果 索拉非尼對人胃癌MGC80-3細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，且呈劑量和時間依賴性，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 索拉非尼能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并隨濃度增高凋亡率增加。

[關(guān)鍵詞] 胃癌細(xì)胞；索拉非尼；凋亡；增殖

[中圖分類號] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）21-0008-03

[Abstract] Objective To explore the inhibitory effective and mechanism on the proliferation and apoptosis of sorafenib in vitro gastric cancer MGC80-3 cells. Methods The inhibitory effective of sorafenib at different concentrations for gastric cancer cell MGC80-3 were analyzed by MTT assay. Apoptosis rate was observed by AnnexinV/PI staining. Results The proliferation inhibition of sorafenib on gastric cancer MGC80-3 cell was time-dose dependent manner， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The apoptosis of gastric cancer MGC80-3 cells is different and the apoptotic rate is increased with the increase of sorafenib concentration.

[Key words] Gastric cancer cell； Sorafenib； Apoptosis； Proliferation

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居所有癌癥的第二位[1]。胃癌的早期診斷難，大多數(shù)胃癌診斷時已處于進(jìn)展期，除了手術(shù)治療以及放療或者保守化療外，尚無有效的治療方法。目前，藥物治療作為主要手段用于治療晚期胃癌。隨著胃癌分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，針對腫瘤細(xì)胞生長、凋亡、細(xì)胞周期、浸潤以及血管生成等分子靶點(diǎn)提出的靶向治療成為胃癌綜合治療的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。研究顯示索拉非尼（sorafenib）是小分子多靶點(diǎn)、多激酶抗腫瘤藥，能同時抑制存在于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞表面的激酶，包括RAF激酶、血管內(nèi)皮生長因子-2（VEGFR-2）、血管內(nèi)皮生長因子-3（VEGFR-3），具有雙重抗腫瘤效應(yīng)[2]。本研究通過觀察索拉非尼在體外對胃癌細(xì)胞株生物學(xué)活性的作用，了解其可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步的臨床研究和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人胃癌MGC80-3細(xì)胞株購于武漢博士德生物工程有限公司，AnnexinV-FITC和PI檢測試劑盒購買于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，索拉非尼為德國拜耳公司生產(chǎn)，用10%二甲基亞砜（DMSO）溶解，于-20℃保存，實(shí)驗時稀釋。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 胃癌MGC80-3細(xì)胞培養(yǎng) 在10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗。

1.2.2 MTT檢測索拉非尼作用于MGC80-3細(xì)胞的抑制率 將細(xì)胞分別接種于96孔平底板，每孔接種5×105個細(xì)胞。實(shí)驗組分別加入不同濃度（S1：5 μmol/L、S2：10 μmol/L、S3：15 μmol/L、S4：20 μmol/L）的索拉非尼100 μL，并設(shè)不加藥物的對照組。加藥后分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，藥物終止作用后常規(guī)MTT法測生長抑制率，在自動酶標(biāo)儀490 nm波長處測定每孔的吸光度（A）值。細(xì)胞抑制率（%）=（1-用藥組平均A值）/陰性對照組平均A值×100%，實(shí)驗重復(fù)3次。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL接種于6孔板，每孔2 mL。加入含不同濃度（5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L）索拉非尼的RPMI 1640培養(yǎng)液作為實(shí)驗組，2 mL/孔，對照組僅加入等量培養(yǎng)液。將培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。按流式細(xì)胞檢測試劑盒說明書處理細(xì)胞，進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為有差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 索拉非尼不同用藥方式對MGC80-3細(xì)胞的抑制作用

索拉非尼對MGC80-3細(xì)胞有抑制作用，抑制作用隨著其濃度增高或作用時間延長而增強(qiáng)，呈劑量和時間依賴性（P<0.05）。見表1。

2.2 不同濃度索拉非尼對MGC80-3細(xì)胞凋亡率影響

索拉非尼作用48 h后在流式細(xì)胞儀得到的AnnexinV-FITC/PI雙染雙變量散點(diǎn)圖，索拉非尼作用MGC80-3細(xì)胞48 h出現(xiàn)凋亡呈濃度依賴性，在5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L的索拉非尼組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。對照組S0的細(xì)胞凋亡率為（4.10±1.48）%，實(shí)驗組S1、S2、S3、S4的細(xì)胞凋亡率分別為（7.71±2.35）%、（13.49±2.10）%、（17.53±2.61）%、（26.15±5.49）%，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05），即隨著藥物濃度的增高，索拉非尼對MGC80-3細(xì)胞的促凋亡作用增強(qiáng)。見圖1。

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居世界第四位[3]。目前晚期胃癌的主要治療手段是化療，有效的化療藥物包括紫杉醇、蒽環(huán)類、鉑類等，但是并未從根本上提高化療有效率，生存期比較短[4]，60%的胃癌患者VEGF有表達(dá)，高表達(dá)者預(yù)后較陰性者差，其發(fā)生與發(fā)展過程由多因素參與完成，與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及新生血管增生異常等相關(guān)[5]。索拉非尼通過抑制RAF激酶，阻斷Raf/MEK/ERK信號傳導(dǎo)通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖[6，7]，靶向作用于血管內(nèi)皮生長因子以及血小板源生長因子而抑制血管形成[8]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的失調(diào)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，血管形成，粘附以及侵襲和轉(zhuǎn)移，并能抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。目前有多項應(yīng)用索拉非尼治療癌癥的臨床試驗正在進(jìn)行，有臨床研究顯示，索拉非尼在肺癌等腫瘤治療中具有較好的治療效果[9，10]。在治療肝癌中通過其抑制信號通路延長生存率[11]。在慢性粒細(xì)胞白血病等研究中不僅能抑制細(xì)胞生長，而且有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用[12，13]。

凋亡是細(xì)胞生長和老化過程中的正?，F(xiàn)象。不合適的細(xì)胞凋亡是引起許多疾病的一個因素包括結(jié)腸癌。誘導(dǎo)凋亡通過多種機(jī)制介導(dǎo)，比如抗癌藥物順鉑能夠與核酸起作用，引起復(fù)制停止，抑制轉(zhuǎn)錄，DNA損壞和凋亡[14]。胃癌的轉(zhuǎn)移途徑包括淋巴道轉(zhuǎn)移[15]、腹膜轉(zhuǎn)移[16]、血行轉(zhuǎn)移[17]等。

本實(shí)驗分析了索拉非尼在不同的濃度及不同時間均對胃癌MGC80-3細(xì)胞有抑制作用，呈時間-劑量依賴性。即索拉非尼濃度越高、作用時間越長對細(xì)胞增殖的抑制率越高。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示在給藥濃度為20 μmol/L時，細(xì)胞凋亡率為26.15%左右，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。提示索拉非尼對MGC80-3細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)作用，且隨濃度的增加凋亡率上升。本研究表明索拉非尼在體外可以直接抑制MGC80-3細(xì)胞的生長并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與相關(guān)報道[18，19]基本相似。

總之，體外實(shí)驗研究表明索拉非尼具有抑制胃癌MGC80-3細(xì)胞增殖作用，呈劑量和時間依賴性，還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。下一步將深入開展體外和體內(nèi)研究，進(jìn)一步探討其可能的具體作用途徑和機(jī)制，來證實(shí)索拉非尼對胃癌的治療有效性，為開展臨床研究提供可能的理論支持。

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（收稿日期：2015-01-26）