于永樂，張傳美，張 倩，楊海燕，楊瑞梅，張洪亮，單 虎

（1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東 青島 266109；2.山東省黃島出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266555）

犬細小病毒（CPV）是引起幼犬出血性胃腸炎和心肌炎的主要病原體之一。CPV-2最早發(fā)現(xiàn)于1978年，1978-2000年間，CPV-2先后發(fā)生了3次重要的基因變異，產(chǎn)生了CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c 3種主要的抗原變異體[1]。到目前為止，新型變異株New CPV-2a、New CPV-2b、CPV-2c(a)和CPV-2c（b）已逐步取代了原始毒株在多個國家廣泛流行。在我國，1982年最早報道了此病的發(fā)生，此后的30多年伴隨著該病毒的不斷進化和變異。盡管目前為預(yù)防該病，疫苗接種工作已在國內(nèi)普及，但由于毒株不斷變異等原因，該病毒仍然廣泛流行，給我國養(yǎng)犬業(yè)帶來極大的損失。

CPV是單股、負鏈、線性DNA病毒，基因組全長5.2kb，包含兩個大開放閱讀框ORF1（編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2）和ORF2（編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2），其中VP2蛋白是主要的衣殼蛋白和病毒保護性抗原蛋白，同時具有自我裝配形成病毒樣顆粒（VLPS）的能力。此外，研究表明，VP2基因某些區(qū)域的點突變會對病毒抗原性的差異造成影響[2]。本研究對山東地區(qū)分離的12株不同的CPV進行VP2基因擴增，并與國內(nèi)外流行毒株進行序列比較及遺傳變異分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，確定毒株類型，以便及時了解CPV流行毒株的差異及變異情況，為加強CPV的防治工作和制備有效的疫苗提供理論支持和參考。

1 材料與方法

1.1 材料 12株不同的CPV（命名為SDCP1-12），由青島農(nóng)業(yè)大學山東省預(yù)防獸醫(yī)學重點實驗室分離鑒定并保存。質(zhì)粒小量提取試劑盒為美國Omega公司產(chǎn)品；DNAiso Regent、DNA-Marker DL-2000、Taq DNA聚合酶、pMD 18-T Vector，均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA膠回收試劑盒，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成與VP2基因的擴增 根據(jù)GenBank上發(fā)表的CPV基因序列（登錄號：KF803643），設(shè)計1對擴增VP2全基因的引物，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。擴增片段長度為1755 bp。上游：5′-ATGAGTGATGGAGCAGTTC-3′，下游：5′-TTAA TATAATTTTCTAGGTGC-3′，按照DNAiso Regent說明書提取病毒DNA，以提取12株CPV的DNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的回收、測序與序列分析 對PCR產(chǎn)物用試劑盒進行膠回收和純化，將目的片段與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑菌提取質(zhì)粒進行PCR鑒定，并將陽性質(zhì)粒進行序列測定。用DNAStar軟件將12株VP2基因的序列與CPV參考株序列以及國內(nèi)外流行毒株序列進行比較分析。用MEGA 5.0構(gòu)建核苷酸系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 VP2基因擴增、測序及同源性分析 PCR擴增12株CPV，電泳結(jié)果出現(xiàn)與預(yù)期1755 bp大小一致的目的條帶。經(jīng)過序列測定，獲得12株CPV的VP2核苷酸序列。12株分離株（SDCP1-12）之間的核苷酸同源率為98.9%～100.0%，氨基酸同源率為98.8%～100.0%；與7株國外參考株CPV-b、CPV-15、V120、CPV-39、Taichung、V139、V203、56/00相比較,核苷酸同源率為98.8%～99.4%，氨基酸同源率為97.9%～100.0%；與疫苗株Vac1的核苷酸同源率為98.6%～99.0%，氨基酸同源率為97.4%～98.5%。表明各分離株與參考毒株同源率較高，差異??；但與疫苗株同源性相對較低，差異大。

2.2 VP2基因中非同義置換的堿基和氨基酸 將分離株核苷酸序列和氨基酸序列與參考毒株對比，與原始的CPV 2a/2b亞型毒株CPV-15/CPV-39相比，第297位氨基酸發(fā)生了Ser→Ala突變，第426位氨基酸發(fā)生了Asn→Asp突變，據(jù)此判定本次分離株SDCP1-4、SDCP6、SDCP9-11為New CPV-2a亞型，SDCP5、SDCP7、SDCP8、SDCP12為New CPV-2b亞型。所有分離株在87位（Met→Leu）、101位（Ile→Thr）、300位（Ala→Gly）、305位（Asp→Tyr）的突變相一致，這4處氨基酸的替換被認為是區(qū)分CPV-2及其變異體的重要依據(jù)[3]。此外，SDCP1第321位氨基酸N→D，497位氨基酸Q→L；SDCP5第167位氨基酸N→K，399位氨基酸T→I，549位氨基酸Q→L；SDCP10第551位氨基酸M→V；SDCP11第136位氨基酸L→M，182位氨基酸T→S；SDCP12第380位氨基酸F→C，這9處氨基酸的替換從未被報道，是本次分離株所特有的氨基酸突變。

2.3 系統(tǒng)進化樹分析 對12個分離株與Gen?Bank發(fā)表的61個國內(nèi)外CPV分離株進行比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖1）。從圖中可以看出，除了SD?CP4和SDCP6外，其余各分離株聚集形成一個大的分支，與我國臺灣地區(qū)、泰國、韓國CPV株關(guān)系較近處于一個分支上，而與意大利、美國和越南株進化關(guān)系較遠。與國內(nèi)毒株相比，8個New CPV-2a亞型毒株與吉林、黑龍江、甘肅、北京等地毒株親緣關(guān)系較近；4個New CPV-2b亞型毒株與廣東、廣西等地毒株親緣關(guān)系較近，這與王凈等[4]研究一致，認為我國長江以北地區(qū)主要以CPV-2a流行為主，而廣東、云南、四川等南方地區(qū)則以CPV-2b流行為主。值得討論的是除了CPV07-04外，其余所有的山東株與本次分離株在拓撲分類上距離較遠?？傮w看來，12個分離株并沒有形成獨立的分支。

3 討論

圖1 73株C PV VP 2基因核苷酸系統(tǒng)進化樹

目前，CPV-2及其抗原變異株在世界范圍內(nèi)廣泛流行，New CPV-2a和New CPV-2b已基本替代了CPV-2a和2b在亞洲主要國家（中國、泰國和韓國）[5]流行，而CPV-2c在歐洲（意大利、德國、西班牙、法國）[6]、北美洲（美國）[7]和南美洲（巴西、阿根廷）[8]的流行比例正逐漸擴大。隨著CPV感染率和致病性持續(xù)升高，廣泛的分子流行病學調(diào)查極為重要。

CPV-2基因變異主要為集中在VP2基因的非同義置換，通過VP2基因定向漂移產(chǎn)生新抗原變異株[9]。本研究12個分離株VP2氨基酸序列共產(chǎn)生18處非同義突變位點，其中第182位氨基酸T→S替換與2012年四川分離株YAZA4相一致[10]；第267位氨基酸F→Y替換并沒有展示在犬細小病毒的衣殼表面，此位點氨基酸改變可能不會影響病毒的抗原性[11]；第321位N→D和324位Y→I替換在空間位置上恰好臨近323位，先前研究表明，93位（Lys→Asn）和323位（Asp→Asn）突變，使CPV獲得結(jié)合犬細胞表面TfR的能力[12]，因此，321和324位氨基酸的突變可能引起CPV宿主范圍的改變；第380位和399位氨基酸位于350-400位B細胞抗原表位區(qū)內(nèi)，其親水性和抗原指數(shù)較高，是蛋白潛在跨膜區(qū)[13]，此處氨基酸的突變可能會影響病毒的抗原性；第440位Y→I替換在多個國家和地區(qū)已有報道，該位點處于三重纖突的頂端，是強陽性選擇位點[14]，此處氨基酸的改變可能促使新型變異株的出現(xiàn)；第136位氨基酸L→M，167位氨基酸N→K，497位氨基酸Q→L，549位氨基酸Q→L，551位氨基酸M→V，這5處突變均未見報道，這種變化是否會引起表型或生物學改變，有待進一步驗證和研究。

進化分析顯示，本次分離株與2005-2008年山東分離株進化關(guān)系較遠，與2009年之后的分離到的各亞型毒株（泰國，中國臺灣地區(qū)，吉林，黑龍江，甘肅，廣東，廣西等地）親緣關(guān)系較近，我們認為造成兩者差異的原因有兩個：一是CPV高的突變速率和持續(xù)的選擇壓力迫使新分離毒株產(chǎn)生了不同的遺傳變異；二是山東沿海和國內(nèi)外貿(mào)易及人員來往密切，有將國外毒株帶到國內(nèi)的可能。然而，具體的進化機制和演變過程還需要進一步研究。本研究對2013年分離到的12株CPV流行毒株進行了VP2基因克隆與遺傳變異分析，8株為New CPV-2a亞型，4株為New CPV-2b亞型，與國內(nèi)外參考毒株核苷酸和氨基酸同源率在98%以上，且分離株VP2基因及其推導(dǎo)的氨基酸的變異主要以點突變?yōu)橹?，關(guān)鍵氨基酸位點未見明顯改變。

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