高 巖，楚世峰，陳乃宏,3*（.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心藥物研究所，北京 00050；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 40007；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 4008）

·補(bǔ)益藥研究·

人參皂苷Rg1通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體相關(guān)NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用抵抗酒精性肝炎研究

高 巖1，楚世峰2，陳乃宏1,3*
（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心藥物研究所，北京 100050；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410007；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的人參皂苷Rg1是人參提取物中最具藥理活性的皂苷之一。基于實(shí)驗(yàn)室前期研究及對(duì)肝炎的認(rèn)識(shí)，本實(shí)驗(yàn)的目的在于研究Rg1在酒精誘導(dǎo)的小鼠肝炎模型中是否發(fā)揮抗炎作用，并探討其可能機(jī)制。方法口服給予C57BL/6小鼠6 g/kg酒精，1 h后給予Rg1（10，20或40 mg/kg）或者陽(yáng)性對(duì)照地塞米松（1 mg/kg）連續(xù)9 d。對(duì)血清進(jìn)行生化分析、肝組織染色觀察、免疫組化以及WB蛋白檢測(cè)。結(jié)果與模型組比較，發(fā)現(xiàn)Rg1顯著提高小鼠的生存率并降低異常升高的血清生化指標(biāo) （P＜0.05）。病理和超顯微結(jié)構(gòu)表明酒精性肝損傷后肝組織病變情況，而Rg1反轉(zhuǎn)其病變。過(guò)度產(chǎn)生的炎癥因子包括TNF-α、IL-1β及IL-6亦被Rg1抑制。Rg1通過(guò)影響糖皮質(zhì)激素受體調(diào)節(jié)NF-κB使肝臟恢復(fù)到正常情況。結(jié)論Rg1可能發(fā)揮配體作用促進(jìn)糖皮質(zhì)激素受體調(diào)節(jié)NF-κB進(jìn)而對(duì)抗酒精性肝炎。

人參皂苷Rg1;酒精性肝炎;抗炎作用;糖皮質(zhì)激素受體;NF-κB

酒精性肝炎(Alcoholic liver disease,ALD)在世界范圍內(nèi)均是一種高發(fā)病率和死亡率的疾病誘因[1]，而酒精性肝炎的誘因包括肝性脂質(zhì)變性，進(jìn)程性的肝纖維化，肝硬化到肝細(xì)胞癌[2]。每年全球?yàn)E用酒精引發(fā)約330萬(wàn)人死亡，大約5.1%的全球負(fù)擔(dān)來(lái)自酒精濫用[3]。酒精性肝炎的進(jìn)程與多因素相關(guān)，包括基因遺傳、營(yíng)養(yǎng)以及環(huán)境因素等。

肝臟是主要的代謝器官，有毒化學(xué)物質(zhì)乃至藥物都可以誘發(fā)肝損傷[4]。酒精誘發(fā)的肝臟損傷主要包括直接對(duì)肝細(xì)胞的損害及代謝產(chǎn)物毒性，氧化應(yīng)激則是其中的主要原因，誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。甾類激素能阻止肝臟炎癥反應(yīng)。在嚴(yán)重肝炎情況下，激素可以提高短期生存率[5]。糖皮質(zhì)激素是抗炎常用藥，可以抵抗炎癥，免疫反應(yīng)和活化轉(zhuǎn)錄因子等[6]。糖皮質(zhì)激素可以與其受體結(jié)合，激活后可以入核，激活或者抑制下游相關(guān)的基因表達(dá)。糖皮質(zhì)激素主要通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB來(lái)發(fā)揮抗炎作用[7]。激素具有有效的抗炎作用，但是長(zhǎng)期使用可能會(huì)誘發(fā)嚴(yán)重副反應(yīng)，甚至導(dǎo)致炎癥積聚。大量和長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素會(huì)導(dǎo)致水鹽平衡失調(diào)。激素對(duì)一些嚴(yán)重肝炎患者甚至無(wú)效[5]。

人參是一種運(yùn)用廣泛的藥用植物，可以發(fā)揮很好的生化和藥理學(xué)作用[8]。人參皂苷Rg1是一種活性較強(qiáng)的皂苷，具有很好的補(bǔ)益作用提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)的學(xué)習(xí)能力和記憶力[9]。除了在神經(jīng)藥理學(xué)方面的應(yīng)用外，Rg1在肝病保護(hù)中也發(fā)揮了獨(dú)特的作用：包括脂多糖/氨基半乳糖，四氯化碳及缺血等實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚10-14]。在此次實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)Rg1抑制了NF-κB的作用，而這種作用與糖皮質(zhì)激素有著密切的關(guān)系，特別是Rg1通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體發(fā)揮抗炎作用時(shí)并未產(chǎn)生相應(yīng)的副作用。所有結(jié)果證明Rg1可以作為潛在的臨床用藥對(duì)抗酒精性肝炎。

1 材料

1.1 藥品及試劑

Rg1購(gòu)自云南極粹生物科技有限公司；酒精購(gòu)自紅星酒廠；陽(yáng)性對(duì)照藥地塞米松購(gòu)自Adamas-beta公司；米非司酮（RU486）購(gòu)自紫竹藥業(yè)；抗體購(gòu)自Santa Cruz或Sigma公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性C57BL/6小鼠購(gòu)自維通利華有限公司，SPF級(jí)，體質(zhì)量18-22 g。常規(guī)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與保護(hù)的有關(guān)規(guī)則。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

小鼠隨機(jī)分為7組，提前給予RU486，Rg1或地塞米松3 d。組別：空白對(duì)照組，模型組(6 g/kg)，RU486組(20 mg/kg)，地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組(1 mg/ kg)，Rg1組(40 mg/kg)，地塞米松&模型組，Rg1&模型組。

2.2 模型制備

小鼠適應(yīng)性伺養(yǎng)7 d，飲食飲水自理。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，首先給予Rg1,RU486地塞米松3 d，劑呈同上。之后給予除空白對(duì)照組以外各組灌胃酒精 （6 g/ kg），1 h前灌胃給予Rg1（10，20或40 mg/kg）地塞陽(yáng)性對(duì)照組地塞米松（1 mg/kg）連續(xù)9 d實(shí)驗(yàn)期間觀察小鼠體質(zhì)量變化及毛色等改變，記錄小鼠死亡率變化。取材前1 d晚禁食，留取肝組織及血清，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 線粒體電鏡檢測(cè) 取小鼠肝臟組織戊二醛固定，電鏡下觀察小鼠肝臟線粒體受損情況（北京天壇醫(yī)院）。

2.3.2 細(xì)胞因子測(cè)定 通過(guò)合成炎癥因子相關(guān)引物，利用RT-PCR方法觀察Rg1對(duì)抗炎癥因子作用。

2.3.3 肝臟病理學(xué)檢查 取小鼠肝臟組織，4%甲醛固定，常規(guī)病理切片，HE染色，光鏡下觀察。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果依據(jù)數(shù)據(jù)處理軟件Graphpad 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用組間差異顯著性表示。

3 結(jié)果

3.1 Rg1提高肝炎小鼠生存率

如圖1所示，模型組小鼠生存率在第2天由90%降至第9天的10%(P＜0.001)；Rg1各組 (10,20 和 40 mg/kg)生存率分別為 50%，50%和 70% (40 mg/kg,P＜0.05)?？瞻讓?duì)照組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期無(wú)死亡發(fā)生。

3.2 Rg1保護(hù)線粒體超微結(jié)構(gòu)

依據(jù)電鏡結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)模型組與空白對(duì)照組相比具有很大差異。在對(duì)照組中(圖2)，肝細(xì)胞微結(jié)構(gòu)正常；模型組中出現(xiàn)空泡，線粒體嵴結(jié)構(gòu)破壞甚至消失。在給予Rg1之后，超微結(jié)構(gòu)部分恢復(fù)接近空白對(duì)照組。

3.3 Rg1逆轉(zhuǎn)過(guò)度生成的炎癥因子

炎癥因子IL-6與酒精性肝損傷息息相關(guān)。酒精不僅可以活化巨噬細(xì)胞，也可以強(qiáng)烈促進(jìn)炎癥因子的釋放。如圖3所示，與空白對(duì)照組相比，IL-6在模型組中顯著增加，但是Rg1可以緩解這一變化。與IL-6類似，炎癥相關(guān)的TNF-alpha和IL-1beta在RNA水平也有顯著的降低。但是給予RU486后，Rg1的這一緩解作用受到抑制。

圖1 人參皂苷Rg1提高酒精損傷小鼠生存率（n=4）

圖2 人參皂苷Rg1改善小鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)異常變化

圖3 Rg1影響TNF-alpha、IL-1beta和IL-6炎癥因子的表達(dá)（n=4）

3.4 糖皮質(zhì)激素配體Rg1緩解肝病變

通過(guò)HE染色觀察可以發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，酒精模型組有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Rg1&RU486組可見(jiàn)靜脈擴(kuò)張，內(nèi)膜脫落，肝細(xì)胞腫脹、壞死，匯管區(qū)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與超顯微結(jié)果類似，給予Rg1后可以明顯改善嚴(yán)重的肝細(xì)胞壞死情況，而RU486可以抑制Rg1該種保護(hù)作用。如圖4所示。

3.5 Rg1調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素受體及其相關(guān)NF-κB信號(hào)通路

RU486是一種糖皮質(zhì)激素受體抑制劑，阻斷糖皮質(zhì)激素受體入核發(fā)揮作用。根據(jù)WB結(jié)果可知，在病理情況下，Rg1與地塞米松均表現(xiàn)出促進(jìn)糖皮質(zhì)激素入核作用。而這種作用被RU486阻斷，這表明Rg1可能與地塞米松類似是一種糖皮質(zhì)激素配體。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，酒精促進(jìn)NF-κB入核，而NF-κB作用被Rg1阻斷，p-IκB生成減少。同樣Rg1抑制NF-κB入核的作用被RU486阻斷。如圖5所示。

以上結(jié)果提示，Rg1可能通過(guò)促進(jìn)糖皮質(zhì)激素受體及其相關(guān)NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗肝炎作用。Rg1可能是一種糖皮質(zhì)激素受體的配體。

圖4 人參皂苷Rg1對(duì)組織形態(tài)學(xué)影響（H&E染色）

4 討論

作為一種在全世界十分常見(jiàn)的流行公共健康問(wèn)題，酒精性肝損傷導(dǎo)致嚴(yán)重的公眾負(fù)擔(dān)和健康危害[15-17]。在中國(guó)酒精性肝損傷被認(rèn)為是排在病毒性肝炎之后的第二大疾病[18]。酒精誘發(fā)的損傷主要發(fā)生在肝臟，因?yàn)楦渭?xì)胞具有多種調(diào)節(jié)代謝相關(guān)的酶系統(tǒng)，包括乙醇脫氫酶，乙醛脫氫酶以及CYP2E1等。過(guò)度的酒精代謝能損傷糖皮質(zhì)激素受體功能，導(dǎo)致持續(xù)的炎癥反應(yīng)。目前營(yíng)養(yǎng)療法是比較有效治療酒精性肝炎的療法。而激素治療雖然已經(jīng)被使用多年，但是因?yàn)槠溆袊?yán)重的副作用仍然被限制使用。所以尋找到一種臨床使用安全有效的藥物十分必要。

給予Rg1可以有效提高C57BL/6小鼠生存率，逆轉(zhuǎn)血清生化指標(biāo)異常升高。同時(shí)，組織學(xué)病變也被Rg1逆轉(zhuǎn)，抑制炎癥因子的過(guò)度產(chǎn)生。Rg1可能作為糖皮質(zhì)激素受體的配體，促進(jìn)糖皮質(zhì)激素受體入核發(fā)揮抗炎作用，阻止NF-κB活化入核阻止其下游相關(guān)產(chǎn)物表達(dá)。加入RU486后，Rg1及地塞米松調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素受體阻斷NF-κB的作用消失，表明Rg1可能是糖皮質(zhì)激素受體的配體。Rg1不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有很好的藥理學(xué)作用，在對(duì)抗肝臟疾病時(shí)也有顯著療效。盡管我們發(fā)現(xiàn)了Rg1作為潛在抗酒精性肝炎的藥物，但是需要更多的實(shí)驗(yàn)研究Rg1的藥理機(jī)制及潛在風(fēng)險(xiǎn)。

圖5 病理情況下給予人參皂苷Rg1對(duì)肝臟GR及NF-κB的作用（n=4）

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（本文編輯 李 杰）

Anti-inflammatory Function of Ginsenoside Rg1 on Alcoholic Hepatitis through Glucocorticoid Receptor Related Nuclear Factor-kappa B Pathway

GAO Yan1,CHU Shifeng2,CHEN Naihong1,3*
(1.State Key Laboratory of Bioactive Substances and Functions of Natural Medicines,Department of Pharmacology,Institute of Materia Medica,Neuroscience Center,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100050,China;2.Key Laboratory of Diagnostics of Traditional Chinese Medicine,Collaborative Innovation Center of Digital Traditional Chinese Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China; 3.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveGinsenoside Rg1 is one of the most pharmacological active constituents from ginseng extract.Based on prior experimental results and the understanding of alcoholic hepatitis,the major aim of this study is to investigate whether Rg1 is beneficial in a rodent model mimic alcoholic hepatic injury associated with binge drinking and explore the underlying possible mechanisms.MethodsC57BL/6 mice were given oral consumption of 6 g/kg alcohol 1 h after treated with Rg1(10, 20 and 40 mg/kg)or dexamethasone (1 mg/kg)for 9 consecutive days.Blood were performed biochemical analyses and liver fragments were processed for microscopy, immunohistochemistry and western blot analysis.ResultsCompared with the model group,Rg1 treatment significantly reversed the high mortality rate induced by alcohol consumption and also alleviated liver impairment as evidenced by the decrease of serum parameters.Meanwhile,histological and ultrastructural analysis of alcoholic groups showed hepatocellular impairment but restored in Rg1-treated groups.Overproductive inflammatory cytokines including TNF-α,IL-1β and IL-6 were also suppressed by Rg1.Rg1 modulated liver to normal levels by adjusting the glucocorticoid receptor related NF-κB pathwayConclusionThis study demonstrates that Rg1 might promote glucocorticoid receptor mediating the repression of NF-κB and inhibit the inflammatory reactions in alcoholic hepatitis.

ginsenoside Rg1;alcoholic hepatitis;anti-inflammation;glucocorticoid receptor;NF-κB pathway

R285

A

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.12.001

2015-11-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81274122、81373997、81273629、81473570）；國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2012ZX09301002-004、2012ZX09103101-006）；教育部長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃（PCSIRT）（IRT1007）；教育部博士點(diǎn)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（20121106130001）；北京市自然科學(xué)基金（7131013、7142115）；新藥作用機(jī)制研究與藥效評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（BZ0150）。

高 巖，女，在讀博士研究生，研究方向：中藥防治肝病研究。

*陳乃宏，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：chennh@imm.ac.cn。