劉湘丹，徐玉琴，王 珊，童巧珍，周日寶*（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208）

·中藥資源·

適用于基因全長克隆的灰氈毛忍冬不同器官總RNA提取方法篩選

劉湘丹，徐玉琴，王 珊，童巧珍，周日寶*
（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208）

目的獲取灰氈毛忍冬不同器官總RNA的最佳提取方法。方法以灰氈毛忍冬葉、莖、花蕾為材料，分別采用SDS法、Trizol法、改良CTAB法、多糖多酚試劑盒法提取總RNA，比較分析實驗結(jié)果。結(jié)果SDS法不適用于三種器官樣品總RNA的提??；Trizol法僅適用于葉總RNA的提取；改良CTAB法對莖總RNA提取效果最佳；而多糖多酚試劑盒法提取的花蕾總RNA質(zhì)量高、完整性較好，且通過RT-PCR擴(kuò)增能獲得特異性條帶。結(jié)論Trizol法最適于灰氈毛忍冬葉總RNA提?。桓牧糃TAB法最適于莖總RNA提?。欢嗵嵌喾釉噭┖蟹ㄗ钸m于花蕾總RNA提??；3種方法提取出來的總RNA均能滿足灰氈毛忍冬中相關(guān)基因全長克隆及時空表達(dá)分析的要求。

灰氈毛忍冬；基因全長克?。豢俁NA；不同器官；提取方法

對灰氈毛忍冬的研究主要集中在種植、化學(xué)成分、藥理作用、藥材加工種質(zhì)資源等方面[5-6]，其分子生物學(xué)方面的研究甚少，亦未見灰氈毛忍冬葉、莖、花蕾總RNA提取方法的研究。常用的總RNA提取方法有SDS法、Trizol法、CTAB法和試劑盒法。本文采用上述4種方法提取灰氈毛忍冬葉、莖、花蕾總RNA，探索提取灰氈毛忍冬葉、莖、花蕾總RNA的有效方法，為相關(guān)基因的全長克隆及其時空表達(dá)模式分析等試驗提供優(yōu)良材料，為該植物不同部位總RNA提取提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采自湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥植園，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室周日寶教授鑒定，為忍冬科忍冬屬植物灰氈毛忍冬的葉、莖、花蕾。

1.2 試劑與儀器

Trizol提取液（Invitrogen公司）；多糖多酚試劑盒（BioFlus，浙江）；Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；焦碳酸二乙酯 (DEPC)（Invitrogen公司）；瓊脂糖(GENE COMPANYLTD)；DL2,000 DNA Marker(TaKaRa)；6×DNA Loading Buffer（北京索萊寶科技有限公司）；AGL19引物（上海生工）；ddH2O（TIANGEN，北京）；2×Taq PCR MasterMix（TIANGEN，北京）。其他試劑均為分析純。

TGL-18M高速冷凍離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；THA-3560 C高壓滅菌鍋 （造鑫企業(yè)有限公司）；HE-120 Gen多功能水平電泳槽（上海天能科技有限公司）；Tanon-GIS-1 000 B凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Biophotometer 6 131核酸蛋白分析儀（德國eppendorf公司）；WD-9402APCR擴(kuò)增儀（德國eppendorf公司）。

1.3 總RNA提取方法

1.3.1 SDS法 本方法參照王暑輝[7]的SDS法進(jìn)行提取。收集液于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

穿過格斗籠拍攝是一個好主意，使這幅作品看起來尤為別致。網(wǎng)眼的清晰度處理的正合適，透過網(wǎng)眼，畫面正確對焦在了Dylan的臉上?？量痰卣f，如果這幅作品里能同時看到Carys的兩條腿就更完美了。但“不完美”本就是拍攝動態(tài)場景的精髓所在，你幾乎不可能完全掌控所有的元素，只能在機(jī)會出現(xiàn)的時候，盡可能地把握住它。雖然Craig自己還不太滿意，但他已經(jīng)做得很出色了！

1.3.2 Trizol法 分別稱取新鮮葉、莖、花蕾各0.1 g，按Trizol使用說明書進(jìn)行操作，最后得收集液各50 μL，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 改良CTAB法 在孟麗[8]的CTAB提取法上進(jìn)行改良。步驟如下：準(zhǔn)備3個1.5 mL離心管，分別加入 600 μL 2×CTAB提取液 （2%CTAB，2.0 mol/L NaCl，0.25 mol/L EDTA，1.0 mol/L Tris) 和15 μL β-巰基乙醇，65℃水浴15 min；分別稱取新鮮莖、葉、花蕾各0.2 g左右，在液氮中研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移至上述離心管中；室溫12 000 r/min離心10 min，吸取上清液于離心管中，每管中加入等體積三氯甲烷，混合均勻，室溫12 000 r/min離心10 min；吸取上清液于新離心管中，加入1/4體積8 mol/L LiCl，混勻，4℃沉淀過夜；4℃，12 000 r/min離心15 min，收集沉淀，用500 μL SSTE溶液[1.0 mol/L NaCl，0.5% SDS，1.0 mol/L Tris-HCl （pH=8.0），0.25 mol/L EDTA]；溶解沉淀，洗去DNA及其他雜質(zhì)；加入等體積酚/三氯甲烷（1:1），漩渦混勻，1.2萬r/min，4℃離心10 min，再加入等體積酚/三氯甲烷（1:1），漩渦混勻，同樣條件下離心，洗去上清，加入1/10體積3 mol/L NaCl和2倍體積無水乙醇，混勻，-70℃沉淀30 min；4℃，12 000 r/min離心20 min，棄上清液，用200 μL 70%乙醇洗滌沉淀，晾干，溶于50 μL DEPC處理水中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 多糖多酚試劑盒法 分別稱取新鮮葉、莖、花蕾各0.1 g，按Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，得50 μL收集液于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA質(zhì)量檢測

1.4.1 濃度及純度測定 分別取2 μL RNA原液，用DEPC處理水稀釋50倍，用核酸蛋白分析儀測定濃度及OD260/280，OD260/230。高質(zhì)量、無污染的總RNA 其OD260/280應(yīng)為1.8-2.0，OD260/230應(yīng)大于2.0。

1.4.2 完整性檢測 分別取5 μL RNA樣品，加入1 μL上樣緩沖液，在1%的非變性瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳完成后于凝膠成像系統(tǒng)中成像，拍照記錄。

1.4.3 RT-PCR檢測 RT-PCR對RNA、cDNA的純度和完整性都有較高要求，為進(jìn)一步驗證以上方法提取的總RNA的可用性，以提取得到的總RNA為模板，嚴(yán)格按照 TaKaRa PrimeScripttmⅡ 1st Strand cDNA Synthessis Kit試劑盒說明書，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。根據(jù)灰氈毛忍冬高通量測序結(jié)果中AGL19 Unigene序列應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計引物 AGL19-F：5’-ATG GTG AGG GGG AAA ACT CAG-3’；AGL19-R：5’-ACG CCT TTC GGG CAG TCC TAT G-3’ATC進(jìn)行RT-PCR。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：cDNA 1 μL，正向引物和反向引物各 1 μL，ddH2O 9.5 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃ 預(yù)變性 4 min；94℃變性45 s，56℃復(fù)性45 s，72℃延伸60 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min；最后于4℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的非變性瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，檢測目的條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取葉、莖、花蕾總RNA濃度和純度比較

由表1可知，對于葉，Trizol法效果最佳；改良CTAB法則最適于提取莖的總RNA；對于花蕾，因其含有較多的糖、酚等次生代謝物，則多糖多酚試劑盒法效果最佳。以上方法提取的總RNAOD260/280為 1.8-2.0，OD260/230＞2.0， 顯示得到的RNA質(zhì)量較高。其濃度也符合后續(xù)試驗要求。SDS法對三個部位的總 RNA提取效果均較差；觀察其余RNA樣品的OD值，表明也許存在異硫氰酸胍及β-巰基乙醇?xì)埩艋蛘叩鞍踪|(zhì)及糖、酚污染。

表1 不同方法提取葉、莖、花蕾總RNA的濃度和純度比較

2.2 總RNA電泳分析

由圖1可以看出，SDS法提取的葉、莖、花蕾總RNA較差，28S，18S條帶隱約可見，5S條帶明亮，說明RNA降解程度大，且有DNA污染。Trizol法僅現(xiàn)葉的總RNA，其28S,18S條帶清晰，28S的亮度為18S的1.5～2.0倍，5S條帶隱約可見，未見DNA污染，說明此RNA完整性較好。改良CTAB法提取的莖總RNA，28S，18S條帶清晰，5S條帶很淺，說明RNA完整性好且未見DNA污染。多糖多酚試劑盒法提取的花蕾總RNA，28S，18S條帶清晰適中，但有輕微DNA污染；電泳結(jié)果基本與表1相符。

圖1 不同方法提取灰氈毛忍冬葉、莖、花蕾中總RNA電泳圖

2.3 RT-PCR檢測

進(jìn)一步驗證上述方法提取得到的總RNA質(zhì)量，根據(jù)灰氈毛忍冬高通量測序結(jié)果中AGL19 Unigene序列應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計引物進(jìn)行RT-PCR，均可擴(kuò)增得到約640 bp目的條帶。由此說明以上提取的總RNA均能用于后續(xù)實驗。

圖2 灰氈毛忍冬葉、莖、花蕾總RNA RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖

3 討論

目前關(guān)于植物總RNA提取方法的報道已有很多[8-10]，但從不同植物或同一植物的不同品種或同種植物的不同組織器官中提取高質(zhì)量RNA難度迥異，這主要與植物細(xì)胞積累的次生代謝產(chǎn)物密切相關(guān)，如酚類化合物、多糖、次級代謝產(chǎn)物以及降解RNA 的RNase等[11-13]。植物內(nèi)源和外源RNA酶含量豐富，RNA比DNA容易降解，因此RNA的提取條件更為苛刻。在RNA提取的整個過程中，除避免引入雜質(zhì)及細(xì)菌外，還應(yīng)盡量去除細(xì)胞里的多糖、多酚、蛋白質(zhì)及DNA等雜質(zhì)及提取過程中所加入的試劑（β-巰基乙醇等）。

不同種類植物體內(nèi)積累的次生代謝產(chǎn)物及化學(xué)成分各異，沒有一種RNA的提取方法適合于所有植物。加之不同的RNA提取方法亦各有優(yōu)缺點，故應(yīng)對不同物種及不同組織特性的材料進(jìn)行選擇或改良適合的RNA提取方法[14-15]。本研究通過比較四種提取總RNA的方法發(fā)現(xiàn)，對于灰氈毛忍冬的葉、莖、花蕾，SDS法提取的總RNA質(zhì)量差，而應(yīng)用廣泛的Trizol法和改良CTAB法分別對葉、莖能提取出質(zhì)量較好的總RNA，有針對性地對本身富含多糖多酚的花蕾使用多糖多酚試劑盒則能提取出高質(zhì)量總RNA。因此，在進(jìn)行植物樣品總RNA提取前，需先了解樣品所含成分、性質(zhì)，選擇適合的提取方法，提取出高質(zhì)量RNA，為灰氈毛忍冬相關(guān)基因的全長克隆及其時空表達(dá)模式分析提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:30-31.

[2]周江煜，郭 睿，程若敏，等.紅腺忍冬葉有效成分含量動態(tài)積累研究[J].中藥材,2011,34(8)：1 194-1 196.

[3]朱 英，徐之路.紅腺忍冬葉抑菌作用及其與總黃酮、綠原酸含量的相關(guān)性研究[J].中國中醫(yī)藥科技,2014,21(1):39-41.

[4]姚正穎，張衛(wèi)明，孫力軍.不同季節(jié)灰氈毛忍冬莖葉中綠原酸和木犀草苷含量的分析[J].中國野生植物資源,2013,32(6):35-38.

[5]唐麗君，周日寶，劉笑蓉，等.超臨界CO2流體萃取法與水蒸氣蒸餾法提取灰氈毛忍冬中揮發(fā)油的GC-MS比較研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，30（9）：109-113.

[6]謝 誼，劉 浩，楊 瑛，等.湖南產(chǎn)不同種質(zhì)、采收期、加工方法的山銀花質(zhì)量對比研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，33（11）：36-39.

[7]王暑輝，徐 倩，徐 筱，等.富含多糖多酚的側(cè)柏葉片總RNA提取方法[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,34(1):76-80,89.

[8]黃雪梅，張守濤，楊 超，等.玉米花粉總RNA提取方法的比較和分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,4:34-36.

[9]尹 慧，陳 莉，李曉艷，等.百合葉片總RNA提取方法比較及優(yōu)化[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,13(4):41-45.

[10]余發(fā)新，孫小艷，徐立安，等.木本植物根系總RNA提取方法的比較和分析[J].林業(yè)技術(shù)開發(fā),2010,24(4):90-93.

[11]劉 晶，韓 琳，劉忠野，等.幾種玉米葉片總RNA提取方法的比較研究[J].吉林農(nóng)業(yè)，2012(1):26-27.

[12]金麗娜，姜述君，戴凌燕，等.水稻抑制差減雜交技術(shù)中葉片總RNA提取方法的探討[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2009,21(1): 4-7.

[13]謝傳勝，宋國琦，王興軍，等.擬南芥和煙草幼嫩種子RNA 不同提取方法的比較[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2009,25(23):78-81.

[14]孫德權(quán)，郭啟高，胡玉林，等.改良Trizol法提取香蕉葉片總RNA [J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2009，（5）:162-164.

[15]郭秀蓮，張正銀，田 萍，等.杜鵑花葉片總RNA的改良CTAB法提取[J].時珍國醫(yī)國藥,2010,21(1):29-31.

（本文編輯 楊 瑛）

Screening of Total RNA Extraction Methods For Full-length Gene Cloning from Different Organs in Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.

LIU Xiangdan,XU Yuqin,WANG Shan,TONG Qiaozhen,ZHOU Ribao*
(School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo screen of total RNA extraction methods from different organs in Lonicera Macranthoides Hand.-Mazz (L.Macranthoides).MethodsThe total RNA of leaf,stem and flower buds from L.macranthoides,respectively,were isolated by SDS,Trizol,improved CTAB and polysaccharide polyphenols kit methods,and the results were compared.ResultsSDS was not suitable for this experiment;Trizol only could isolate total RNA from its leaf.Improved CTAB was the best way to isolate total RNA from its stem;Polysaccharide polyphenols kit method could isolate total RNA from its flower buds,and obtained specific bands by RT-PCR.ConclusionTrizol can be used to isolate the total RNA from leaf of L.macranthoides. Improved CTAB was the best method to isolate the total RNA from its stem;Polysaccharide polyphenols kit method could be used to isolate the total RNA from its flower buds.The total RNA by the three methods could meet the request of fulllength gene cloning and temporal and spatial expression analysis.

Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.;full-length gene cloning;total RNA;different organs;extraction method

R284.1

B

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.12.017

2015－08-12

國家自然科學(xué)基金（81203007）；湖南省自然科學(xué)基金（13JJ9010）；湖南省教育廳科技創(chuàng)新平臺（14K071）；湖南省“中藥學(xué)”重點學(xué)科建設(shè)項目資助（湘教通[2011]76號）；國家中醫(yī)藥管理局“藥用植物學(xué)”重點學(xué)科資助（國中醫(yī)藥發(fā)[2009]30號）；中藥學(xué)湖南省重點學(xué)科開放基金（zy201403）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)青苗計劃。

劉湘丹，女，博士，講師，研究方向：中藥資源與質(zhì)量。

*周日寶，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zhouribao20032003@aliyun.com。