稅迎春，夏欣一，章 瓊，張 承，吳元赭

·論 著·

四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠二肽基肽酶4活性變化

稅迎春1，夏欣一2，章 瓊1，張 承1，吳元赭1

目的 觀察四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠體內(nèi)二肽基肽酶4（DPP4）酶活性變化。方法 建立四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠模型，檢測(cè)大鼠血漿及部分組織中DPP4酶活性變化，同時(shí)檢測(cè)血漿總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、胰島素和活性胰高血糖素樣肽?1（GLP?1）水平變化。結(jié)果 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠糖耐量和胰島素耐量顯著異常。血漿、肺、肝和回腸DPP4活性顯著升高，其吸光度值分別由（0．10±0．01）、（0．16±0．02）、（0．15±0．01）和（0．17±0．01）升高到（0．20±0．04）、（0．18± 0．03）、（0．19±0．02）和（0．19±0．02）。血漿胰島素和活性GLP?1水平顯著降低，分別由（1．22±0．41）ng／L和（3．11±1．20）pmol／L下降到（0．71±0．31）ng／L（P＜0．01）和（2．03±0．93）pmol／L（P＜0．05），而血漿TC和TG水平顯著升高，分別由（3．23± 0．62）mmol／L和（1．01±0．10）mmol／L升高到（5．32±1．41）mmol／L（P＜0．01）和（1．83±0．41）mmol／L（P＜0．01）。結(jié)論 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠糖耐量和胰島素耐量顯著異常，血脂升高，胰島素降低，血漿及部分組織DPP4酶活性升高，從而導(dǎo)致血漿活性GLP?1水平下降。

四氧嘧啶；糖尿病妊娠大鼠；二肽基肽酶4；活性GLP?1；胰島素

二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）是目前糖尿病藥物開(kāi)發(fā)中最熱門的靶點(diǎn)之一，目前已有多個(gè)DPP4抑制劑上市，用于糖尿病的治療，效果十分顯著。四氧嘧啶（alloxan，ALX）糖尿病大鼠模型是目前糖尿病研究中廣泛應(yīng)用的動(dòng)物模型之一，對(duì)此模型的特征及其發(fā)病機(jī)制也已有許多研究報(bào)道。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有關(guān)于四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠體內(nèi)DPP4酶活性的研究報(bào)道。本研究觀察四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠體內(nèi)DPP4酶活性變化情況，以進(jìn)一步了解四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠的生物學(xué)特征。

1 材料與方法

1.1 試劑 四氧嘧啶、甘氨酸對(duì)硝基苯胺（gly?Pro?p?nitroanilide）和Hepes緩沖液購(gòu)自Sigma公司。血糖、三酰甘油（triglycerides，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度膽固醇（high?density lipo?protein cholesterol，HDL?C）、低密度膽固醇（low den?sity lipoprotein cholesterol，LDL?C）和糖化血紅蛋白（haemoglobin A1C，HbA1c）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。大鼠超敏胰島素ELISA試劑盒為ALPCO公司產(chǎn)品?；钚訥LP?1（glucagon like peptide?1）ELISA試劑盒購(gòu)自Millipore公司。葡萄糖等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 μ?Quant酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio?Tek公司產(chǎn)品，3?18k離心機(jī)為德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)WISTAR大鼠，體重250g左右，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)為SCXK（京）2002?0003。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠模型建立 WISTAR大鼠28只，禁食（不禁水）12 h后，按70 mg／kg體重尾靜脈注射四氧嘧啶，6 d后測(cè)空腹血糖，以血糖值14～ 26 mmol／L為糖尿病大鼠。

1.4.2 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT） 動(dòng)物禁食4 h后，進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)［1］。測(cè)定空腹血糖（0 min）及葡萄糖（2．0 g／kg）負(fù)荷后30、60和120 min時(shí)的血糖值，并計(jì)算血糖曲線下面積（AUC）。

1.4.3 胰島素耐量試驗(yàn)（insulin tolerance test，ITT） 進(jìn)行OGTT 1周后，動(dòng)物禁食4 h，皮下注射常規(guī)胰島素溶液（0．4 U／kg）［1］。于注射前（0 min）和注射后40、90 min采血樣，測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)的血糖值，并計(jì)算血糖曲線下面積（AUC）。

1.4.4 血漿DPP4活性測(cè)定 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠禁食4 h，尾尖采血樣，室溫放置30 min后，6000×g離心1 min。反應(yīng)底物甘氨酸對(duì)硝基苯胺工作液用Hepes緩沖液（pH 7．05）配制，濃度為0．30 mmol／L。取10 μL血漿，加入40 μL底物工作液和50 μL Tris／HCl緩沖液（pH 8．0）。在37℃條件下，檢測(cè)反應(yīng)60 min內(nèi)波長(zhǎng)405 nm吸光度值的變化［2］。

1.4.5 組織DPP4酶活性測(cè)定 －80℃保存的組織樣品于冰上融化。稱取0．1 g組織，加于500 μl Tris／HCl緩沖液（pH 8．0）中剪碎，200 w，10 s／次，2次，超聲粉碎。然后于4℃，12 000×g離心10 min。取上清，再于12 000×g離心20 min。獲取上清用于測(cè)定。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其蛋白濃度。選擇Tris／HCl緩沖液（pH 8．0）稀釋上清，使各樣品蛋白濃度一致。取10 μL稀釋上清，加入40 μL底物工作液（濃度為0．30 mmol／L）和50 μL Tris／HCl緩沖液（pH 8．0）。在37℃條件下檢測(cè)反應(yīng)60 min內(nèi) 405 nm處吸光度的變化［2］。

1.4.6 血漿TC、TG、胰島素和活性GLP?1水平測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，采用多因素方差分析方法分析，以P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠OGTT變化 與正常對(duì)照大鼠相比，四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠空腹血糖值（0 min）顯著升高，升高達(dá)283．4%（P＜0．01）。口服糖負(fù)荷后，30、60和120 min血糖值也顯著升高（P＜0．01），且OGTT曲線下面積（AUC）也顯著升高（P＜0．01）。表明四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠糖耐量顯著異常。

2.2 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠ITT變化 正常大鼠皮下注射胰島素后，血糖下降十分顯著，并且血糖恢復(fù)也比較迅速，而四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠皮下注射胰島素后，血糖變化并不顯著，提示四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠胰島素耐量顯著異常。

表1 四氧嘧啶（ALX）糖尿病妊娠大鼠OGTT結(jié)果

表2 四氧嘧啶（ALX）糖尿病妊娠大鼠ITT結(jié)果

2.3 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血漿及部分組織DPP4活性變化 與正常大鼠相比，四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血漿DPP4活性顯著升高，升高達(dá)100．0%（P＜0．01），同時(shí)四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠肺、肝和回腸組織中DPP4活性也顯著升高，分別升高了12．5%（P＜0．05）、26．7%（P＜0．01）和11．7%（P＜0．05）。

表3 四氧嘧啶（ALX）糖尿病妊娠大鼠血漿及部分組織DPP4活性變化（吸光度值）

2.4 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血漿胰島素、活性GLP?1、TC和TG水平變化 與正常大鼠相比，四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血漿胰島素和活性GLP?1水平顯著降低，分別下降了41．8%（P＜0．01）和34．7%（P＜0．05），而TC和TG水平顯著升高，分別升高了64．7%（P＜0．01）和81．2%（P＜0．01）。但HDL?C、LDL?C和HbA1c水平無(wú)明顯變化。

表4 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血漿胰島素、活性GLP?1、TC和TG水平變化

3 討 論

四氧嘧啶是胰島β細(xì)胞毒劑，通過(guò)產(chǎn)生H2O2等超氧自由基，選擇性不可逆地破壞胰島β細(xì)胞，作用迅速而強(qiáng)烈，使胰島分泌功能喪失，造成內(nèi)分泌功能紊亂，糖、脂肪、蛋白質(zhì)等的代謝失調(diào)，從而導(dǎo)致負(fù)氮平衡，使機(jī)體消瘦而體重下降，甚至引起動(dòng)物死亡［3］。由四氧嘧啶誘導(dǎo)的動(dòng)物糖尿病模型與人類1型即胰島素依賴性糖尿病類似。四氧嘧啶價(jià)格低廉，造模成功率高，死亡率低，模型穩(wěn)定，因此四氧嘧啶誘導(dǎo)的動(dòng)物糖尿病模型在抗糖尿病及降血脂藥物研發(fā)中應(yīng)用十分廣泛。

DPP4是多功能的以同源二聚體形式存在的高特異性絲氨酸蛋白酶，廣泛分布于肝、腎、腸、脾臟、腎上腺等組織中，存在于許多類型細(xì)胞表面，包括淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等。DPP4可以以膜結(jié)合型和可溶型2種形式存在，膜結(jié)合型DPP4被酶切后，即變?yōu)榭扇苄托问竭M(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。DPP4可以剪切N端的第二位為丙氨酸或脯氨酸的多肽，體內(nèi)很多活性多肽，如神經(jīng)肽、趨化因子、細(xì)胞因子等都是DPP4的底物［4］。

腸促胰島素在糖尿病發(fā)生發(fā)展中起重要作用。GLP?1為20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)的腸促胰島素，攝食后由腸道L細(xì)胞分泌。GLP?1的主要作用包括刺激胰島素生物合成和葡萄糖誘發(fā)的胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，提高β細(xì)胞對(duì)血糖的反應(yīng)，促進(jìn)β細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，延緩胃排空和減少肝糖輸出等。研究表明GLP?1對(duì)妊娠期糖尿病患者的血糖和胰島功能有改善作用［5?6］，但GLP?1極易被DPP4降解而失活，體內(nèi)半衰期僅有2 min左右［7?8］。因此研究者試圖直接補(bǔ)充或通過(guò)抑制DPP4活性來(lái)間接提高血液中GLP?1的量來(lái)治療糖尿?。??8］。

有關(guān)動(dòng)物模型中DPP4活性的研究并不多。鏈脲菌素（Streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的C57糖尿病大鼠、高脂加STZ共同誘導(dǎo)的WISTAR糖尿病大鼠、高脂或高果糖喂養(yǎng)的F334／Jcl大鼠的血漿DPP4活性均顯著升高［9?11］。高脂和STZ聯(lián)合誘導(dǎo)的SD糖尿病大鼠以及長(zhǎng)期高脂喂養(yǎng)的SD大鼠的腸、肝臟和腎臟組織DPP4活性和表達(dá)均顯著升高［12］。谷氨酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠的空腹血糖正常，但血清、肝臟和回腸DPP4酶活性及含量均顯著升高。有研究表明2型糖尿病患者體內(nèi)DPP4活性顯著升高［13］，但是也有研究顯示2型糖尿病患者體內(nèi)DPP4活性是降低的［14?15］。有研究指出高血糖并不是引起DPP4活性升高的誘發(fā)因素，糖耐量異常和胰島素抵抗才可能對(duì)DPP4酶活性升高起重要作用［16?19］。

本研究發(fā)現(xiàn)，和正常大鼠相比，四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠脂質(zhì)代謝、糖耐量和胰島素耐量顯著異常，空腹血糖顯著升高，表現(xiàn)出顯著的1型糖尿病特征。四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血漿DPP4活性顯著升高，同時(shí)肺臟、肝臟和回腸中DPP4活性也顯著升高。由于四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠DPP4活性升高，導(dǎo)致血漿中活性GLP?1降解加速，血漿中活性GLP?1濃度下降，進(jìn)一步導(dǎo)致胰島素分泌減少，血漿中胰島素濃度下降，更進(jìn)一步加重了大鼠糖尿病癥狀。本研究結(jié)果提示，四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血漿及部分組織DPP4活性顯著升高，血漿活性GLP?1及胰島素水平顯著下降。該結(jié)果為探討妊娠糖尿病的致病機(jī)制提供了試驗(yàn)依據(jù)。下一步我們將對(duì)四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠DPP4活性顯著升高的可能機(jī)制進(jìn)行研究與探討，以豐富四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠的生物學(xué)特征。

［1］ 劉率男，劉 泉，孫素娟，等．二甲雙胍對(duì)2型糖尿病KKAy小鼠胰島β細(xì)胞功能的影響及初步作用機(jī)制探討［J］．藥學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49（11）∶1554?1562．

［2］ 程俊霖，劉江慧，胡云芳，等．DPPⅣ抑制劑對(duì)2型糖尿病的Ⅰ期臨床研究［J］．東南國(guó)防醫(yī)藥，2014，16（6）∶592?596．

［3］ 徐淑云，卞如濂，陳 修．藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］．3版．北京∶人民衛(wèi)生出版社，2002∶1006?1007．

［4］ De MI，Korom S，Van DJ，et al．CD26，let it cut or cut it down［J］．Immunol Today，1999，20（8）∶367?375．

［5］ 楊 露，成 瑋，丁長(zhǎng)花，等．谷氨酰胺降低2型糖尿病患者血糖的機(jī)制探討［J］．東南國(guó)防醫(yī)藥，2015，17（2）∶127?129．

［6］ 師俊梅．妊娠期糖尿病患者的血糖控制效果對(duì)妊娠結(jié)局的影響［J］．東南國(guó)防醫(yī)藥，2015，17（1）∶40?42．

［7］ Abd A，Tahrani MK，Piya AH，et al．Saxagliptin∶a new DPP?4 inhibitor for the treatment of type 2 diabetes mellitus［J］．Adv T?her，2009，26（3）∶249?262．

［8］ Argyrakopoulou G，Doupis J．DPP4 inhibitors∶from Sitagliptin monotherapytothenewAlogliptin?Pioglitazonecombination therapy［J］．Adv Ther，2009，26（3）∶272?280．

［9］ Kim SJ，Nian C，Doudet DJ，et al．Inhibition of dipeptidyl pepti?dase IV with sitagliptin（MK0431）prolongs islet graft survival in streptozotocin?induced diabetic mice［J］．Diabetes，2008，57（5）∶1331?1339．

［10］Furuta Y，Horiguchi M，Sugaru E，et al．Chronic administration of DSP?7238，a novel，potent，specific and substrate?selective DPP IV inhibitor，improves glycaemic control and beta?cell damage in diabetic mice［J］．Diabetes Obes Metab，2010，12（5）∶421?430．

［11］Yasushi K，Takayuki K，Youichi S．et al．Increased plasma dipepti?dyl peptidase IV（DPP IV）activity and decreased DPP IV activity of visceral but not subcutaneous adipose tissue in impaired glucose tolerance rats induced by high?Fat or high?sucrose diet［J］．Biol Pharm Bull，2009，32（3）∶463?467．

［12］Jian Y，Campitelli J，Gang H，et al．Increase in DPP?IV in the intestine，liver and kidney of the rat treated with high fat diet and streptozotocin［J］．Life Sci，2007，81（4）∶272?279．

［13］Mannucci E，Pala L，Ciani S，et al．Hyperglycaemia increases dipeptidyl peptidase IV activity in diabetes mellitus［J］．Diabetolo?gia，2005，48（6）∶1168?1172．

［14］McKillop AM，Duffy NA，Lindsay JR，et al．Decreased dipeptidyl peptidase?IV activity and glucagon?like peptide?1（7?36）amide degradation in type 2 diabetic subjects［J］．Diabetes Res Clin Pract，2008，79（1）∶79?85．

［15］Meneilly GS，Demuth HU，McIntosh CS，et al．Effect of ageing and diabetes on glucose?dependent insulinotropic polypeptide and dipeptidyl peptidase IV responses to oral glucose［J］．Diabet Med，2000，17（5）∶346?350．

［16］Stefanovic V，Antic S，Mitic?Zlatkovic M，et al．Reversal of in?creased lymphocyte PC?1 activity in patients with type 2 diabetes treated with metformin［J］．Diabetes Metab Res Rev，1999，15（6）∶400?404．

［17］Marguet D，Baggio I，Kobayashi T，et al．Enhanced insulin secre?tion and improved glucose tolerance in mice lacking CD26［J］．Proc Natl Acad Sci，2000，97（12）∶6874?6879．

［18］李益明．DPP?4抑制劑的獨(dú)特作用機(jī)制∶胰島α、β細(xì)胞雙調(diào)節(jié)作用［J］．臨床與藥物，2014，11（7）∶21?23．

［19］郭 銜，王 翼，龍兆豐．口服降糖藥二肽基肽酶Ⅳ（DPP?4）抑制劑的多器官保護(hù)作用［J］．藥學(xué)與臨床研究，2014，22（6）∶524?526．

Changes of DPP4 enzyme activity in alloxan?induced diabetic pregnant rat

SHUI Ying?chun1，XIA Xin?yi2，ZHANG Qiong1，ZHANG Cheng1，WU Yuan?zhe1． 1．Department of Gynaecology，2．The People's Lib?eration Army Inspection Institute for Medical Research Nanjing，Nanjing General Hospital of Nanjing Mlitary Region，Nanjing，Jiangsu 210002，China

Objective To study changes of DPP4 enzyme activity in alloxan induced diabetic pregnant rat．Methods Dia?betic rat were induced by alloxan，DPP4 enzyme activities of plasma and some tissues were determined．At the same time，the plasma insulin，TG，TC and active GLP?1 levels were also determined．Results There were obvious impaired glucose tolerance and insulin tolerance in alloxan induced diabetic pregnant rat．In alloxan induced diabetic pregnant rat，DPP4 enzyme activities of the plasma，lung，liver and ileum increased from（0．10±0．01），（0．16±0．02），（0．15±0．01）and（0．17±0．01）to（0．20±0．04），（0．18±0．03），（0．19±0．02）and（0．19±0．02），respectively．At the same time，plasma insulin and active GLP?1 levels declined from（1．22±0．41）ng／L and（3．11±1．20）pmol／L to（0．71±0．31，P＜0．01）ng／L and（2．03±0．93，P＜0．05）pmol／L respectively，but plasma TC and TG increased from（3．23±0．62）mmol／L and（1．01±0．10）mmol／L to（5．32±1．41，P＜0．01）mmol／L and（1．83±0．41，P＜0．01）mmol／L respectively．Conclusion In alloxan induced diabetic pregnant rat，glucose tolerance and insulin tolerance were abnormal sig?nificantly，accompanied with hyperlipidemia and hypoinsulinemia．DPP4 enzyme activities of the plasma and some tissues increased，then caused plasma active GLP?1 level decreased significantly．The results of the study can provide the experimental basis for the patho?genic mechanism of gestational diabetes mellitus research．

alloxan；diabetic pregnant rat；DPP4；active GLP?1；insulin

R587．1

A

10．3969／j．issn．1672?271X．2015．06．003

∶2015?08?19；

∶2015?08?27）

江蘇省科技廳省級(jí)條件建設(shè)與民生科技專項(xiàng)基金（BM2013058）

210002江蘇南京，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，1．婦產(chǎn)科，2．全軍檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所

吳元赭，E?mail∶Wuzhe860103＠sina．com

（本文編輯∶齊 名； 英文編輯∶王建東）