戴皇冠，郝翠芳，黃鑫，劉振騰，連花瑜，劉暢

（1.山東青島大學(xué)，青島 266071；2.山東省煙臺市毓璜頂醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，煙臺 264000；3.山東大學(xué)，濟南 250000）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種天然存在的功能性氨基酸，是谷氨酸在谷氨酸脫羧酶的作用下脫羧而成，是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。GABA 主要通過與其受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。GABA 受體根據(jù)其不同的藥理學(xué)特征區(qū)分為GABAA、GABAB、GABAC三種亞型，其中GABAA受體及GABAC受體屬配體門控型離子通道，目前所識別出的組成GABAA受體亞基種類有7 個亞基族16 種單體（α1-6、β1-3、γ1-3、δ、ε、θ、π）［1］。GABAB受體為G 蛋白偶聯(lián)受體。GABAA受體及GABAB受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，GABAC受體主要存在于視網(wǎng)膜和視覺通路中。有研究發(fā)現(xiàn)，GABA 及其A 型受體也廣泛存在于外周神經(jīng)組織及非神經(jīng)組織中，如：腦垂體、胰腺、腎上腺、睪丸、卵巢、子宮和胎盤等［2］。有關(guān)GABA及其A 型受體在生殖系統(tǒng)中的作用，已有研究表明GABA 信號在女性生殖過程中發(fā)揮著特異性作用，既參與調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育過程中雌孕激素的分泌，也參與卵泡發(fā)育和成熟。早期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠發(fā)情周期不同階段的生殖器官中存在GABA［3-4］。Erd?等［5］將［3H］muscimol（蠅 覃 醇，GABAA受 體 激 動劑）作為放射性配體，發(fā)現(xiàn)在大鼠卵巢上存在GABAA結(jié)合位點，尤其是在顆粒細胞上富含高親和力的、特異的GABAA結(jié)合位點。人的卵巢上也存在GABA 及A 型受體結(jié)合位點［5］。

上述研究提示，GABA 及其A 型受體可能與生殖內(nèi)分泌之間有著密切聯(lián)系。近年來，通過基因微陣列技術(shù)研究人卵丘顆粒細胞，發(fā)現(xiàn)其A 型受體α5亞單位的基因表達水平與卵母細胞核成熟有關(guān)［6-7］。本文研究了GABA 及其A 型受體α5亞單位在小鼠卵巢卵丘顆粒細胞中的表達情況，旨在探討其與卵泡發(fā)育及卵母細胞成熟的相關(guān)性，以期為研究卵母細胞成熟和卵泡發(fā)育的分子生物學(xué)機制提供新的認(rèn)識。

材料與方法

一、實驗材料

孕馬血清促性腺激素（PMSG，Prospec-tany，以色列）；人絨毛膜促性腺激素（HCG，麗珠制藥）；RNA 提取采用Qiagen Rneasy Mini Kit（Qiagen，Hilden，德國）；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒（TaKaRa，日本）；兔源性抗GABRA5 多克隆抗體（Abcam，英國）；熒光（IgG-Cy3）標(biāo)記二抗和兔源性抗GABA 多克隆抗體（武漢博士德公司）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、SP免疫組化試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）；Western blotting相關(guān)試劑（碧云天公司）。

二、研究方法

1.卵丘顆粒細胞提取：（1）生發(fā)泡期（GV）卵丘顆粒細胞的收集：將20～21 日齡，體質(zhì)量約13～15g的性成熟前雌性昆明小鼠飼養(yǎng)于光照（6：00～18：00）及溫度（25 ℃）條件下，動物正常進食及自由飲水。小鼠經(jīng)腹腔注射PMSG（10 U／只），48h后斷頸處死小鼠，無菌操作下取出小鼠雙側(cè)卵巢，在解剖顯微鏡下，去除周圍脂肪組織，培養(yǎng)液洗凈卵巢上血污，置于培養(yǎng)液中，用無菌4號半針頭針刺卵巢讓其釋放出GV 期卵泡，然后用吸管反復(fù)機械吹打卵泡，使卵丘顆粒細胞與卵母細胞分離，收集GV 期卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞，1 000r／min 離心5min，棄上清，備用。在培養(yǎng)液中加入200μmol／L的異丁基甲基黃嘌嶺（IBMX，Cayman，美國）防止GV 期卵泡自發(fā)成熟。

2.MⅡ卵丘顆粒細胞的收集：小鼠經(jīng)腹腔注射PMSG（10U／只），48h后注射HCG（10U／只），注射HCG 后12～13h挑破輸卵管膨大的壺腹部，將釋出的MⅡ期卵泡移入含有0.1%的透明質(zhì)酸酶的培養(yǎng)液中，室溫放置10 min，用吸管反復(fù)機械吹打卵泡使卵母細胞和卵丘顆粒細胞充分分離，收集卵丘顆粒細胞，1 000r／min離心5min，棄上清，備用。

3.實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測：（1）RNA 提取和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：分別將收集的300個GV 期及MⅡ期卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞置于含裂解液的離心管中，總RNA 抽提方法按照Rneasy Mini Kit（Qiagen，德國）說明書描述進行。逆 轉(zhuǎn) 錄 反 應(yīng) 參 照PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa，日本）操作說明書進行，對照實驗用DEPC水取代逆轉(zhuǎn)錄酶，以排除DNA 污染。（2）根據(jù)Genebank 進行引物設(shè)計和合成（表1）。（3）qRT-PCR：依照SYBR Premix Ex Taq 實時熒光定量試劑盒（TaKaRa，日本）說明書進行，使用Rotor Gene 3000型實時熒光定量聚合酶反應(yīng)儀（Corbett Research，澳大利亞）測定。循環(huán)參數(shù)：95 ℃30s，95 ℃5s45個循環(huán)，60 ℃60s。每次反應(yīng)結(jié)束均進行熔解曲線分析，并計算GABRA5與β-actin的相對關(guān)系。運算分析最終所得2-ΔΔCT值［8］。

表1 qRT-PCR引物序列

4.Western blotting檢測：實驗簡述如下：用蛋白裂解液裂解收集的300個GV 期和MⅡ期卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞，冰上靜置30min后在4 ℃下離心5 min。用BCA 法測蛋白濃度。每孔上樣100μg，進行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，7%TBST 脫脂奶粉室溫封閉2h，一抗（兔源性抗GABRA5多克隆抗體）4 ℃孵育過夜，加入羊抗兔二抗，室溫孵育1h，化學(xué)發(fā)光液顯色。以GAPDH 為內(nèi)參，采用Bio-Rad圖像分析儀（伯樂，美國）分析。

5.免疫組織熒光檢測：獲取GV 期卵巢和MⅡ期輸卵管組織，4%多聚甲醛4℃固定過夜，常規(guī)石蠟包埋，切成4μm 切片。按組織免疫熒光常規(guī)步驟操作。一抗1∶100稀釋，陰性對照采用正常兔血清IgG 代替一抗。激光共聚焦顯微鏡掃描成像。

6.免疫組織化學(xué)檢測：免疫組化方法簡述如下，石蠟切片常規(guī)脫水，檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)，H2O2去離子水孵育，山羊血清室溫封閉，加入兔源性抗GABA 多克隆抗體（1∶100），4℃孵育過夜，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育。DAB顯色，充分沖洗后蘇木素復(fù)染、酒精逆濃度脫水、二甲苯透明、干燥后中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果判定：細胞質(zhì)內(nèi)含棕黃色顆粒者為陽性細胞，用PBS代替一抗作為陰性對照，其余步驟與上述相同。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用Student’s t-檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、qRT-PCR 檢測GABRA5mRNA 在GV 期和MⅡ期卵丘顆粒細胞中表達

GV 期和MⅡ期卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞中均有GABRA5 mRNA 的表達，相對于GV 期的表達水平，GABRA5 mRNA 在MⅡ期卵母細胞周圍卵丘顆粒細胞的表達是上調(diào)的，GV 組∶MⅡ組為（1.00±0.00）vs.（2.32±0.30），即MⅡ期表達量約是GV 期的2.32倍，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）（圖1）。

二、Western blotting 檢 測GABRA5 蛋 白 在GV 期和MⅡ期卵丘顆粒細胞中表達

GABRA5蛋白在GV 期和MⅡ期卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞中均有表達，其表達量隨卵母細胞成熟而呈上升趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）（圖2、3）。

圖1 GABRA5mRNA 在GV 期和MⅡ期卵丘顆粒細胞中的表達

圖2 Western blotting檢測GV 期和MⅡ期卵丘顆粒細胞中GABRA5蛋白的表達

圖3 GV 期和MⅡ期卵丘顆粒細胞中GABRA5蛋白相對表達量的比較

三、組織免疫熒光技術(shù)檢測GABRA5 蛋白在GV 期和MⅡ期卵丘顆粒細胞中表達

激光共聚焦結(jié)果顯示，GABRA5 蛋白表達于GV 期和MⅡ期卵母細胞周圍卵丘顆粒細胞的細胞膜、細胞質(zhì)，激發(fā)出紅色熒光，藍色為PI染核；陰性對照未見陽性表達（圖4）。

四、免疫組織化學(xué)定性檢測GABA 在GV 期和MⅡ期卵丘顆粒細胞中表達

免疫組化顯示，GABA 均定位于GV 期和MⅡ期卵母細胞周圍卵丘顆粒細胞的胞質(zhì)中（圖5）。

圖4 GABRA5在GV 期和MⅡ期卵丘顆粒細胞中表達情況。免疫熒光染色法×400

圖5 GABA 在GV 期和MⅡ期卵丘顆粒細胞中表達情況。免疫組化染色法×400

討 論

卵母細胞和卵丘顆粒細胞之間存在雙向交流。卵母細胞在卵丘顆粒細胞的分化和發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，同時卵丘顆粒細胞在卵母細胞發(fā)育和成熟過程中起著重要的營養(yǎng)作用及信號傳導(dǎo)作用，因而卵丘顆粒細胞的基因表達和功能狀態(tài)在一定程度上可以反映卵母細胞的發(fā)育能力［9-10］。研究卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞基因表達改變，為分析卵母細胞的質(zhì)量提供有價值的信息，也可用于評估卵母細胞發(fā)育的狀態(tài)和微環(huán)境［11］。

本研究對性成熟前小鼠給予外源性激素人工誘導(dǎo)卵泡發(fā)育及卵母細胞成熟，利用qRT-PCR 檢測GV 期和MⅡ期卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞中GABRA5 mRNA 的表達情況，發(fā)現(xiàn)GABRA5 mRNA表達水平存在上調(diào)趨勢，其與卵母細胞成熟度呈正相關(guān)，表明卵母細胞成熟與GABRA5 基因的表達量升高有關(guān)。但Devjak等［7］通過基因微陣列技術(shù)研究人卵丘顆粒細胞，發(fā)現(xiàn)GABRA5 基因在卵丘顆粒細胞中的表達量與卵母細胞成熟度呈負(fù)相關(guān)，即其在MⅠ期卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞的表達量高于其在MⅡ期卵母細胞時卵丘顆粒細胞 中 表 達 量。另 外，Huang 等［6］對GABRA5 基 因在多囊卵巢綜合征患者卵母細胞成熟過程中的表達進行了研究，GABRA5基因在GV 期和MⅠ期卵母細胞時卵丘顆粒細胞的表達水平高于其在MⅡ期卵母細胞周圍卵丘顆粒細胞中的表達水平，即在人卵母細胞成熟過程中表達量逐漸減少。兩位學(xué)者的研究結(jié)果表明人卵母細胞成熟與GABRA5基因的表達量下降有關(guān)。本實驗結(jié)果與上述研究結(jié)論不一致，推測其原因，可能是研究對象的種屬差異所致。

根據(jù)Western blotting和組織免疫熒光研究結(jié)果顯示，GABRA5蛋白在GV 期和MⅡ期卵母細胞周圍卵丘顆粒細胞上均存在表達，且受體表達量隨卵母細胞成熟而增高，進一步推測GABRA5 可能在卵泡發(fā)育成熟過程中發(fā)揮調(diào)控作用。Amenta等［12］利用組 織 放 射 自 顯 影 技 術(shù)，將［3H］muscimol作為放射性配體，發(fā)現(xiàn)在豬的卵泡上A 型受體有可逆、可飽和、高親和力的特性，并且A 型受體在卵泡發(fā)育過程中是逐漸減少的。由于A 型受體亞基較多，并且A 型受體各亞基之間可有不同的組合方式，但不是所有的亞基都能彼此間有效地組裝成功能性受體［13］。到目前為止，A 型受體參與卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟方面的分子機制仍然不清，所以尚需進一步的研究和證實。

本實驗利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測GABA 在小鼠卵巢卵丘顆粒細胞上的表達情況，顯示GABA在GV 期和MⅡ期卵母細胞周圍卵丘顆粒細胞的胞質(zhì)中均存在表達。Louzan等［3］也發(fā)現(xiàn)在鼠發(fā)情周期的不同階段中，卵巢中可檢測到GABA 的存在。此外，Batta［14］觀察到外源性的GABA 能增加大鼠排卵釋放的卵母細胞數(shù)目，并能影響這些釋放的卵母細胞的質(zhì)量。同時，有學(xué)者通過電生理技術(shù)研究人和小鼠的卵母細胞胞膜，發(fā)現(xiàn)GABA 能增加GV 和MⅡ卵母細胞胞膜的傳導(dǎo)性和敏感性，且Bicuculline（GABAA受體拮抗劑）能降低胞膜對GABA 的 反應(yīng)性［15］。劉 曉 艷 等［16］用 放 射 免 疫 測 定方法證實了人卵泡液中存在GABA，并且成熟卵泡液中的濃度高于未成熟卵泡液中的濃度。這些研究結(jié)果進一步提示GABA 有可能通過與其受體結(jié)合參與卵泡發(fā)育和成熟的過程。

此外，GABA 及其受體也在精子頂體反應(yīng)和獲能中起著重要調(diào)節(jié)作用［17］。體內(nèi)多種遞質(zhì)如GABA、孕酮、透明帶（ZP）作用于GABA 受體產(chǎn)生生理效應(yīng)。而目前關(guān)于GABA 及其受體報道較多的是在腫瘤發(fā)生發(fā)展方面的研究，如乳腺癌［18］，前列腺 癌［19］等。Sengupta等［20］報 道GABRA5 參 與神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生，認(rèn)為GABRA5 通過誘導(dǎo)細胞周期S期和G2期細胞凋亡而參與神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。但關(guān)于GABA 信號參與卵泡發(fā)育和成熟的分子機制及信號通路的報道甚少，其潛在價值仍待進一步研究。

總之，GABA 及其受體在生殖活動和生殖疾病中的影響正日益受到重視。GABA 及其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，推測GABA 也可能通過與其A 型受體結(jié)合參與小鼠卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟過程。希望通過本實驗，為研究神經(jīng)遞質(zhì)及相關(guān)受體在生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)中的作用提供新的數(shù)據(jù)。

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