陳莉，路娟，房碧晗，宗傳杰，陳曦

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京100193；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；3.佳木斯大學(xué)，黑龍江佳木斯154007）

HPLC法測(cè)定多產(chǎn)地松露中游離氨基酸的含量

陳莉1，2，路娟1，*，房碧晗1，3，宗傳杰1，2，陳曦1，*

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京100193；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；3.佳木斯大學(xué)，黑龍江佳木斯154007）

建立柱前衍生化HPLC法定量測(cè)定8個(gè)產(chǎn)地松露中16種游離氨基酸。采用水超聲法提取松露中氨基酸，以異硫氰酸苯酯作為衍生化試劑柱前衍生，高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地松露中氨基酸的含量。8個(gè)產(chǎn)地的松露鮮品中含氨基酸約11種～13種，永仁母松露的氨基酸最高，含量6.17%。本方法簡(jiǎn)便、快速、可靠。松露中氨基酸種類(lèi)齊全，含量豐富，具有很好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

松露；游離氨基酸；反相高效液相色潽法；柱前衍生化；異硫氰酸苯酯；含量測(cè)定

松露又稱塊菌、無(wú)娘果、豬拱菌等，是子囊菌亞門(mén)，塊菌目（tuberales）塊菌屬（tuber）的真菌。子實(shí)體在土壤中生長(zhǎng)并成熟，是與樹(shù)木共生的外生菌根型藥食兩用真菌。產(chǎn)地狹窄，80%以上分布于歐洲地區(qū)，近年來(lái)我國(guó)也有發(fā)現(xiàn)，尚未進(jìn)行人工栽培。松露中含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、維生素和微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分[1-7]，本實(shí)驗(yàn)用柱前衍生化HPLC法對(duì)8個(gè)產(chǎn)地的新鮮松露中游離氨基酸進(jìn)行測(cè)定，為松露的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

waters UPLC H-Class系統(tǒng)（含四元溶劑泵，自動(dòng)進(jìn)樣裝置，在線真空脫氣裝置，PDA檢測(cè)器，Empower2色譜工作站），AB265-S十萬(wàn)分之一天平（瑞士METTLER公司），KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），優(yōu)普超純水機(jī)（UPW-Ⅱ-60Z，成都超純科技有限公司）。

1.2 試藥

松露樣品由北京上尚品生物科技有限公司提供；絲氨酸（批號(hào)121109）、甘氨酸（121024）、組氨酸（121022）、精氨酸（121102）、蘇氨酸（121126）、脯氨酸（121031）、丙氨酸（121105）、酪氨酸（121201）、纈氨酸（121125）、蛋氨酸（121112）、胱氨酸（121107）、異亮氨酸（121013）、亮氨酸（120929）、苯丙氨酸（120922）、色氨酸（121027）、賴氨酸（121126）對(duì)照品均購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，純度≥98%；乙腈為色譜純；水為超純水，自制；異硫氰酸苯酯、鹽酸、乙酸、醋酸鈉為分析純。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC figure

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C1（8250×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：醋酸鈉15 g，加超純水1 700 mL溶解，用乙酸調(diào)pH 6.5，加水至1 850 mL，加乙腈140 mL，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。流動(dòng)相B：80%乙腈水。梯度：0～18 min，A（100%～91%）；18.01 min～50 min，A（80%～67%）；52 min～60 min，A（0%）；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫：室溫。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品貯備液的制備

分別精密稱取16種氨基酸對(duì)照品15 mg，置于25 mL容量瓶中，胱氨酸用1 mol/L HCl溶解，其他氨基酸用水溶解并稀釋至刻度。

2.2.2 供試品溶液的制備

取8個(gè)產(chǎn)地的松露鮮粉，精密稱取1.0g，置具塞錐形瓶中，精密加入25mL蒸餾水，稱定，超聲提取30min，放冷，用水補(bǔ)足重量，搖勻，離心，取上清液待用。

2.2.3 衍生化試劑的配制

1.0 mol/L三乙胺乙腈溶液：移取三乙胺13.5 mL，置100 mL容量瓶中，加乙腈稀釋并定容至刻度，搖勻即得。

0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液：移取異硫氰酸苯酯1.2 mL，置100 mL容量瓶中，加乙腈稀釋并定容至刻度，搖勻即得。

2.3 衍生化

[8-9]的方法，取上述對(duì)照品或供試品溶液200 μL，加入0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，1.0 mol/L三乙胺乙腈溶液100 μL，搖勻，放置1 h，加入正己烷400 μL，搖勻，放置10 min，吸取下層溶液。

2.4 方法學(xué)指標(biāo)考察

2.4.1 線性范圍

取上述各對(duì)照品貯備液適量，置10 mL容量瓶中，水稀釋并定容，按上述方法進(jìn)行柱前衍生化，配成6個(gè)不同的濃度，進(jìn)樣5 μL，以16種氨基酸的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程和線性范圍具體見(jiàn)表1。

表1 16種氨基酸的回歸方程和線性范圍（n=6）Table 1The regression equations and linear ranges of 16 kinds ofamino acids（n=6）

續(xù)表1 16種氨基酸的回歸方程和線性范圍（n=6）Continue table 1The regression equations and linear ranges of 16 kinds of amino acids（n=6）

從表1的結(jié)果來(lái)看，絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸等16種氨基酸分別在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn)

精密移取各對(duì)照品貯備液200 μL，經(jīng)衍生化后進(jìn)樣5 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定各氨基酸的峰面積。結(jié)果顯示：18種氨基酸對(duì)應(yīng)的峰面積RSD在0.87%～1.83%之間，儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取文山黑松露樣品6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，經(jīng)衍生化后測(cè)定游離氨基酸的峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果表明：13種氨基酸的含量的RSD在1.66%～2.89%，方法重現(xiàn)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取文山供試品溶液衍生化后，24 h內(nèi)每3個(gè)小時(shí)進(jìn)樣一次，結(jié)果13重氨基酸的含量的RSD在0.74%～2.55%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 回收率試驗(yàn)

取已知氨基酸含量的文山松露樣品6份，分別加入適量的蘇氨酸、纈氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、甘氨酸，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，衍生化后測(cè)其峰面積并計(jì)算，結(jié)果樣品中蘇氨酸、纈氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、甘氨酸的平均回收率為98.75%、100.23%、99.31%、98.26%、99.43%、100.02%，RSD分別為1.02%、0.89%、1.53%、1.45%、0.73%、0.94%。

2.5 樣品測(cè)定

取8個(gè)產(chǎn)地松露樣品，按上述2.2.2項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)下衍生化后，測(cè)定各樣品中各游離氨基酸的峰面積，由外標(biāo)法計(jì)算各氨基酸的含量。結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 8個(gè)產(chǎn)地松露中氨基酸含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 2The contents of amino acids in 8 origin truffles（n=3）

從表2可以看出，本法共檢出文山、永富產(chǎn)黑松露12種氨基酸，其中含7種必需氨基酸；從西昌、保山、貢山黑松露和文山白松露中均檢出11種氨基酸，其中保山含7種必需氨基酸，其他產(chǎn)地6種必需氨基酸；平川黑松露和永仁母松露中共檢出13種氨基酸，其中均含7種必需氨基酸；從氨基酸總量來(lái)看，黑松露屬貢山產(chǎn)量最高，占5.38%，文山白松露優(yōu)于其他產(chǎn)地黑松露，其中，永仁產(chǎn)母松s露質(zhì)量最優(yōu)，氨基酸總量達(dá)6.17%。采用本衍生化法同時(shí)測(cè)定了7個(gè)產(chǎn)地、3個(gè)品種的松露氨基酸種類(lèi)及含量，在食品保健品的研究道路上具有新的開(kāi)發(fā)意義。

3 討論

1）提取方法選擇：本實(shí)驗(yàn)采用了水加熱回流和超聲提取法提取松露中的游離氨基酸，經(jīng)衍生化進(jìn)液相分析，超聲提取得到的氨基酸含量較大，可能原因是松露樣品本身對(duì)熱不穩(wěn)定，容易變質(zhì)，加熱提取對(duì)松露質(zhì)量有損。所以本實(shí)驗(yàn)選用超聲提取，時(shí)間30 min，操作簡(jiǎn)便，提取效率高。

2）目前氨基酸柱前衍生化試劑主要有鄰苯二甲醛、異硫氰酸苯酯等。本試驗(yàn)采用異硫氰酸苯酯與氨基酸反應(yīng)，生成單一、穩(wěn)定的苯氨基硫甲酰衍生物，于254 nm波長(zhǎng)處紫外檢測(cè)，得到的色譜峰峰型較好，分離度好，靈敏度高。

3）本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，松露鮮品中含豐富的氨基酸，達(dá)11種～13種，其中含人體不能合成的非必需氨基酸6種～7種，占氨基酸總數(shù)的54%～64%。其中，不同產(chǎn)地的松露質(zhì)量差異較大，文山和永富的松露非必需氨基酸含量較高，具有較高的醫(yī)藥用價(jià)值；就總氨基酸而言，永仁庫(kù)的母松露含量最高，占6.17%。這些數(shù)據(jù)為松露的質(zhì)量控制提供了依據(jù)，相信在不久的將來(lái)，松露這一藥食兩用菌很快會(huì)實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用。

參考文獻(xiàn)：

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詳見(jiàn)中國(guó)天津食品網(wǎng)

（www.tjfood.com.cn）

Determination of Free Amino Acids in Multi-origin Truffles by HPLC

CHEN Li1，2，LU Juan1，*，F(xiàn)ANG Bi-han1，3，ZONG Chuan-jie1，2，CHEN Xi1，*
（1.Chinese Academy of Medical Sciences Institute of Medicinal Plant Development，Beijing 100193，China 2.College of Pharmacy，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，Heilongjiang，China；3.Jia Mu Si University，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China）

To establish a pre-column derivatization HPLC method to determine 16 kinds of amino acids in eight origin truffles.The amino acids in truffles were ultrasonically extracted with water and determined by high performance liquid chromatography using phenyl isothiocyanate as pre-column derivatization reagent.The eight -origin fresh truffles contain 11-13 kinds of amino acids，yongren mother truffles show highest content of 6.17%. The method is simple，fast，and reliable.Truffles content rich amino acids，which have a good development and utilization value.

truffle；free amino acids；RP-HPLC；pre-column derivatization；phenylisothiocyanate；determination

2013-08-29

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.026

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81173645）

陳莉（1988—），女（漢），碩士研究生，研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

*通信作者：路娟（1981—），女，助研，研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

陳曦（1973—），男，副研究員，研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立及血清藥物化學(xué)。